- Resumen
- Justificación y
antecedentes - Metodología
- Determinación de la
DL50 - Análisis de
resultados - Conclusiones
- Bibliografía
- Anexos
A continuación se realiza un análisis de los procedimientos
empleados para determinar la DL50 en un bioensayo a través
del método de
Probit, se comparan dichos procedimientos,
se dan pautas para la implementación de uno de ellos y se
citan los pasos para determinar la DL50 de un extracto vegetal y
del ácido piroleñoso utilizando la Artemia salina
como sujeto de prueba.
PALABRAS CLAVES
Bioactividad, bioensayo, dosis letal media (DL50),
análisis cuantal, estadística cuantal, Probit, Artemia
Salina, fitoquímica, ácido piroleñoso,
tóxicos.
ABSTRACT
In this work an analysis of the procedures used to
determine the DL50 in a bioassay through the method of Probit is
carried out, these procedures are compared, rules for the
implementation of one of them are given; also, the steps to
determine the DL50 of a vegetable extract and the pyroligneous
acid using the Artemia salina as subject of test are
cited.
KEYWORDS
Bioactivity, bioassay, Median Lethal Dose (LD50),
Artemia Salina, analysis quantal, statistical quantal, Probit,
phytochemistry, pyroligneous acid, toxics.
En términos generales un bioensayo puede ser
definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos, a
su vez se puede señalar como cualquier método por
medio del cual alguna propiedad de
una sustancia o material, es medida en términos de la
respuesta biológica que produce (1). Los datos obtenidos
de un bioensayo no pueden ser analizados con la metodología estadística tradicional que se usa en los
ensayos de
campo sino que se debe utilizar lo que se llama
estadística cuantal, la cual se caracteriza por la
respuesta a un estimulo de n unidades experimentales, donde r
unidades responden y n – r no lo hacen. El principal objetivo de
este tipo de análisis es evaluar el nivel de estimulo que
es necesario para obtener una respuesta en un grupo de
individuos de la población. El nivel de estimulo que causa
una respuesta en el 50% de los individuos de una población bajo estudio es un importante
parámetro de caracterización denotado como DL50 por
dosis letal media (o DE50 por dosis efectiva media, CL50 por
concentración letal media, CE50 por concentración
efectiva media y Ltm por límite de tolerancia
media). El periodo de tiempo durante el
cual se expone el estimulo debe ser especificado, por ejemplo, 24
horas DL50, esto con el fin comparar y estimar la potencia relativa
del estimulo (2).
La determinación de la DL50, se utiliza para
encontrar umbrales de toxicidad para determinadas sustancias; en
el desarrollo de
pesticidas se utiliza para determinar los límites de
resistencia de
insectos, por ejemplo, ante ciertos biocidas (3). En la investigación fitoquímica
valiéndose del principio de que farmacología es
simplemente toxicología a bajas concentraciones o
toxicología es farmacología a concentraciones altas
se puede correlacionar la bioactividad con el valor de la
DL50 y al mismo tiempo su grado
de toxicidad.
La determinación de la DL50 requiere de la
estadística cuantal, para lo cual es necesario transformar
los valores de
respuesta obtenidos en unidades Anglit, Logit o Probit y las
dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas
como dosis metamétricas. Existen algunos programas
especializados que realizan este tipo de cálculos
automáticamente, pero su confiabilidad depende de la
persona o
institución que los haya desarrollado.
Se hace necesaria la comparación de los
procedimientos empleados así como desarrollar medios para su
simplificación.
El objetivo
general de este trabajo es dar las pautas para el desarrollo de
un análisis de bioactividad a través del
método de Probit.
Como organismo de prueba se puede utilizar Artemia
salina, el cual es un pequeño crustáceo de la
subclase de los anostráceos y conforma el plancton de las
aguas continentales salobres de todo el mundo (4, 5, 6, 7). El procedimiento
empleado con este organismo se puede apreciar en el
Anexo 1. La
determinación de bioactividad se realiza a extractos
etanólicos de la planta Cordia spinescens de la familia
Boraginaceae, la cual es utilizada como medicinal en la
región de Córdoba Quindío (8); al ácido
piroleñoso obtenido de guadua y nogal (9, 10), y al cisco de café.
Para la determinación de la DL50 el primer paso
es el conteo de las larvas o nauplios muertos en cada extracto y
cada blanco, se corrigen las mortalidades mediante la formula de
Abbott y paralelamente se utiliza otra corrección que se
basa en el porcentaje de supervivencia de los individuos, esta
corrección es utilizada en algunos procedimientos
encontrados. Las formulas de estas correcciones son las
siguientes:
(Formula de Abbott) (Eq. 1)
Donde:
M = Mortalidad.
me = mortalidad en el extracto.
mb = mortalidad en el blanco.
(Eq. 2) 
(Eq. 3)
r = Nauplios muertos en el extracto.
r' = Nauplios muertos en el blanco.
n = Número de individuos.
Como el número de individuos es constante (10 en
este caso):
(Eq. 4)
La otra corrección utilizada es la
siguiente:
(Eq. 5)
Donde:
S = supervivencia
s' = Nauplios vivos en el blanco
Mortalidad = 1 – Supervivencia (Eq.
6)
Igualando las dos ecuaciones
anteriores:
A continuación se determina la DL50 mediante el
método gráfico de Probit, hallando la mejor
línea Ldp (Línea dosis-Probit), este método
puede presentar variaciones en cuanto a la forma de determinar la
ecuación de la línea Ldp, algunos autores
(11)
encuentran la pendiente de la gráfica (B), obteniendo el
inverso de la desviación estándar de las dosis
metamétricas (1/q ), con este valor y el
LogDL50 hallado en la gráfica para un Probit de 5,
encuentran el valor del termino independiente (A). Este
método es muy aproximado y parte del precepto de que se
puede encontrar la ecuación de la gráfica con la
pendiente esperada (con la desviación estándar del
termino independiente) y el intercepto hallado en X
(Log10DL50) para determinado valor de Y (5 en este
caso). Otros autores (2)
determinan la ecuación de la gráfica Ldp por el
método de los mínimos cuadrados. Para verificar la
linealidad se realiza una prueba mediante el estadístico
de prueba t de Student bilateral (de dos colas) y n-2 grados de
libertad,
utilizando el valor del factor de correlación lineal
(rc), donde la hipótesis nula es que no existe
correlación entre Probit y el Log10
dosis (12). Para ello se
utiliza la siguiente ecuación:
(Eq. 8)
t de Student para un nivel de confianza
del 95% y n-2 grados de libertad
Para probar la adecuación de la gráfica se
realiza el test de bondad de
ajuste mediante el estadístico Ji – cuadrado
(c
2), en este caso la hipótesis nula es
que la línea Ldp es un modelo
adecuado de los datos. Para el
calculo del c
2 se utiliza la mortalidad esperada de las
larvas (P), la cual a su vez se halla con los Probit esperados
los cuales se hallan con la ecuación de la gráfica
Ldp. La ecuación es la siguiente:
c
2 = S
(r – n.P)2 / n.P.(1-P) (Eq. 9)
c
2 para un nivel de confianza del 95% y n-2
grados de libertad
El último paso del método gráfico
consiste en establecer los limites de confianza para la DL50,
para ello se hace uso de los coeficientes de ponderación
(W) para cada Probit, los cuales son hallados en tablas. Las
ecuaciones
necesarias son las siguientes:
Donde:
(Eq. 11)
(Eq. 12)
El intervalo de confianza es entonces representado
como:
LogDL50 ± 1,96. SLogDL50
(Eq. 13)
El valor de 1,96 corresponde a un nivel del 95% de
confianza para una distribución normal. Para realizar estos
cálculos se elaboraron tablas en ExcelÓ que se pueden apreciar en
el anexo 4.
Una vez realizado el método gráfico, se
procede a emplear el método de la máxima
verosimilitud, el cual consiste en la suposición de
normalidad de la población estudiada, con base en esto se
pueden plantear una serie de funciones que
denominan los valores de P
(Probit) y W (coeficiente de ponderación), con los cuales
se pueden hallar los estimativos más próximos
para a y
b (intercepto en las
ordenadas y pendiente), denominados A y B respectivamente, en una
línea recta. Para ello se sigue el procedimiento dado en
el anexo
2.
Es considerable el efecto de
corrección de la mortalidad. En las figuras 1, 2 y 3 puede
observarse la sensibilidad de la formula de Abbott a los efectos
en el blanco, cuando la mortalidad en las dosis es muy
pequeña, lo cual causa perdida de la
linealidad.
En las anteriores figuras la línea continua
corresponde a la gráfica Ldp hallada con la
corrección de Abbott. En la número 1 observamos un
valor de rc2 (coeficiente de
determinación) de 0.677 y para la línea Ldp hallada
con la corrección de "supervivencia", tenemos un
rc2 de 0.9037; esto quiere decir que para
la segunda el 90.37% de los datos se hallan relacionados de forma
significativamente lineal, mientras que con la corrección
de Abbott solo lo están el 67.7% de los valores.
Para la figura 2 observamos que los valores del
coeficiente de determinación para la corrección de
Abbott y la que utiliza el porcentaje de supervivencia son 0.7230
y 0.9469 respectivamente. Para la gráfica de la figura 3
se observan valores de 0.6319 para la corrección de
"supervivencia" y 0.4729 para Abbott. En la figura 4 el valor de
rc2 es muy similar y en 5 y 6 se observa el
efecto contrario, esto debido a la alta mortalidad de los
nauplios con altas dosis de ácido piroleñoso.
También se observa en los diagramas
anteriores como con la corrección de Abbott se obtienen
DL50 mayores, es decir, la otra corrección utilizada
"subdimensiona" los valores de la DL50.
En el método gráfico a pesar de utilizarse
dos procedimientos diferentes para hallar la ecuación de
la gráfica Ldp el valor del LogDL50 es igual, sin embargo,
varían los intervalos de confianza y la prueba de
adecuación del modelo (test
de bondad de ajuste). Para la DL50 de hojas a las 24 horas se
encontró que el modelo resultaba adecuado con un
c 2 de
1.3037 para el método que utiliza el procedimiento de los
mínimos cuadrados para hallar la ecuación de la
gráfica; para la misma determinación el
método que utiliza la suposición de que la
pendiente es igual al inverso de la desviación
estándar de las dosis metamétricas se
encontró un c
2 de 23.35, lo cual lo ubica en la región
de rechazo de la hipótesis nula, por lo cual, según
este resultado, el modelo no es adecuado, ya que las
discrepancias entre los Probits esperados y los obtenidos son
significativas. Igual situación se presentó en la
determinación de la DL50 para hojas y raíz a las 48
horas.
c
2 para un nivel de confianza del 95% y n-2
grados de libertad,
donde se observa el valor
que cae en la región de rechazo y
el que cae en la región de aceptación
El método de la máxima verosimilitud
consiste básicamente en una serie de aproximaciones,
utilizando el método de los mínimos cuadrados, para
encontrar la mejor línea Ldp; una vez hallada se procede a
interpolar el valor de Probit = 5, para hallar el
Log10DL50; la adecuación del modelo
(c 2)
y los intervalos de confianza. Este método mostró
consistencia y reproducibilidad en los resultados además
de ser relativamente sencillo, ya que una vez construida la tabla
de cálculo
solo es necesario introducir los datos. El ajuste de la
línea Ldp puede observarse en las figuras 7, 8, 9, 10, 11
y 12.
Figura 7. Gráfica Ldp, para extracto
de hojas de Cordia spinescens a las 24 horas, utilizando
el método de la máxima verosimilitud
Figura 8.
Gráfica Ldp, para extracto de hojas de Cordia
spinescens a las 48 horas, utilizando el método de la
máxima verosimilitud.
Figura 9. Gráfica Ldp, para extracto de
raíz de Cordia spinescens a las 48 horas,
utilizando el método de la máxima
verosimilitud
Figura 10. Gráfica Ldp, para dosis de
ácido piroleñoso obtenido de cisco de café a
las 24 horas, utilizando el método de la máxima
verosimilitud
Figura 11. Gráfica Ldp, para dosis de
ácido piroleñoso obtenido de nogal a las 24 horas,
utilizando el método de la máxima
verosimilitud
Figura 12. Gráfica Ldp, para dosis de
ácido piroleñoso obtenido de guadua a las 24 horas,
utilizando el método de la máxima
verosimilitud
Se debe ser cuidadoso en la elección de la
corrección de la mortalidad, la más ampliamente
utilizada y citada es la formula de Abbott; la corrección
basada en la supervivencia (Eq.
7), si bien ofrece mayor linealidad cuando la
mortalidad es muy baja, tiende a dar valores más bajos
para la DL50.
El método gráfico presenta dos
procedimientos para encontrar la ecuación de la
gráfica, sin embargo, uno de ellos parte de la
suposición, sin tener en cuenta la verdadera
relación entre las variables para
encontrar la pendiente, por lo cual ésta puede ser
sobredimensionada. Por lo tanto es aconsejable utilizar el
método de los mínimos cuadrados.
El método de la máxima verosimilitud
presenta límites de
confianza más amplios, pero una mayor precisión en
el valor de la DL50, ya que encuentra la gráfica de Probit
más ajustada.
Con la utilización de programas
informáticos como OriginÓ de Microcal™, y
ExcelÓ de
Microsoft™, es posible la
simplificación de las operaciones
matemáticas y realización de
gráficas, mientras se sigue un control preciso
del método empleado.
AGRADECIMIENTOS
A la Sra. Nancy Ayala, funcionaria de la Oficina de
Planeación y Desarrollo de la Universidad del
Quindío, quien logró el contrato
CNR-04-99 entre el Centro de Ciencia y
Tecnología de Antioquia, Universidad del
Quindío, Colciencias y el Laboratorio
Colombiano de Diseño
(Armenia, Quindío) para el proyecto "Apoyo a
la Investigación sobre materias Primas para la
Reactivación Productiva del Sector Artesanal en la Zona
Cafetera" y del cual el subproyecto "Inmunización Natural
para el Bejuco Tripeperro" es el objeto del presente
artículo.
También expresamos nuestros agradecimientos al
profesor Oscar Otalvaro de la Universidad del Quindío por
su orientación en estadística; a Deysi Yined
Zuluaga, Anderson Guarnizo Franco y Cesar Augusto Angulo
Pachón Químicos de la Universidad del
Quindío por su trabajo con la Artemia salina.
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