Aclimatización del Marañón

(Anacardium Occidentale
l.)

1. Resumen
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión
5. Referencias

RESUMEN

Con el propósito de garantizar alta
supervivencia durante la transición de plantas de
marañón cultivadas in vitro a condiciones
semicontroladas, se desarrolló el proceso de
aclimatización. Este se sustentó en mantener alta
humedad relativa, al inicio, mediante dos tipos de cámara
húmeda; posteriormente, fue regulándose hasta
igualarse a la existente en condiciones naturales. Se evaluaron
variables que
definieron el crecimiento, desarrollo y
la aptitud de las plantas para ser establecidas en el campo. La
observación estomática
resultó ser un indicador valioso para saber que las
plantas se habian adaptado a las nuevas condiciones de cultivo.
Se alcanzó un 87% de supervivencia, lo que demostró
la efectividad de la aclimatización, sobre todo en una
especie con extrema sensibilidad a que se le dañe el
sistema radical
durante su manipulación.

Palabras clave:
Marañón, Anacardium occidentale,
Aclimtatización, Cámara húmeda.

ABSTRACT

With the purpose of guaranteeing high survival during
the transition of cashew plants cultivated in vitro to greenhouse
conditions, the acclimatization process was developed. It was
sustained in maintaining high relative humidity, at the
beginning, by means of two types of humid camera; later on, it
was being regulated until being equaled to the existent one under
natural conditions. Variables evaluated that defined the growth
were evaluated, development and aptitude of the plants to be
established in the field. The stomata observation turned out to
be a valuable indicator to know that the plants had been adapted
to the new cultivation conditions. Around 87% of survival was
reached, it showed the effectiveness of the acclimatization,
mainly in a species with extreme sensibility to damaged the
radical system during its handling.

Keys words: Cashew, Anacardium
occidentale, Acclimatization, Humid camera.

INTRODUCCION

El marañón (Anacardium
occidentale L.) es un frutal tropical de la familia
anacardiácea, originario de la región norte de
Brasil, y
encuentra en Cuba
envidiables condiciones edafoclimáticas para su
crecimiento y desarrollo: incluidos abundantes suelos
empobrecidos y semiáridos, donde prácticamente no
sobrevive otro frutal y, sin embargo, son los preferidos por
A. occidentale (Aguilera et al., 2001). No
obstante, encabeza la lista de especies frutales tropicales
arbóreas amenazados desde hace más de 15
años en nuestro país (Anderez, 1984), y se
necesitan tomar medidas urgentes de conservación y manejo
de los genotipos silvestres que habitan en los campos y sabanas;
los cuales están dispersos y se encuentran cercanos al
declive fisiológico.

Uno de los problemas que
afecta la propagación sexual del marañón es
el aborto de
embriones; lo cual es causado por el incompleto desarrollo de los
mismos, mutaciones en estructuras
que cubren al embrión o un tipo recalcitrante de dormancia
(Nambiar y Thankamma, 1980). Ellis et al. (1985)
clasifican al marañón como especie ortodoxa y
señalan su germinación baja y fuertemente demorada.
Esta limitación puede ser resuelta a través del
cultivo in vitro de embriones zigóticos, o mediante
alguna otra biotécnica que permita la
micropropagación de la especie.

Las plantas procedentes del cultivo de tejidos,
presentan un desenvolvimiento anatómico y
fisiológico anormal, si se comparan con las propagadas
tradicionalmente de forma natural (Debergh, 1991). De modo, que
la terminología aclimatización, según este
autor, implica la transición desde las condiciones in
vitro a las in vivo, bajo la intervención y
guía de la mano del hombre. Preece
y Sutter (1991) consideran a las cualidades intrínsecas de
las plantas, como el factor más importante y de éxito
en el traslado de estas, de las condiciones in vitro a
in vivo. Paques (1991) estima a la vitrificación o
hiperhidratación como el síntoma más
frecuentemente calificado con el adjetivo anormal, en torno al comportamiento
de las plantas cultivadas in vitro. No obstante, existen
ciertas características anatómicas que diferencian
a las plantas cultivas in vitro de las que se desarrollan
en condiciones naturales; tales como hojas más
pequeñas y finas, y pobre desarrollo del parénquima
y de la cutícula con una considerable cantidad de espacios
de aire en el
mesófilo (Debergh, 1991).

Otra característica de las plantas obtenidas
por cultivo de tejidos, es no ser fotoautotróficas; sino
más bien mixotróficas o heterotróficas, pues
los hidratos de carbono los
toman del medio de cultivo y los cloroplastos se encuentran
deprimidos. Estos factores afectan la fotosíntesis, la cual debe jugar un papel
importante en la aclimatización y la supervivencia
(Deberg, 1991). La apertura y cierre estomático ha sido
definida por el propio autor, como el elemento de mayor
implicación en la desecación o
deshidratación de las plantas llevadas a condiciones
semicontroladas procedentes del cultivo in vitro. Esto lo
relaciona con el pobre funcionamiento de los estomas, el anormal
desarrollo de las células
oclusivas y a la poca selectividad en la acumulación de
Na, K y Mg en dichas células durante el cultivo in
vitro.

Todas son razones, que condujeron a la
realización de este trabajo, cuyo
propósito está enfocado a obtener un procedimiento e
indicadores
anatómicos y fisiológicos, que permitan alcanzar
altos índices de supervivencia en plantas de
marañón, procedentes del cultivo in vitro de
embriones zigóticos maduros, durante el proceso de
aclimatización.

MATERIALES Y
METODOS

La experiencia con el marañón
(Anacardium occidentale L.), se desarrolló en el
Laboratorio de
Biotecnología Vegetal del Instituto de
Investigaciones Agropecuarias "Jorge Dimitrov",
perteneciente al Ministerio de Ciencia,
Tecnología
y Medio Ambiente
de Cuba.

Las plántulas, procedentes del cultivo in
vitro de embriones zigóticos maduros, se extrajeron
cuidadosamente de los erlenmeyers, y se lavó el sistema
radical, hasta remover los restos de agar, sin provocarse
daños mecánicos. Posteriormente se transplantaron,
de forma individual, a bolsas de polietileno negro de 1 005
cm3 de capacidad, las cuales contenían un
sustrato formado por una mezcla de suelo, arena y
materia
orgánica en proporción de 2:1:1, respectivamente.
El suelo fue Oscuro Plástico,
la arena de río y la materia orgánica humus de
lombriz.

Se emplearon dos tipos de cámara
húmeda: una compuesta por frascos de cristal de 250 ml de
capacidad, de color verde
claro, colocados como cobertura encima las plantas y sostenidos
sobre el sustrato. La otra consistió en campanas de
cristal totalmente transparentes, muy amplias, bajo las cuales y
en cada una ellas, se situaron cuatro plantas y un frasco
destapado con agua. En el
ambiente de
aclimatización las temperaturas oscilaron entre 28 y
32°
C, la humedad relativa alrededor del 50%, la intensidad
luminosa fue de 30 m
Em-2S-1, y el fotoperíodo de
16 horas luz. Dentro de
las cámaras húmedas, la humedad relativa al inicio
fue tan alta como en condiciones in vitro, pero al estas
suspenderse en la segunda, tercera y cuarta semana por espacio de
3, 6 y 12 horas diarias, respectivamente; la humedad relativa se
redujo notablemente dentro de las mismas, hasta aproximarse a la
existente en el ambiente natural, la cual era de 70 a
75%.

Durante ese período se regaron con agua,
solamente, para humedecer el sustrato sin provocar
encharcamiento. Al término del tiempo
señalado, se liberaron definitivamente de la cámara
húmeda. Estuvieron una semana bajo observación, y
se comenzaron a someter, diariamente, a condiciones naturales
bajo sombra natural durante otra semana.

Se evaluó la longitud de las plantas (LP) en
cm, el número de hojas nuevas por plantas (NHN), el
número de hojas totales (NHT), la longitud de los estomas
(LE) en m m, el
ancho de los estomas (AE) en m m y la frecuencia estomática (FE) en
estomas/mm2. Las tres últimas variables, se
determinaron también en plantas cultivadas in vitro
y en plantas en condiciones naturales, para hacer un análisis comparativo. En todos los casos se
tomaron huellas epidérmicas de la haz y del envés
de la tercera hoja, contada del ápice hacia la base de la
planta, pues estas presentan una estructura
anatómica definida con máxima actividad
metabólica (Fahl, 1989). La técnica se
aplicó en la parte central de las hojas, por ser menos
variable la FE en esta área, y se basó en la
utilización de acetato de celulosa
diluido en ácido acético, colocado como una
película muy fina; al secarse al aire, se procedió
a separarla y extenderla en un porta objeto. Después se
fijó al mismo, el cubre objeto con bálsamo de
Canadá, y posteriormente se realizaron los conteos y
mediciones al microscopio
ocular según sugiere Medina (1961).

El tamaño de muestra fue igual
a 10, y los datos de LP, NHN
y NHT, obtenidos a las cuatro semanas de iniciada la
aclimatización, se analizaron mediante la prueba de
T-Student, y el p£ 0.001. El experimento se repitió
en tres veces, bajo similares condiciones.

RESULTADOS Y
DISCUSION

Los dos tipos de cámara húmeda (CH)
empleadas, aunque distintas (Fig. 1), tuvieron como función
impedir la deshidratación de las plantas, al sufrir un
cambio brusco
de condiciones de cultivo, debido a ser extraídas de su
ambiente in vitro para ser establecidas en uno
semicontrolado. Con ambos tipos de CH la supervivencia fue del
87%. Sin embargo, las plantas crecieron y emitieron más
hojas en presencia de la campana, y superaron con diferencia
altamente significativa a las que se aclimatizaron bajo frascos
(Tabla 1).

La formación de las hojas ocurrió
lentamente, no sólo en las plantas cultivadas in
vitro, sino también en las plantadas en condiciones
semicontroladas. Se observó que dicho proceso estuvo
relacionado, con el tipo de CH a que estuvieron sometidas las
plantas durante la aclimatización. El número de
hojas nuevas (NHN) formadas, bajo la acción
de la campana, fue superior en más de 1.5 hojas a las
desarrolladas bajo el efecto de la otra CH. Lo que
condicionó, a que el número de hojas totales (NHT)
—con el cual finalmente contaron las plantas para ser
llevadas a su sitio definitivo en el campo— fuera de casi
3.5 hojas de diferencia al compararse los dos tipos de
CH.

 Para ver el
gráfico seleccione la opción "Descargar" del
menú superior 

 Fig. 1 Muestra de las cámaras
húmeda usadas en la aclimatización del
marañón.

Debe reconocerse que tanto una como la otra CH, fueron
capaces de mantener en su interior la humedad relativa alta, lo
cual se apreció por el agua
condensada que se observó adherida a las paredes de ellas.
Incluso las muertes ocurridas, las cuales no sobrepasaron el 13%,
se pueden atribuir más bien a individuos con un sistema
radical deficiente y dañado durante la manipulación
al trasladarse de condiciones in vitro a semicontroladas.
Estos, al parecer, no pudieron emitir nuevas raíces o,
simplemente, las raíces dañadas no fueron capaces
de garantizar la nutrición de las
plantas hasta que se formaran otras nuevas, produciéndoles
gradualmente la
muerte.

Tabla 1. Influencia del tipo de cámara húmeda
en el crecimiento y

desarrollo de las plantas de marañón durante
la aclimatización.

T-Student: diferencia significativa entre
las columnas (p<0.001).

En los últimos años se ha iniciado una
corriente que se inclina al transplante sin raíz de
condiciones in vitro hacia las condiciones
semicontroladas; práctica no aconsejable en el cultivo del
marañón, pues parte de las causas de su buen
comportamiento al proceso de aclimatización a que se
sometió, obedeció a disponer de un sistema radical,
no extremadamente profuso, pero si con raíces bien
formadas. Los individuos que se transplantaron sin raíz
murieron de inmediato. Esto le da certeza al criterio formulado
por Mohammed y Videver (1990), los que aseguran, que la presencia
de raíces en plantas leñosas garantizan alta
supervivencia en la aclimatización.

El crecimiento y desarrollo superior obtenido con la
campana, debió basarse en el mayor volumen de este
tipo de CH, proporcionándole más posibilidad a los
gases de
poderse difundir e intercambiar, y concentrar más
CO2 para contribuir a un proceso fotosintético
más efectivo. Kosai (1990) indica la importancia de
concentraciones de CO2 suficientes para que las
plantas procedentes del cultivo in vitro alcancen su
autotrofismo. También el cristal de las campanas es
transparente, y el de los frascos color verde claro, lo cual pudo
influir en la mejor calidad de la luz
que llegó hasta las plantas cultivadas bajo las campanas,
y este también ser un elemento con posible beneficio sobre
la fotosíntesis. Otro aspecto a considerarse
es que cada campana cubrió a cuatro plantas, mientras los
frascos se le colocaron a las plantas individualmente. De este
modo, en las campanas las plantas pudieron establecer
algún tipo de colaboración a través del
intercambio gaseoso, lo cual no fue posible en la otra CH. No
obstante, a pesar de lo acontecido en una u otra CH, debe
recalcarse que las dos permitieron la aclimatización de
las plantas, y que a falta de campanas, u otro medio que las
simule, pueden emplearse frascos como una buena
alternativa.

La CH se retiró a las cuatro semanas, pero se
necesitaba conocer si verdaderamente las plantas serian capaces
de permanecer viables, sin deshidratarse y con posibilidades de
transpirar normalmente. Lo más práctico fue
observar los estomas al cabo de 24 horas de haberse liberado las
plantas de la CH. Entonces se confirmó que la vitalidad
que las mismas manifestaban, era porque habían podido
adaptarse al nuevo sustrato y condiciones ambientales;
expresándolo no sólo por la formación de
nuevos órganos hasta ese momento, sino además
porque los estomas estaban semiabiertos y las células
oclusivas turgentes. Todos estos elementos fueron suficientes
para saber, que el período bajo el cual permanecieron las
plantas sometidas a la acción de la CH, permitió
que se endurecieran y ganaran independencia
biológica, al aclimatizarse a las nuevas condiciones de
cultivo, ya más parecidas a las naturales donde
permanecerán hasta el final de su declive
fisiológico.

Estos resultados permitieron confirmar, que es
indispensable el tránsito de las plantas obtenidas in
vitro, por condiciones semicontroladas, y ser manipuladas
adecuadamente en dichas condiciones para evitar su
deshidratación. Blanke y Belcher (1989) demostraron que
los bajos grados de transpiración in vitro, se
deben al pequeño gradiente de humedad entre los espacios
intercelulares de las hojas y la atmósfera saturada de
humedad en los recipientes de cultivo, lo cual es responsable de
que los estomas se puedan considerar infuncionales en esas
condiciones. Desjardins (1995) más bien califica el
funcionamiento de los estomas in vitro como anormal; no
obstante, reconoce que el inicial y principal estrés que
obstaculiza la aclimatización de las plantas es la
deshidratación, y la señala como inhibidora de la
formación de la cera epicuticular de las hojas.

Las plantas se liberaron de la CH lentamente, para que
sus mecanismos fisiológicos fuesen adaptándose a
las nuevas condiciones de cultivo, lo cual se logró en
cuatro semanas. Tanaka et al. (1992) disminuyeron
gradualmente la humedad relativa durante 25 días, en
especies ornamentales cultivadas in vitro para
contrarrestar la excesiva transpiración y la posible
deshidratación, y demostraron que la reducción de
la humedad relativa en las CH, se asocia con alta resistencia de la
parte abaxial de las hojas a la transpiración; puesto que
se logra un mecanismo apropiado de apertura y cierre
estomático. En el cultivo de la papa, observaron que al
descender la humedad relativa hasta el 85%, las plantas
resistieron el transplante ex vitro.

Los estomas no se comportaron de la misma manera en cada
una de las fases de cultivo. Notándose en la Tabla 2, como
la longitud de estos, fue mayor en las condiciones in
vitro que en el resto de las condiciones. Sin embargo, el
ancho que mostraron los estomas en plantas en fase de
aclimatización fue mayor que el de los que procedieron de
condiciones in vitro, y los menos anchos se registraron en
condiciones naturales. Como mismo ocurre en otras muchas
especies, en la parte adaxial o haz la frecuencia
estomática fue menor que en la abaxial o envez. En esta,
los estomas se ubicaron en toda su dimensión; mientras en
la adaxial, los estomas se situaron aisladamente alrededor del
nervio central de la hoja.

Tabla 2. Comportamiento de los estomas en plantas de
marañón bajo distintas

condiciones de estudio.

 Al igual que el ancho de los estomas, la
frecuencia estomática (FE) fue mayor en la fase de
aclimatización, seguida de la obtenida en plantas
cultivadas in vitro y la menor se determinó en
condiciones naturales. Es posible que uno de los aspectos
fisiológicos encargados de permitir que el
marañón pueda vivir felizmente en condiciones
semiáridas y de baja pluviometría
(Cañizares, 1984) sea, precisamente, la posibilidad de
reducir no sólo el ancho de los estomas, y por supuesto el
tamaño del ostiolo; sino también la cantidad de
estomas por unidad de superficie. De modo, que esto puede
contribuir a que las plantas, en tales condiciones, se protejan
de la sequía con mayor eficiencia al
reducir las pérdidas de agua por transpiración y
como consecuencia mantener reservas, de esta, suficientes en sus
tejidos. Todo lo señalado, unido a la
característica coriácea de las hojas de
marañón, entre otras cosas, es lo que le confiere a
dicha especie la propiedad de
ser uno de los frutales tropicales arbóreos más
resistentes a la escasez de agua.
Levit (1987) relaciona un conjunto de cambios fisiológicos
y anatómicos que tienen lugar en plantas tolerantes y
resistentes a la sequía; donde se incluye la
disminución del tamaño de los estomas y la
reducción de su frecuencia.

No fue sustancial la diferencia de la FE entre la fase
in vitro y la de aclimatización (Tabla 2); lo que
si ocurrió —como se comentó antes— en
relación a las condiciones naturales. Existe diversidad de
criterios al respecto y todo apunta a una marcada influencia de
la especie con la cual se trabaje. Whish y Williams (1992)
registraron una reducción de la FE, a medida que se
disminuyó la humedad relativa hasta el 80% en la
aclimatización. Mientras Gerhard et al (1992)
indican que la FE puede ser mayor ex vitro, debido a que
el área de las hojas in vitro es alterada por el
intercambio gaseoso entre los recipientes de cultivo y la
atmósfera ambiental, y ponen como ejemplo que hojas de
rosa y de Spathipyllum desarrolladas in vitro
contaron con 163 y 53 estomas/mm2, respectivamente; y
en condiciones de casa vegetativa, sufrieron una reducción
hasta 86 y 29 estomas/mm2 en cada caso. Sin embargo,
Desjardens (1995) no encontró diferencias importantes de
FE, en plantas de Pelargonium cultivadas in vitro y
en condiciones naturales.

En las observaciones realizadas al microscopio, se pudo
percibir cierta irregularidad en la conformación de las
paredes de las células oclusivas obtenidas de plantas en
condiciones in vitro, lo cual no se presentó en
plantas cultivadas en las demás condiciones. Esto
concuerda con similar planteamiento hecho por Debergh (1991).
Considerarse el comportamiento estomático en el estudio de
aclimatización, es un indicador eficiente; pues Whish y
Williams (1992) aconsejan que es importante aplicar, durante
dicha fase, técnicas
que permitan conocer el estado de
la turgencia celular y darle seguimiento al comportamiento
estomático, para lograr una exitosa transición de
las plantas in vitro hasta condiciones
naturales.

Después de una minuciosa búsqueda de
publicaciones internacionales, acerca de la aclimatización
del marañón, solamente se encontró el
artículo de Das et al. (1999), el cual hace
referencia a que ese es el primer trabajo que oficialmente se da
a conocer sobre el cultivo de embriones zigóticos y
aclimatización de A. occidentale. Estas son razones
que le dan distinción especial a la presente investigación, por lo novedoso de los
resultados, y que no se diferencian de manera importante con los
obtenidos por los citados autores. En su caso, utilizaron un
sustrato compuesto por suelo:perlita (1:1) y mantuvieron a las
plantas en un contenedor a manera de CH, con humedad relativa
superior al 90%, fertilizaron semanalmente con el sustrato
vegetal nutritivo comercial "Fostrogen". Redujeron gradualmente,
durante dos meses, la humedad relativa, hasta valores
similares a los existentes en condiciones naturales, las
colocaron durante dos a cuatro meses en casa vegetativa, y
después las trasladaron hasta su lecho definitivo en el
campo. El manejo que le dieron a las plantas de
marañón extraídas de las condiciones in
vitro, fue extremadamente delicado, precisamente con el fin
de evitar la deshidratación.

Dicho procedimiento fue muy parecido al descrito en este
trabajo, con la diferencia de que emplearon entre cuatro y seis
meses para liberar las plantas, y en ese periodo aplicaron un
producto
comercial; mientras en este, sólo mediaron cinco semanas
sin la utilización de sustancias adicionales, simplemente
con un sustrato enriquecido con humus de lombriz, como abono
orgánico de bajo costo y de
fácil adquisición. No obstante, los porcentajes de
supervivencia están en correspondencia, al igual que el
crecimiento y desarrollo de las plantas, y se evidencia lo
valioso de la observación estomática para tener
criterios sobre la aclimatización de las mismas, y no
tener que someterlas un tiempo innecesario en condiciones
semicontroladas.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo se desarrolló gracias al
proyecto:
"Conservación in vitro de germoplasma de frutales"
; con soporte financiero del CITMA.

REFERENCIAS

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Narciso Aguilera

Lubia Guedes

Asociación Cubana de Técnicos
Agrícolas y Forestales (ACTAF). Capotico 208, Bayamo 85
100, Granma-Cuba.

E-mail:

N. Nerdo Rodríguez

Instituto de Investigaciones de Cítricos y
Frutales. Güira de Melena. La Habana-Cuba.