Microscopía confocal

1. Características
   generales
2. Factores que influyen en la
   obtención de una buena imagen
3. Usos
4. Fluorocromos

• CARACTERISTICAS
  GENERALES1:

El Microscopio
confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos
diafragmas:
– un diafragma de iluminación localizado tras la fuente
luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya
utilidad es
eliminar la luz proveniente
de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con
ello la claridad y resolución de la imagen; y

– un diafragma de detección, de tamaño variable
situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de
Emisión

 Manuel Reina , Univ. deBarcelona (http://www.ub.es/biocel/wbc/images/fluorescencia/clsm.jpg)

• Factores que
  influyen en la obtención de una buena
  imagen1:

• Alta precisión y velocidad en
  el barrido
• Pinhole continuamente
  variable
• Resolución hasta los 2048 x 2048
  pixeles
• Controles independientes del PMT,
  amplificadores, filtros y configuraciones.
• Un detector y un pinhole por
  canal
• Un filtro optoacústico para el control de
  cada láser
• Disminución del ruido
• Escaneos seriados para la realización
  del objeto en 3D
• USOS:
• expresión y localización de
  moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo
  reconstrucciones tridimensionales, tanto en cultivos celulares
  como tejidos
  histológicos;
• estudios de colocalización de
  proteínas u otro tipo de
  moléculas;
• transporte intracelular,
  endocitosis;
• medidas de concentraciones de iones
  intracelulares;
• desarrollo y expresión
  génica;
• hibridación in situ con sondas
  fluorescentes;
• FLUOROCROMOS2:

Los fluorocromos son sustancias que
tienen la propiedad de
emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando
captan (son exitados) por un fotón incidente de una
longitud de onda
característica.

Uno de los problemas de
la utilización de fluorocromos en microscopía de
fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las
grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en
esta técnica no pueden observadas durante largos periodos
de tiempo debido
a la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence
fading'). Se han desarrollado métodos
que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan
:

• el uso de reactivos protectores de la
  fluorescencia ('antifading
  reagents')
• el uso de fluorocromos con poco
  'fading'
• el empleo de
  luz de excitación de menor
  intensidad
• la reducción de la
  concentración de oxígeno en el
  especimen
• el direccionamiento del 100% de la luz
  hacia el dispositivo de registro
  (cámara, película,…) para reducir al
  máximo el tiempo de exposición.
• el empleo de mecanismos de medición de la exposición
  óptima (automática) para reducir la
  iluminación al
  máximo.

Los reactivos 'antifading' son
moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones
que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de
moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse
para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de
fluorocromo.

Los reactivos antifading más
empleados son los siguientes :

• p-phenylenediamine. Es el reactivo
  más efectivo para la conservación de la
  fluorescencia de la fluoresceína (FITC). También
  efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
  El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz.
  Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es
  extremadamente peligroso.
• DABCO
  (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la
  fluoresceína, aunque menor que la p-phenylenediamine. Es
  menos sensible a la luz y es mucho menos
  tóxico.
• n-propyl galeate. Es el agente
  más efectivo para la rodamina, aunque también es
  efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en
  glicerol/PBS.
• 2-mercaptoethylamine. Se emplea para
  la observación de cromosomas y
  muestras de DNA teñinas con ioduro de propidio (PI),
  naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM
  en Tris-EDTA.
• Colorantes más utilizados
  – Rangos de
  emisión:

BIBLIOGRAFIA:

1. Presentación del Dr. Santa Coloma – Web page Carl
   Zeiss
2. Material docente diseñado y elaborado por Manuel
   Reina – Univ. de Barcelona
3. Centro Nacional de Biotecnologia (CNB – CSIC),
   Madrid –
   España

MARIANA PUCCIARELLI