Monografías Plus      Agregar a favoritos      Ayuda      Português      Ingles     

Microscopía confocal

Enviado por m_pucciarelli



  1. Características generales
  2. Factores que influyen en la obtención de una buena imagen
  3. Usos
  4. Fluorocromos

El Microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas:
- un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y

- un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión

 Manuel Reina , Univ. deBarcelona (http://www.ub.es/biocel/wbc/images/fluorescencia/clsm.jpg)

 

  • Alta precisión y velocidad en el barrido
  • Pinhole continuamente variable
  • Resolución hasta los 2048 x 2048 pixeles
  • Controles independientes del PMT, amplificadores, filtros y configuraciones.
  • Un detector y un pinhole por canal
  • Un filtro optoacústico para el control de cada láser
  • Disminución del ruido
  • Escaneos seriados para la realización del objeto en 3D
  • USOS:
  • expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo reconstrucciones tridimensionales, tanto en cultivos celulares como tejidos histológicos;
  • estudios de colocalización de proteínas u otro tipo de moléculas;
  • transporte intracelular, endocitosis;
  • medidas de concentraciones de iones intracelulares;
  • desarrollo y expresión génica;
  • hibridación in situ con sondas fluorescentes;
  • FLUOROCROMOS2:

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón incidente de una longitud de onda característica.

Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan :

  • el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents')
  • el uso de fluorocromos con poco 'fading'
  • el empleo de luz de excitación de menor intensidad
  • la reducción de la concentración de oxígeno en el especimen
  • el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para reducir al máximo el tiempo de exposición.
  • el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación al máximo.

Los reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo.

Los reactivos antifading más empleados son los siguientes :

  • p-phenylenediamine. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.
  • DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.
  • n-propyl galeate. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
  • 2-mercaptoethylamine. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA.
  • Colorantes más utilizados – Rangos de emisión:

Table of Fluorochromes (And possible use with Ar/Kr lasser)

Probe

Ex (nm)

Em (nm)

Notes

Hydroxycoumarin

325

386

Succinimidyl ester

Aminocoumarin (AMCA)

350

445

Succinimidyl ester

Methoxycoumarin

360

410

Succinimidyl ester

R-Phycoerythrin (PE)

480;565

578

Fluorescein

495

519

FITC

Alexa 350

350

450

Alexa 430

430

530

Alexa 488

488

519

Alexa 568

568

610

Alexa 594

594

610

BODIPY-FL

503

512

Rhodamine (TRITC)

547

572

Texas Red

589

615

Sulfonyl chloride

Cy2

488

515

Cy3

512;552

565,615

Cy5

625;650

670

Cy7

743

767

X-Rhodamine

570

576

XRITC

Tetramethylrhodamine

550

590

Lissamine Rhodamine B

570

590

PerCP

490

675

Peridinin chlorphyll protein

Allophycocyanin (APC)

650

660

PE-Cy5 conjugates

480;565;650

670

Tri-Color, Quantum Red

PE-Cy7 conjugates

480;565;743

767

Red 613

480;565

613

PE-Texas Red

TruRed

490,675

695

PerCP-Cy5.5 conjugate

Cascade Blue

375;400

423

Hydrazide

Lucifer yellow

425

528

APC-Cy7 conjugates

650;755

767

Nucleic acid probes

Hoechst 33342

343

483

DNA (fixed cells)

DAPI

345

455

DNA (fixed cells)

Hoechst 33258

345

478

DNA (for live and fixed cells)

SYBR green

488

509

DNA

Propidium Iodide + RNAse

536

617

DNA only

TO-PRO-3

642

661

DNA

Mithramycin, Chromomycin A3

445

575

Thiazole Orange

453

480

SYTO 13

488

509

DNA+RNA; For live Cells.

SYBR+A59r green

488

509

Ethidium Bromide

493

620

DNA/RNA

Acridine Orange

503

530/640

DNA/RNA

TOTO-1, TO-PRO-1

509

533

Vital stain DNA/RNA

Propidium Iodide (PI)

536

617

DNA/RNA

TOTO-3

642

661

SYTO 59

640

660

DNA+RNA for Live Cells

Cell function probes

Indo-1

361/330

490/405

AM ester. Low/High Ca++,

Fluo-3

506

526

AM ester. pH > 6

2'7'Dichorodihydrofluorescein (DCFH)

505

535

Oxidized form

Dihydrorhodamine 123 (DHR)

505

534

Oxidized form. Light catalyzes oxidation

Calcein

496

517

pH > 5

Monochlorobimane

380

461

Glutathione probe

SNARF

548;579

587/635

pH 6/9

Fluorescent Proteins (expression markers)

GFP Y66F

360

508

GFP Y66H

360

442

GFP Y66W

436

485

Wild Type GFP

396,475

508,503

GFP S65A

471

504

GFP S65L

484

510

GFP S65T

488

511

ECFP

479

475

EYFP

484

540

DsRed

488

600

 

BIBLIOGRAFIA:

  1. Presentación del Dr. Santa Coloma – Web page Carl Zeiss
  2. Material docente diseñado y elaborado por Manuel Reina – Univ. de Barcelona
  3. Centro Nacional de Biotecnologia (CNB – CSIC), Madrid - España

 

MARIANA PUCCIARELLI

 

 


Comentarios


Trabajos relacionados

Ver mas trabajos de Biologia

 
 

Nota al lector: es posible que esta página no contenga todos los componentes del trabajo original (pies de página, avanzadas formulas matemáticas, esquemas o tablas complejas, etc.). Recuerde que para ver el trabajo en su versión original completa, puede descargarlo desde el menú superior.


Todos los documentos disponibles en este sitio expresan los puntos de vista de sus respectivos autores y no de Monografias.com. El objetivo de Monografias.com es poner el conocimiento a disposición de toda su comunidad. Queda bajo la responsabilidad de cada lector el eventual uso que se le de a esta información. Asimismo, es obligatoria la cita del autor del contenido y de Monografias.com como fuentes de información.