- Resumen
- Aspectos generales de bacillus
thuringiensis - Mecanismo de acción de
la delta-endotoxina - Aspectos relacionados con la
producción de bth - Referencias
La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth), es un bacilo
gram-positivo que produce durante la esporulación un
cristal de proteína tóxico para insectos plaga
conocido también como delta-endotoxina, el objetivo del
presente trabajo fue realizar una breve revisión sobre
algunos aspectos relacionados con la producción del bioinsecticida a base de
Bth, que involucra el diseño
de medios de
cultivo con materia prima
barata, que aumenten la calidad
tóxica de los cristales y por tanto mejoren la calidad
bioinsecticida para el control de
insectos-plaga.
Palabras clave : Bacillus thuringiensis,
delta-endotoxina, substratos baratos, cristales, toxicidad,
bioensayo.
Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza
constante para la salud y la calidad de
vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la
causa de pérdidas económicas; como en el caso del
tabaco, afectado
mundialmente por el insecto Lasioderma serricorne lo que
disminuye su valor
comercial (Kaelin , et al., l994).Hasta ahora la única
forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la
aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae
en consecuencia problemas
ecológicos; por tanto el uso irracional de los
agroquímicos ha sido causa de contaminación
ambiental, en especial a finales de la segunda guerra
mundial con el surgimiento de plaguicidas de origen
órgano-sintético, que al desequilibrar el balance
ecológico, han disminuido la biodiversidad,
mientras que sus residuos tóxicos han contaminado los
alimentos e
inducido resistencia en
los insectos plaga (Dulmage. et al., l990 ; Karamanlidou, et al.,
l991 y Badii, et al., l996),en la actualidad 500 insectos son
resistentes a uno o mas pesticidas y el numero puede aumentar
notablemente en pocos años (Rowe y Margaritis, 1987
citados por Macías, 1995). Una posible alternativa para
solucionar este problema es el control
biológico, definido como el uso de un organismo natural o
modificado genéticamente y/o sus productos para
reducir los efectos de insectos plaga (Galán et al.,
l996). Ignoffo y Hink , citados por Badii en l996 , reportan la
existencia de más de 1500 especies de microorganismos
entomopatógenos con potencial para el control microbiano
de insectos, en relación a su diversidad se
señalan: hongos, virus,
protozoarios y bacterias , en
donde las últimas son las de mayor importancia. De las
bacterias la
más sobresaliente pertenece al género
Bacillus. Falcón citado por Badii en 1996,
clasificó a las bacterias en dos grupos a) las
esporuladas y b) las no esporuladas. En donde las bacterias
entomotóxicas con mayor potencial para la producción de bioinsecticida es Bacillus
thuringiensis (Bth), la que más se ha explotado
comercialmente, mientras que en segundo lugar se ubica a B.
popillae y más recientemente B. sphaericus y B. morati que
tiene valor
reconocido en el control de plagas urbanas como los mosquitos,
vectores de
paludismo,
dengue, etc.
(Badii, et al., 1996).
ASPECTOS GENERALES
DE Bacillus thuringiensis
La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es un bacilo
gram-positivo, flagelado y esporulado que se caracteriza por la
formación de un cuerpo paraesporal o cristal de
proteína, conocido como delta-endotoxina, estos cristales
se forman durante la esporulación y tienen actividad
tóxica para larvas de insectos (Shieh, l988). A Bth se le
considera cosmopolita, pues sus esporas se han aislado de
suelo
(Meadows, et al., l992) , de larvas de insectos enfermos (Kaelin
P., et al., 1994), de productos
almacenados (Karamanlidou, et al., 1991), y hojas de arboles
(Meadows, et al., 1992; Sanchez-Yáñez y
Peña-Cabriales, 1995), aunque es más frecuente
aislarla de productos almacenados, pues las condiciones
ambientales del almacén
permiten la persistencia de sus esporas (Martinez y
Sánchez- Yáñez,1998) incluyendo la rizosfera
de plantas (Medrano,
et al., 1998).
La delta-endotoxina puede variar en tamaño y en
forma, ya que según la variedad de Bth, pueden producir en
el medio de cultivo más de una forma de cristales ; Kaelin
et al., l994, mencionan que encontraron cristales de formas
romboidal (de proteínas
de 65 kDa), de tipo amorfo entre (130 y 140 kDa) y
heterogéneo (de aproximadamente 63 kDa) y también
de la clase bipiramidal (l30 y 65 kDa ) . Mientras Karamanlidou,
et al., 1991, reportan el aislamiento de cristales irregulares,
cuboidales, bipiramidales y esféricos, aunque Meadows, et
al., 1992, señalan que la forma más común es
la bipiramidal. Mientras que Kaelin, et al., l994, proponen una
forma de clasificación de los cristales más
práctica en base a su espectro de actividad insecticida,
en donde los cristales tipo Cry I son tóxicos
para lepidópteros, los Cry II para
lepidópteros y dípteros, los tipo Cry III para
coleópteros y
los Cry IV para dípteros.
MECANISMO DE
ACCION DE LA DELTA-ENDOTOXINA
Cuando el cristal es ingerido por un insecto susceptible
en fase larvaria llega a su intestino medio, se disuelve por la
acción de los jugos intestinales a pH alcalino,
aquí la delta-endotoxina sufre una proteolisis
enzimática y da origen a la toxina activa, la cual se une
a un receptor específico de las membranas epiteliales de
las células
del intestino, lo que genera poros que desequilibran su balance
osmótico y provocan la lisis celular de esta
parte
del aparato
digestivo, posteriormente causa diarrea y vómitos en el
insecto, lo que puede
provocar eventualmente su muerte por una
deshidratación severa (Hugutte,l989, citado por
Leal 1995; Shieh, 1988).
ASPECTOS RELACIONADOS CON LA
PRODUCCIÓN DE Bth
La selección
de un aislado silvestre de Bth y su capacidad efectiva para
producir cristales tóxicos y posible manipulación
genética
para mejorarla, al igual que sus requerimientos nutricionales,
son aspectos fundamentales en la producción del
bioinsecticida a base de esta bacteria; una etapa clave en el
proceso de
escalonamiento masivo para la producción de la
delta-endotoxina, y su posterior formulación y
aplicación a nivel de campo (Reicheldelfer, 1981). Por lo
que es necesario un diseño
adecuado de un medio de cultivo (o de fermentación) apto para el crecimiento,
esporulación y formación de los cristales de Bth
(Galán, et al., 1996), pues de ello depende la calidad
tóxica del cristal; en ese sentido el medio de fermentación debe contener una fuente de
carbono, de
nitrógeno orgánico y sales minerales que en
balance estimulen el crecimiento, la esporulación y la
producción de cristales altamente tóxicos. En
términos del tipo de constituyentes, la fuente de carbono (C)
orgánica más empleadas son: la glucosa, el
almidón y secarosa, reconocidas como esenciales para la
síntesis de cristales, aunque Couch y Ross
en 1980, al utilizar como fuente de C materias primas baratas,
como productos de maíz
hidrolizado (almidón y dextrinas), al igual que Murga en
1983 jugo de agave y melaza de caña (fructosa), excelentes
resultados sobre la esporulación y calidad tóxica
del cristal. Cabe mencionar que
la melaza de caña se considera una materia prima
adecuada como fuente de C, de bajo costo con efectos
positivos sobre la toxicidad de la delta-endotoxina (Aronson, et
al.,1971). Es claro que la ausencia de una fuente adecuada de C
para Bth, causa una disminución en la producción de
esporas y en la formación y calidad de la
deltaendotoxina.
En el caso de fuentes de
Nitrógeno (N) : Se ha reportado que Bth requiere de
aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de
nitrógeno durante su fase de crecimiento y durante la
esporulación (Galán, et al., 1996), en general en
los medios de
cultivo comerciales se han empleado proteínas
de semilla y/o agua de
cocimiento de maíz,
otras alternativas más baratas han sido obtenidas de
fuentes
naturales como la harina de pescado, de la semilla de
algodón, o de leguminosas como la soya, el garbanzo, la
haba, el cacahuate y las lentejas, o bien de líquido de
remojo de maíz; de residuos de levadura, de sangre de res,
del suero de queso y productos secundarios de la industria
láctea, esta clase de materia prima
estimula la biosíntesis de la delta-endotoxina con alta
actividad insecticida (Couch y Ross, 1980; Salama, et al., 1983).
Para los minerales se ha
señalado al Mn+2, K+1, Ca+2 y Zn+2 como elementos
componentes necesarios en el medio de fermentación para la
producción de la delta-endotoxina (Galán, et al.,
1996). Dulmage (1970), reportó el aislamiento de un Bth
que en un medio que contiene dextrosa, extracto de levadura
K2HPO4 y KH2PO4 presentó los mejores niveles en la
producción de la delta-endotoxina y recomiendò el
uso de substratos baratos como harina de semilla de
algodón y harina de soya; Goldberg (1980) describió
un medio de fermentación con glucosa, peptona de soya,
extracto de levadura y líquido de remojo de maíz y
sales minerales del tipo: KCl, (NH4 )2 SO4 , H PO4 , Mg SO4 ,
CuCl2 , FeSO4, ZnSO4 y MnSO4 , con el que logró un alto
rendimiento en la esporulación y cristales tóxicos
de excelente calidad. Por lo anterior, los medios de cultivo para
Bth deben contener sales minerales para la síntesis
de energía, estimular el crecimiento y la
esporulación, y factores de crecimiento como: extracto de
levadura (como una fuente de vitaminas del
complejo B), pues su omisión retarda la
esporulación y reduce la formación de cristales y
en consecuencia la toxicidad del complejo espora/cristal
(Dulmage, 1981). Goldberg, en 1980, observó un claro
incremento en la producción de esporas al adicionar
extracto de levadura a un medio de cultivo enriquecido
(mencionado anteriormente). Para Bth , la combinación de
factores nutricionales orgánicos e inorgánicos es
esencial en la síntesis de la delta-endotoxina de alta
toxicidad, así que el uso de materiales de
bajo costo como
componentes del medio de cultivo, es básico en la
optimización del proceso de
producción bioinsecticidas a base de Bth. En consecuencia
para el diseño de medios de cultivo o fermentación
sugiere 1) que sus componentes sean fácil de manejar o que
no requieran pretratamiento; 2) que permitan optimizar el
crecimiento de la bacteria sin afectar negativamente la calidad
de la delta-endotoxina; 3) que sean baratos y abundantes
(Dharmsthini, et al., 1985) y 4) y sean de fácil
adquisición en la localidad (Dulmage H.T., l990). Es
importante señalar que una formula basada en la
combinación de nutrientes para una variedad de Bth, no
necesariamente es adecuada para otra variedad, por lo que la
calidad de la delta-endotoxina depende tanto del medio de cultivo
como del aislado de Bth utilizado (Dulmage, 1970). Aunque
obviamente, el diseño del medio y la bacteria no son los
únicos aspectos involucrados en la producción del
bioinsecticida, existen otras variables que
deben considerarse en el proceso de la fermentación como:
la temperatura
óptima de crecimiento de Bth oscila entre los 28 y
32ºC; la cantidad de oxigeno
suministrado a la bacteria, la velocidad de
agitación para asegurar un suministro de oxigeno
adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulación
del calor y evitar
la inhibición o reducción de la calidad
tóxica de los cristales; así como el pH inicial
óptimo de entre 6.8-7.2 (Galán, et al., 1996), ya
que al oxidar los carbohidratos
produce ácidos
orgánicos, lo que se soluciona con neutralización
con álcali (Dulmage, et al., 1990). En síntesis en
la tabla 1 se presentan algunos de los substratos o materias
baratas que se pueden utilizar en la formulación de medios
de cultivo adecuados para la producción de la
delta-endotoxina a base de Bth..
Modificada de Dulmage 1990. *
Probados con excelentes resultados. El resto no lo han
sido o sin resultados aceptables, pero pueden ser
útiles en combinación con otros
substratos.
Hasta ahora se ha abordado el tema de la
fermentación a nivel de laboratorio,
pero para la producción del bioinsecticida a una escala mayor es
necesario un proceso de escalonamiento. El escalonamiento se
define como el conjunto de técnicas y
métodos
empleados para transferir a una escala mayor
(escalamiento ascendente) o menor (escalamiento descendente) un
microorganismo o un producto
biológico como la deltaendotoxina y, determinar su
factibilidad
económica en un proceso industrial. En el
escalamiento se requiere el uso combinado e integrado de
métodos y
principios de
ingeniería química, bioquímica, microbiología y genética (
Blakebrought y Moresi, 1981 ;
Jain y Buckland, 1988). Los estudios de laboratorio y
de planta piloto son útiles para definir las operaciones
unitarias de mayor importancia en el proceso de escalamiento,
como en el caso del bioinsecticida a base de Bth, en donde el
diseño del medio de cultivo es esencial en la
optimización de la producción del complejo
espora-cristal, también es necesario un diseño
experimental a nivel de fermentador, el cual en función de
su capacidad, el equipo instalado y los recursos
disponibles, hará posibles la obtención de
altamente cristales tóxicos de Bth. (Medrano y
Galán, 1996).
En conclusión, la síntesis de
bioinsecticidas a base de Bacillus thuringiensis, es un proceso
que requiere de medios de fermentación o de cultivo
elaborados con materias primas de bajo costo, paro que no afecte
su calidad tóxica; el diseño de un medio de cultivo
para la síntesis de la delta-endotoxina se logra mediante
la combinación inteligente de fuente de carbono,
nitrógeno y minerales, este medio de cultivo no
necesariamente será el mismo para otras variedades o
aislados de la bacteria, pues Bth sintetiza cristales diferentes
en forma, tamaño y toxicidad, en función
del medio de cultivo y la variedad utilizada. La
biotecnología para la producción de
bioinsecticida es una área nueva en nuestro país, y
es lógico esperar que por los problemas
agrícolas y de salud
pública que nos afectan, además del uso
irracional de insecticidas químicos, promueven en el
futuro el uso de estos productos biológicos, pues Bth
tiene ventajas sobre los pesticidas químicos por su
especificidad para actuar sólo sobre especies de insectos
plaga, por su eficacia para
eliminar aquellos insectos que ha desarrollado resistencia a los
insecticidas químicos, y porque es ambientalmente seguro y de un
costo de producción relativamente bajo; siempre y cuando
se integren técnicas
de escalamiento que aseguren una excelente cantidad y calidad de
la delta-endotoxina producida.
A continuación en la Figura 1 se muestra un
diagrama de
flujo para la producción de Bacillus thuringiensis en
un sistema
común.
1.- Aronson A.I. ; Angelo N. y S.C. Holt. 1971.
Regulation of extracellular protease production in Bacillus
cereus T : Characterization of mutants produced altere amounts
of
protease. J. Bacteriol . 106 :
1016-1025.
2.- Badii M.H. ; Flores A.E. ; R. Foreughbakhch ; Quiroz
H. y Torres R. 1996. Ecología
de
manejo integrado de plagas (MIP) con observaciones sobre
control biológico de insectos.
En: Avances recientes en la biotecnología de Bacillus thuringiensis.
Universidad
Autónoma
de Nuevo León, Monterrey, México. Pp
:40-47.
3.- Blakebrought N. y M. Moresi. 1981. Scale-up of whey
fermentation in a pilot-scale fermenter . Eur. J. Appl .
Microbiol. Biotechnol. 12 :173-178.
4.- Couch T.L. y R. Ross. 1980. Production and
utilization of Bacillus thuringiensis.
Biotech. and Bioeng. 22 :1297.
5.- Dharmisthini S.C. ; Patuwatana y Bhumiratana. 1985.
Production of Bacillus
thuringiensis subsp. israelensis and Bacillus sphaericus
strain 1583 on glutamate factory. J.
Invertebr. Phatol. 46:231-238.
6.- Dulmage H.T. 1970. Production of spore-endotoxin
complex by variants so Bacillus thuringiensis in two fermentation
media. J. Invertebr. Phatol. 18: 353-358.
7.-Dulmage H.T. 1981. Production of bacteria for
biological control of insects. In : Biological control of crop
production, G.C. Papavizas . Beltsville Symposia in
Agricultural
Research. Allenhed , Oamun and Co., Totowa. N.J. 5
:129
8.-Dulmage H.T. ; Correa J.A. y Gallegos-Morales G.
1990. Potential for improved formulation of Bacillus
thuringiensis israelensis through standarization and fermentation
development. In : Bacterial control of mosquitoes & black
flies. Edit. Rutgers University
Pries. 110-131.
9.-Galán L.J. ; J.A. García ; Ellis S.M. ;
Quintero Z.I. y H.A. Luna O. 1996. Production of
Bacillus thuringiensis. En : Avances en la
biotegnología de Bacillus thuringiensis. Universidad
Autónoma de Nuevo León, Monterrey, México.
139-152.
10.- J. García Y.;
Sánchez-Yáñez J.M. 1997. Producción
de Bacillus thuringiensis. En el V
simposio de la Investigación y el Desarrollo
Tecnológico en Michoacán. pp. 17. Ciudad
Universitaira de la UMSNH. Morelia, Michoacán.
11.-Goldberg I. ; Sneh B. ; Battat E. y D. Klein. 1980.
Optimization of medium for high
yield production of spore-cristal preparation of
Bacillus thuringiensi. Effective against the
aegyptian cotton leaf worm Spodoptera littoralis Boisd.
Biotechnol. Lett. 2 :419-426.
12.-Guillen R.D.; Sánchez-Yáñez
J.M. 1997. Aislamiento y Persistencia de Esporas de Bacillus
thuringiensis en Granos Almacenados. Tesis de
Maestria. Instituto de Investigaciones
Químico Biológicas/UMSNH. Morelia, Mich.,
México. pp. 19-31.
13.-Jain D. y B.C. Buckland. 1988. Scale-up of the
eritromicyn fermentation using a computer-controlled pilot plant.
Bioprocess Eng. 31 : 31-36.
14.-Kaelin P. ; Morel P. and Gadani F. 1993. Isolation
of Bacillus thuringiensis from tobacco and Lsioderma serricorne
(F). Appl. Environ. Microbiol. 60 :19-25.
15.-Karamanlidou G. ; Lambropoulos A.F. ; Kolais S.I. ;
Manoisis T. ; Ellar D. and
Kastritsis C. 1991. Toxicity of Bacillus thuringiensis
to laboratory populations of the olive fruit fly (Dacus oleae).
Appl. Environ. Microbiol. 57: 2277-2282.
16.-Leal M.C. ; J.M. Sánchez-Yáñez.
1995. Sobrevivencia y actividad de Bacillus thuringiensis var
israelensis en ambientes naturales contra larvas de mosquitos.
Tesis de
Maestría de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo
León. Pp : 7-8 .
17.-Macias L.M. 1995. Bacillus thuringiensis var
israelensis una Alternativa para el control
Biológico de Mosquitos. tesis de Licenciatura.
Laboratorio de Ecología Microbiana
del IIQB. Facultad de Biología/UMSNH.
Ciudad Universitaria Morelia, Mich. pp.13-16.
18.-Martinez M.H.; Sánchez Yáñez
J.M. 1998. Presencia y Sobrevivencia de Bacillus
thuringiensis en Granos de Almacen. Tesis de
Licenciatura de la Facultad de Biología, UMSNH,
Morelia, Mich.,México. pp. 17-25.
19.-Meadows M.P. ; Ellis D.J. ; Jarret P. and Burges
H.D. 1992. Distribution, frecuency and diversity of Bacillus
thuringiensis in an animal feed mill. Appl. Environ. Microbiol.
58 :1344-1350.
20.-Medranao G.M.A.; Luna O.H.A.;
Sánchez-Yáñez J.M. 1999. Sobrevivencia de
Células
Vegetativas de Bacillus thuringiensis en la
Espermósfera/Rizósfera de Frijol (Phaseolus
vulgaris L.). FCB-UANL. Monterrey, Nuevo León,
México. (En prensa).
21.-Medrano H. y Galán L.J. 1996.
Bioingeniería y biotecnología en la producción de
bioinsecticidas. En : Avances recientes en la
biotecnología de Bacillus thuringiensis. Universidad
autónoma de Nuevo León, Monterrey, México.
115-117.
22.-Mendoza M.M.G. 1985. Resistencia a
Antibióticos de Bacillus thuringiensis como Marcadores
Genéticos. tesis de Licensciatura, Facultad de Ciencias
Biológicas, UANL, Monterrey, Nuevo León,
México. pp. 9-11
23.-Murga G.M.A. 1983. Toxicidad de Bacillus
thuringiensis GM-2 en diferentes medios de cultivo. Tesis.
Facultad de Ciencias Biológicas, U.A.N.L., Monterrey,
Nuevo León, México.
24.-Palacios C.L.L.; Galán W.L.; Medrno R.H.
1997. Cinética de una cepa de Bacillus thuringiensis var
aizawai a Escala de Planta Piloto. Ubamari 40:
51-63.
25.-Reicheldelfer K.H. 1981. Economic feasibility of
biological control of crop pests in biological control in crop
production, G.C. Papavizas, Beltsville Simposia in Agricultural
Research, Allanheld, Osmun and Co., Totowa N.J. 5
:403.
26.-Salama H.S. and O.N. Norris. 1993. The use of
Bacillus thuringiensis in developing countries . Chap. 11 In :
Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide : Theory
and
practice. Edited by P.F. Enwistle, J.S. Cory, M.J.
Bailey snd S. Higgs. Jhon Wiley & Sons Ltd. New York,
N.Y.
27.-Sánchez-Yáñez J.M. y
Peña-Cabriales J.J. 1995. Sobrevivencia de Esporas de
Bacillus
thuringiensis En el Filoplano de Maíz, de Frijo y
en el Suelo.
International Microbiol Ecology Meeting. May 1995. México
city.
28.-Shieh T.R. 1988. Biological Insecticide and
Biotechnology. American Chemical Society.
17:207-216.
Se agradece a la cordinación de investigación científica de la
Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo por el apoyo a
este trabajo por medio del proyecto 2.7
"producción de Bacillus thuringiensis".
Jesús García Yañez, estudiante del
noveno semestre de la Escuela de
Quimicofarmacobiología de la U.M.S.N.H., actualmente
realiza su trabajo de tesis de licenciatura en el laboratorio de
Ecología microbiana del IIQB de la U.M.S.N.H. bajo la
asesoría del Dr. Juan Manuel Sánchez
Yáñez.
J. García-Yañez Pasante de la Escuela de
Químicofarmacobiología/UMSNH, Tzintzuntzan y
Acueducto, Morelia, Mich. México
Autor:
Dr. Juan Manuel
Sánchez-Yáñez
Profesor Investigador de tiempo completo
Titular "C". Perfil PROMEP
Laboratorio de Microbiología Ambiental
Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas Edif. B-3
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo,
Morelia, Michoacán, México.