Cáncer: etiología, métodos de detección y avances en su cura

2. Resumen
4. Desarrollo del
   cáncer
5. Genes involucrados en la
   aparición del cáncer
6. Métodos para la
   detección de alteraciones en oncogenes y genes
   supresores
7. Avances en la terapia contra el
   cáncer
8. Bibliografía

Resumen:

En el siguiente Trabajo se
exponen los aspectos más relevantes acerca de los genes
supresores de tumores y de los oncogenes, y el papel que estos
juegan en la aparición y desarrollo del
cáncer. Para abordar este novedoso tema, se realizó
una amplia revisión bibliográfica con el objetivo de
conocer los diferentes tipos de antioncogenes y de oncogenes,
así como, la asociación de los mismos con
diferentes patologías malignas. Se hizo énfasis en
el modo de acción
de algunos de ellos, por considerar que son de gran importancia
dentro de las células,
en el control de los
procesos de
proliferación y diferenciación.

Palabras claves: Genes supresores
de tumores, oncogenes, cáncer.

Introducción:

Hace solo veinte años, los oncólogos se
encogían de hombros cuando se les preguntaba acerca de
como se originaba un cáncer. Los investigadores ignoraban
los trastornos celulares que provocan que una célula
sana pierda el control y empiece a dividirse desordenadamente.
Tampoco acertaban a explicar los mecanismos por los que ese
grupo de
células amotinadas establecen un particular sistema de vasos
sanguíneos que las ayudan a degenerar en un tejido
canceroso que, con el tiempo, invade
otras partes del organismo y amenaza de muerte al
individuo.

Hoy, sin embargo, el desarrollo de los tumores ha dejado
de ser un misterio. A lo largo de las dos ultimas décadas
se ha llevado a cabo un esfuerzo titánico para
desentrañar las diferencias que existen entre una
célula normal y una cancerosa. También se han
producido progresos trascendentales en el esclarecimiento de los
mecanismos moleculares que ponen en marcha el desarrollo de una
neoplasia o tumor.

Numerosos factores etiológicos para esta
enfermedad han sido descritos desde épocas remotas. Los
más comunes son el tabaco, productos
químicos, y radiación
solar, así como factores biológicos y
genéticos. Estos dos últimos, han sido los
más estudiados de un tiempo a esta parte en busca de
nuevos horizontes para hallar la cura definitiva.

El reciente hallazgo de dos familias de genes mutantes
(los oncogenes y los antioncogenes), que participan de forma
activa en la aparición de tumores, ha brindado información sobre la biología del
cáncer.

Los primeros indicios sobre la existencia de estos genes
salieron a la luz en 1911
cuando Peyton Rous demostró que un virus, denominado
posteriormente virus del sarcoma de Rous, era el agente
infeccioso que causaba sarcomas en pollos; pero su trabajo cayo
en el olvido hasta la década de los 60, época en
que R. Dulbecco y cols. transformaron en el laboratorio
células normales en tumorales al infectar células
del tejido conjuntivo (fibroblastos) de hámster con virus
del polioma. Más tarde en 1970, varios equipos
científicos corroboraron que estos virus
transmitían un gen que transformaba las células
normales en cancerosas. Un lustro después Michael Bishop,
Harold Varmus y sus colegas de la Universidad de
San Francisco en California comprobaron que el oncogen
transmitido por el virus del sarcoma de Rous se encuentra
también de forma natural en células sanas. Estos
estudios permitieron llegar a la conclusión de que el
enigma del cáncer se halla oculto en genes sanos que de
algún modo pierden el control y se transforman en
oncogenes, conociéndose en la actualidad alrededor de un
centenar de genes implicados directamente en la aparición
del cáncer (3).

Desde comienzos de este siglo se venían
exponiendo numerosas hipótesis sobre la biología
molecular del cáncer, sin embargo, las limitaciones
tecnológicas existentes no permitían a los
investigadores ponerlas a prueba. Los progresos hechos en la
ingeniería
genética y en las técnicas
de ADN recombinante
en los años 70 permitieron identificar y caracterizar
componentes del material genético que están
implicados en los procesos tumorales.

Avery, Mc Leod y Mc Carty consiguieron introducir ADN
biológicamente activo en bacterias en
1944; tuvieron que pasar 30 años para poder hacer lo
mismo en células animales, con las
denominadas técnicas de Transfección, gracias a las
cuales se extraen genes de una célula y se introducen en
otra. Como resultado de estos experimentos se
ha identificado un gran numero de oncogenes. El
conocimiento sobre otras técnicas de
Transfección, además de la basada en precipitados
de fosfato cálcico (utilizada por Avery y cols.) ha
posibilitado un mayor rendimiento de este método. La
microinyección de ADN, ya sea en el citoplasma o en el
núcleo de la célula;
el electrochoque y el uso de vectores
víricos en los que se implanta el gen deseado, son algunas
de las más empleadas (4).

Mediante el uso de la técnica denominada análisis de transferencia de Southern se
detectan e identifican genes individuales de entre los mas de 50
mil que componen el genoma de un mamífero. Tras la
identificación, la
clonación molecular posibilitó el aislamiento
de los fragmentos de ADN que contienen los oncogenes. Utilizando
estos como sondas en el estudio de ADNs de organismos inferiores
se ha logrado detectar la presencia de genes homólogos en
los mismos.

El uso combinado de endonucleasas de restricción
y ligación constituye la base de toda la moderna tecnología del ADN
recombinante que nos permite aislar genes individuales y trabajar
con ellos en el tubo de ensayo. Para
determinar el orden de los nucleótidos una vez aislados
los oncogenes se lleva a cabo una secuenciación. Con este
propósito se han empleado dos técnicas descritas en
1977, la de Maxam y Gilbert y la técnica de Sanger
("dideoxi"). El primer método se basa en el uso de
reacciones
químicas que rompen el ADN específicamente por
cada una de las diferentes bases. El segundo se fundamenta en la
síntesis in vitro de una molécula
complementaria al ADN problema. Con ambos métodos, el
resultado final es una escalera de bandas electroforéticas
cuyos peldaños corresponden a cada una de las bases del
oncogen.

Las técnicas de análisis
cromosómicos de los años 70 permitieron llegar a
detectar defectos cromosómicos asociados con tipos
específicos de tumores humanos, pero las limitaciones
inherentes a las mismas impidieron extender estos análisis
a todos los tipos de tumores y determinar exactamente la
frecuencia de estos defectos cromosómicos. A partir de
1980, el cultivo de células procedentes de tumores
malignos y el desarrollo de técnicas de bandeo
cromosómico de alta resolución han permitido
constatar que la inmensa mayoría de las neoplasias humanas
llevan asociadas defectos cromosómicos. El notable avance
de las técnicas de cartografía cromosómica
(también llamada mapeo) ha sido de gran ayuda en este
empeño.

La producción de anticuerpos monoclonales
desarrollada por Kohler y Milstein en 1975 es en la actualidad
uno de los métodos básicos para el estudio de los
oncogenes. Se producen anticuerpos específicos y dirigidos
contra regiones únicas de cualquier proteína como
pueden ser proteínas
oncogénicas o antígenos tumorales que resultan
indicativos de las etapas iniciales en las cuales las
proteínas oncogénicas entorpecen los complejos
procesos de regulación celular y producen el fenotipo
canceroso como efecto final (4).

El uso de la computación ha prestado una valiosa ayuda
en la realización de estas tareas, introduciendo las
secuencias en bancos de
datos, lo que
facilita enormemente la comparación molecular entre
diversos oncogenes, así como el estudio de la evolución molecular de genes conservados en
la escala
evolutiva.

Desarrollo del
cáncer:

El crecimiento celular es un proceso
extremadamente regulado que responde a las necesidades
específicas del organismo. En individuos jóvenes la
multiplicación celular predomina sobre la muerte
celular, de manera que, en el adulto estos procesos se encuentran
en equilibrio.

En ocasiones, y debido tanto a causas tanto
exógenas como endógenas, los controles que regulan
la multiplicación celular no funcionan adecuadamente y una
célula empieza a crecer sin fin determinado. Cuando los
descendientes de esta heredan la tendencia a crecer sin responder
a regulación alguna, el resultado es un clon celular
(teoría
del origen clonal) capaz de expandirse ilimitadamente. Finalmente
este clon de células no deseadas puede formar una masa
llamada tumor (5).

Etapas de la
carcinogénesis:

La carcinogénesis es un proceso que ocurre en
múltiples etapas e incluye numerosos eventos
genéticos y epigenéticos. De manera general
diversos autores (5,6) plantean tres pasos: Primero la
iniciación, donde el ADN de una célula cualquiera
es dañado por la acción de carcinógenos;
segundo la promoción, en la que ocurre
proliferación a partir de la célula dañada
y; en tercer y último lugar la progresión, estadio
en el que la célula sufre cambios particulares que
caracterizan esta patología.

Realizando un análisis más detallado de
todo el proceso se conoce que hay cinco fases en las que se
encuentran involucrados cuatro o más genes cuya
acción es fundamental para la aparición de una
neoplasia (7).

• Células genéticamente afectadas: El
  desarrollo del tumor comienza cuando alguna célula
  dentro de una población normal sufre una
  mutación genética que aumenta su propensión
  a proliferar cuando debería estar normalmente en
  reposo.
• Hiperplasia: La célula alterada y sus
  descendientes continúan con apariencia normal pero se
  reproducen demasiado (hiperplasia). Después de
  años una en un millón de estas células
  sufre otra mutación que posteriormente pierde el control
  en el crecimiento celular.
• Displasia: Además de proliferar excesivamente,
  la apariencia de estas células es anormal en forma y
  presentación, se dice entonces que en el tejido hay una
  displasia. Una vez más después de un tiempo
  ocurre una rara mutación que altera la conducta
  celular.
• Cáncer in situ: Las células afectadas
  se hacen más anormales en el crecimiento y apariencia.
  Si el tumor todavía no ha brotado a través de las
  uniones entre los tejidos es
  llamado cáncer in situ. Este tumor puede permanecer en
  esa situación indefinidamente, sin embargo,
  eventualmente algunas células pueden adquirir mutaciones
  adicionales.
• Cáncer invasivo: Si los cambios
  genéticos permiten que el tumor comience a invadir
  tejidos subyacentes y vierta células a la sangre o linfa
  se considera que la masa se ha malignizado. Las células
  que escapan probablemente establezcan nuevos tumores
  (metástasis) a través del cuerpo, estas pueden
  hacerse letales si afectan órganos vitales.

Clasificación
de las neoplasias:

Las neoplasias de manera general pueden clasificarse
como benignas y malignas. Lo que diferencia una neoplasia benigna
de una maligna o cáncer, es el hecho de que en la primera,
la formación tumoral está delimitada por una pared
o cápsula que la separa del tejido circundante, y
así permanece casi siempre indefinidamente. En cambio, la
neoplasia se maligniza y se habla de cáncer cuando las
células tumorales no están formando una estructura
bien circunscrita y local, sino que por el contrario, pueden
migrar, atravesar la membrana basal del tejido original y
trasladarse mediante el torrente sanguíneo o
linfático a órganos remotos que pueden colonizar o
invadir.

Por su origen histológico, los cánceres se
clasifican en carcinomas (los más frecuentes) si derivan
de malignización de epitelios, sarcomas si lo son de
células de tejido conectivo o de sostén, y
leucemias o linfomas si son malignizaciones de células
hematopoyéticas (2).

Clasificación histogenética de tumores
benignos.

Clasificación histogenética de tumores
malignos.

Etiología
del cáncer:

Se habla mucho sobre las causas del cáncer sin
poder aún establecer cuales son estas. No existe una sola
y única causa sino un grupo de factores cuyos efectos
actúan sinérgicamente y predisponen al
cáncer en el
hombre.

Se plantean de forma muy general dos grandes causas
fundamentales: las exógenas, responsables del 80-90 % de
todas las neoplasias, y las endógenas responsables del
10-20 % restantes. Estas últimas, a diferencia de las
primeras, ocurren en el organismo independientes a cualquier
incidencia externa. Pueden ser mutaciones espontáneas
debidas a fallas en procesos biológicos endógenos
naturales que ocurren en la célula como es el caso de la
reparación del ADN que realizan enzimas
correctoras específicas o; por herencia, es
decir, transmisión de mutaciones en genes recesivos
llamados supresores que se trasmiten de generación en
generación en las llamadas familias con síndrome de
cáncer (2).

El hombre como
ser biosicosocial se mantiene en estrecha relación con el
ambiente que
lo rodea y este influye de varias formas en su salud. Los
carcinógenos (cualquier agente capaz de incrementar la
incidencia de la malignidad neoplásica) son los factores
principales de las causas exógenas o ambientales. Estos
pueden ser químicos, físicos, biológicos e
incluso sociales (5, 6).

• Compuestos químicos: El uso cotidiano de
  medicamentos variados, aditivos alimenticios,
  cosméticos, pesticidas, productos industriales y del
  hogar; el tabaquismo
  activo o pasivo, la ingestión de bebidas
  alcohólicas, de estimulantes, la variada exposición ocupacional y los tipos de
  alimentos
  que ingerimos o dejamos de ingerir en la dieta, son algunos de
  los factores a que voluntaria o involuntariamente, nos vemos a
  diario expuestos. Estos carcinógenos químicos
  pueden ser genotóxicos, cuando causan un daño
  directo en el ADN, y no genotóxicos cuando inducen
  proliferación siendo el daño indirecto (2, 5,
  6).
• Carcinógenos físicos: Los
  cánceres causados por agentes físicos son en su
  mayoría debidos a radiaciones genotóxicas tanto
  ionizantes como no ionizantes. Las últimas están
  representadas básicamente por las radiaciones
  ultravioletas que como presentan bajo contenido
  energético no pueden atravesar la materia
  viviente ni generar radicales libres, pero en cambio
  interactúa con el ADN induciendo formación de
  dímeros entre dos bases timinas vecinas e interfiriendo
  así con el proceso normal de replicación. Las
  ionizantes (radiación gamma, X, neutrones y
  partículas cargadas) poseen en cambio un elevado poder
  energético y logran atravesar la materia viva ionizando
  a su paso átomos y generando radicales libres, en
  extremo nocivos para la célula. En cuanto a las
  radiaciones no genotóxicas, correspondientes al espectro
  electromagnético con longitudes de onda correspondientes
  al infrarrojo, visible, entre otros; se conoce poco aunque se
  ha relacionado con la aparición de leucemias y linfomas
  (2, 6).
• Agentes biológicos: Hace más de cien
  años atrás los investigadores comenzaron a
  considerar la posibilidad de que los tumores fueran causados
  por virus u otros agentes infecciosos. Hoy en día ya se
  sabe que los patógenos más comunes causantes de
  cáncer son los virus de ADN los cuales se propagan por
  invasión a la célula de un hospedero usando la
  síntesis celular y la maquinaria de producción
  proteica para producir copias virales (8). El virus más
  estudiado de todos los cancerígenos es el Papiloma virus humano
  (PVH), un pequeño virus que causa tumores epiteliales.
  Hasta el momento se han descubierto más de 75 PVH la
  mayoría asociados a lesiones benignas aunque algunas a
  cánceres, en particular a cervicales, estos son los
  tipos 16 y 18 (9). Otro virus, también trasmitido
  sexualmente, es el de la hepatitis B, el
  cual se considera un factor etiológico para el
  cáncer de hígado (alrededor del 80 % de todas
  las neoplasias de hígado en el ámbito mundial).
  El virus de Epstein- Barr que produce mononucleosis es
  responsable también de 50 % de los cánceres de
  faringe, 30 % de enfermedades Hodgkin y 10
  % de linfomas no Hodgkin, además de algunos
  cánceres gástricos. El virus de la
  inmunodeficiencia adquirida, causante del SIDA, puede
  producir sarcoma de Kaposi y algunos linfomas relacionados con
  la proliferación de linfocitos (8).

Otra clase de
virus, los retrovirus, también están muy
relacionados con el desarrollo del cáncer. En 1911
Peyton Rous demostró que el retrovirus del sarcoma de
Rous provoca la formación de sarcomas en pollos. De esta
forma un estudio que comenzó con el análisis de
retrovirus de vertebrados acabó permitiendo el
descubrimiento de genes virales que poseen sus homólogos
en células humanas y que participan en la inducción de tumores. En algún
momento de su historia infecciosa el
genoma de estos virus debe haberse recombinado con una
secuencia celular, que puede ser reintroducida en el genoma
celular formando parte de un provirus. Normalmente la
estructura del oncogen viral (v-oncogen) está modificada
respecto a su contraparte celular (c-oncogen) (10). Otros
retrovirus importantes, son el de sarcoma de simios, sarcoma
felino, sarcoma murino de Harvey, sarcoma murino de Kirsten,
entre otros (11). En cuanto a los cánceres causados por
bacterias solo se conoce el cáncer estomacal producido
por la Helicobacter pilori, que además de provocar esta
enfermedad produce úlcera gástrica. Eventos
secundarios a la infección de cualquiera de estos
patógenos, como la acción del sistema inmune hace
que no en todos los infestados aparezcan neoplasias
(8).

• Estrés: El ser humano en la época
  actual vive cargado de estrés,
  de tensión nerviosa, de ansiedad, de depresión, con temores, angustias y
  preocupaciones constantes. Todas las cargas emocionales
  negativas pueden contribuir a la aparición de un
  cáncer. Se ha observado que años después
  de grandes problemas
  familiares, depresiones profundas, pérdidas o
  separaciones de seres queridos muchas personas han
  contraído cáncer sin otras causas aparentes. Se
  desconocen los verdaderos mecanismos por los que ocurre esto
  pero se sospecha el papel que desempeña la
  inmunodepresión característica de las fases
  depresivas, importante protección del organismo frente
  al surgimiento de células malignas en el organismo
  (2).

La acción conjunta de la mayoría de estos
factores etiológicos del cáncer sobre el ADN
provoca mutaciones, si estos ocurren en genes implicados en la
proliferación y crecimiento celular se ponen de manifiesto
una serie de manifestaciones que traen como resultado el
desarrollo de una neoplasia.

Genes involucrados
en la aparición del cáncer:

Los genes que mayor relación presentan con la
malignización celular son los genes supresores de tumores
y los oncogenes ya que están directamente vinculados al
crecimiento y proliferación celular. Los primeros forman
parte directa del control del ciclo celular siendo los encargados
de detener el mismo cuando ha ocurrido daño en el ADN. Los
oncogenes, por su parte, definen los diferentes niveles de
señalización celular, es decir, tienen un papel
fundamental en la transmisión de señales
desde el exterior celular hasta el núcleo donde se
ejecutan las ordenes (12).

Mutaciones en cualquiera de estos genes rompen la celosa
vigilancia que la célula tiene sobre el control de su
crecimiento y proliferación destruyéndose
así el balance homeostático existente entre ambos.
El paradigma
oncogen-antioncogen postula que, a pesar de los mecanismos de
seguridad que la
evolución ha proporcionado al organismo para poder
soportar la ocurrencia de una o varias mutaciones, eventualmente
el equilibrio entre estos dos genes se rompe y la neoplasia
emerge (13).

Entre las mutaciones más comunes que se han
identificado en estos tipos de genes en genomas tumorales
están las mutaciones puntuales, deleciones,
amplificaciones, aberraciones cromosomales como translocaciones e
inversiones
además de pérdidas cromosomales entre otros. Cada
gen, ya sea supresor de tumor u oncogen, posee un tipo de
alteración característica que lo activa. En varios
casos sucede que un mismo gen puede ser activado por más
de una alteración y esta se asocia a una patología
específica (14).

Algunos aspectos sobre
el Ciclo celular:

Una propiedad
inherente a la célula es su habilidad para producir copias
exactas de si misma con una alta fidelidad. La maquinaria
responsable del control del ciclo celular es altamente organizada
y relativamente bien conservada a través de la
evolución.

La carencia de fidelidad en este proceso crea una
situación de inestabilidad genética, lo cual parece
ser un factor contribuyente al desarrollo de células
malignas, por lo que el cáncer es una enfermedad
caracterizada por una regulación anormal del crecimiento
celular.

El ciclo presenta dos fases funcionales (S y M) y dos
fases preparativas (G1 y G2). En S ocurre
la replicación precisa y fiel del DNA, en M la
segregación del sistema de cromosomas entre
las células hijas y la división mitótica. En
G1 procede la preparación bioquímica
para la fase S y en G2 para la mitósis
(15).

Como es natural este ciclo tiene mecanismos
específicos que controlan la transición de una fase
a otra del ciclo. Hay dos moléculas (proteínas) muy
importantes en este proceso:

• Quinasas dependientes de ciclinas (cdk) cuya función
  enzimática es fosforilar.
• Ciclinas (deben su nombre a que se sintetizan y
  degradan de forma cíclica).

En cada transición del ciclo celular ocurre la
activación de cdk las que están asociadas con
ciclinas específicas de la fase actual del ciclo y que son
necesarias para progresar a la próxima etapa. Estas cdk
solo están activas en los momentos precisos en que la
célula las necesita.

Existen seis niveles de regulación de la
actividad de estas quinasas dependientes de ciclinas
(cdk):

Cada cadena es sintetizada en una etapa determinada del
ciclo celular.

• Ciclinas D y E en G1.
• Ciclina A en S y G2.
• Ciclina B en G2 y M.
• Degradación regulada de la ciclina
  .

Cuando están presentes pueden asociarse con una
cdk y activarla.

Las cdk cuando están con las ciclinas pueden ser
activadas cAK (cdk activaty kinasa).

Las cdk pueden inactivarse por fosforilación (thr
14 y tyr 15) y reactivarse por la acción de fosfatasas
(16,17).

Existen proteínas inhibidoras de quinasas
dependientes de ciclinas que actúan:

a) Evitando que se unan a la ciclina.

b) Evitando que se activen en el complejo.

De G1 a S sucede que el complejo ciclina /cdk
fosforila al pRb que es el producto de un
gen supresor de tumores (Retinoblastoma), este normalmente
está asociado a factores de la transcripción de
manera que cuando se fosforila libera los factores que participan
en la transcripción de genes cuyos productos son
necesarios en la síntesis de DNA (ejemplo :DHFR, DNA
poli a ,
timidina quinasa).

En S la célula comienza a replicar el DNA y no
finaliza hasta que está completamente replicado. La
fidelidad del proceso se logra por la actividad correctora (3'-5'
exonucleasa) de la enzima DNA polimerasa (enzima que fabrica DNA
a partir de nucleótidos libres). Con esta
reparación se reduce hasta mil veces el error.
También las telomerasas juegan su papel formando los
telómeros en los cromosomas contrarrestando la
replicación incompleta evitando la pérdida de
secuencias importantes de DNA (16).

En la transición de G2 a M se conoce
que participa un factor promotor de mitósis (MPF) o
ciclina B que actúa en blancos aún desconocidos
para que la célula entre en mitósis .

De la etapa de mitósis como tal (M) a la de
G1 se sabe que una vez que MPF (ciclina B / cdc 2)
realizó su función se degrada. La célula
entra en anafase con sus respectivos procesos necesarios para la
citocinesis .

Para que la célula se replique con verdadera
fidelidad cada secuencia debe replicarse un sola vez . Esto lo
garantiza un factor citosólico que es necesario en el
núcleo para la replicación y se destruye cuando
este terminó de replicarse . Como en G2 ese
factor no existe en el núcleo no puede ocurrir
replicación; sin embargo como está presente en el
citosol , cuando la membrana nuclear se desensambla durante la
mitósis este factor entra en el núcleo y la
célula en el próximo período puede replicar
su DNA (17).

Genes
supresores de tumores:

Como vimos en el anterior resumen del ciclo celular, la
célula cuenta con moléculas importantes que vigilan
la secuencia normal de acontecimientos genéticos que
permiten su proliferación. Estos son los genes supresores
de tumores o antioncogenes. Cuando los productos de los mismos no
son funcionales o están ausentes, la célula pierde
la protección que le brindan normalmente lo cual conduce a
la aparición y desarrollo de tumores malignos
(17).

Los genes supresores de tumores tienen como
característica que para perder el controlde la
proliferación celular deben tener ambas copias de los
genes mutados (genotipo recesivo). Autores como (18) plantean la
existencia de una teoría denominada "De los dos eventos".
Según esta teoría, la aparición de la
enfermedad sería el reflejo de dos lesiones
genéticas independientes. Una de ellas se hereda como
carácter autosómico recesivo y por consiguiente se
presenta constitucionalmente en todas las células
somáticas. Confirmando esto en algunos pacientes se
identificaron alteraciones cromosómicas que
consistían frecuentemente en deleciones en regiones
cromosómicas concretas. El segundo impacto elimina la
copia funcional del gen implicado por lo que en la enfermedad se
pierde la heterocigocidad.

Los productos de los antioncogenes tienen diversas
localizaciones en la célula, lo mismo son proteínas
citoplasmáticas que nucleares. No obstante su
ubicación sus funciones son
básicamente iguales, proteger la célula de una
posible malignización.

De todos los genes supresores de tumores los más
conocidos y estudiados son el retinoblastoma (Rb) y el gen P53
por su estrecha relación con cánceres humanos
(7).

Retinoblastoma:

El retinoblastoma (tumor de retina) es el cáncer
ocular infantil más común en humanos. Puede ocurrir
por herencia o por mutagénesis (9,19). El locus
genético de este gen supresor de tumores es la banda q14
del cromosoma 13 en humanos (6,9,20).

Los niños
que heredan una única copia defectiva del gen Rb por
término medio padeceran tres tumores de retinoblastoma
cada uno de los cuales deriva de una sola célula
transformada. Ya que la retina en desarrollo contiene
aproximadamente 4 x 106 células, solamente una
célula de cada 106 se vuelve tumoral. Este
hecho sugiere que, a pesar de su alta heredabilidad, el gen Rb
actúa de manera recesiva a nivel celular y que es
necesario un segundo acontecimiento para que se produzca el estado
transformante (5).

Normalmente un individuo común puede ser tanto
homocigótico dominante como heterocigótico para el
gen Rb. Si ocurre la pérdida de un alelo ya sea en una
célula somática o germinal el homocigótico
puede convertirse en heterocigótico. Cuando en esta
situación se pierde además el segundo alelo en una
célula somática se desarrolla el tumor ocular, pero
si esto ocurre en una célula germinal se trasmite la
predisposición al tumor en la descendencia que entonces se
considera hereditario (9).

La alteración genética que propicia la
pérdida del alelo es la deleción y se encuentra
asociada principalmente al retinoblastoma aunque también
se ha encontrado inactivo el Rb en osteosarcomas y algunos
carcinomas de mama, pulmón y vejiga (6,11,14).

El producto del gen supresor de tumores Rb es una
fosfoproteína nuclear cuya influencia es fundamental para
el ciclo celular. Se encuentra asociado normalmente a factores de
la transcripción tales como DHFR, ADN poli
a , Timidina quinasa
además del E2F, el más importante. La
liberación de estos factores está dada por la
fosforilación de la proteína RB por el complejo
ciclina / cdk en el final de la fase G1 y luego es desfosforilada
lista para unirse nuevamente a los factores de la
transcripción durante la mitósis. La unión
de E2F a la proteína Rb hace que disminuya la habilidad de
este factor para estimular la transcripción de manera que
si ocurre algún daño en el ADN la proteína
Rb mantien secuestrado al factor de transcripción y por
tanto arrestado el ciclo celular en la fase G1 evitando que se
replique un ADN incorrecto (9,17).

La función normal de la proteína Rb puede
ser afectada también por la unión con las
oncoproteínas E7 de PVH (5,21). Estudios realizados con
proteínas quiméricas, cuya habilidad para romper
fisicamente el complejo pRb/E2F está afectada, sugieren
que hay moléculas determinantes en el extremo C-terminal
de la proteína E7 para esta actividad (22).

p53:

El término de proteína p53 es designado a
una familia de
proteínas celulares que varian en talla desde 48 Kd a 55Kd
en diferentes especies. En diversos estudios se han encontrado
grandes cantidades de esta molécula en células
transformadas por el virus SV40 y en células en plena
actividad de división, lo que indica que está muy
relacionada con el ciclo celular y especificamente con su control
(23).

Este gen supresor de tumores está localizado en
el brazo corto del cromosoma 17 en humanos, más
especificamente en la banda 13 y presenta alrededor de 20 Kb. El
ARN transcrito (2.8 Kb) codifica para una fosfoproteína
nuclear de 53 Kd que contiene 393 aminoácidos. El
análisis de nucleótidos y de secuencias
aminoacídicas ha revelado la existencia de cinco dominios
evolutivamente conservados que parecen ser esenciales para la
función normal del producto protéico. Entre las
propiedades del gen P53 se incluyen dos dominios de ligamiento al
ADN, dos sitios de unión al antígeno tumoral de
SV40, una señal de localización nuclear, un
dominio
oligomerizado y múltiples sitios de fosforilación
(9).

En caso de daño en el ADN celular en el momento
de la división la proteína p53 puede provocar dos
respuestas celulares diferentes pero con un mismo fin, eliminar
el daño y así el paso de errores genéticos a
la descendencia. La primera respuesta consiste en el paro del ciclo
celular seguido de la reparación. Bajos niveles de ADN
afectado inducen un paro prolongado del ciclo celular en la fase
G1 hasta tanto la maquinaria de reparación sea capaz de
corregir la estructura del ADN. Estudios realizados en
fibroblastos humanos han revelado que esta detención del
proceso está estrechamente vinculada con la p53 así
como también se ha encontrado asociada a una
proteína denominada p21. Mutaciones inactivantes en P53
eliminan la inducción de p21 lo cual podría
bloquear normalmente la fosforilación de otro gen supresor
de tumores llamado Rb mediada por ciclina / cdk y la
progresión hacia la fase S (9,24,25).

A diferencia de esta primera respuesta cuyo fin es que
la célula pueda replicarse sin errores tras desbloquearse
la división, la segunda mucho más drástica,
induce la muerte de la célula si el daño es tal que
no pueda ser reparado o si la célula está muy cerca
de la división (9,24). Hasta el momento se han descrito
dos mecanismos distintos por los cuales la p53 puede activar la
apoptósis o suicido celular programado. Uno requiere la
activación de la transcripción de secuencias
especificas (sst) y el otro es independiente de esto. Ambos
pueden dispararse simultaneamente y esta cooperación tiene
como resultado los máximos efectos apoptóticos. El
mecanismo que implica activación de genes determinados
puede ser inhibido por la proteína codificada por el
oncogen Mdm2 que forma un complejo con la p53 (26).

Otra oncoproteína, la bcl-2, puede proteger la
célula contra la apoptosis inducida por daño en el
DNA mientras que el producto del c-myc (oncogen) puede aumentar
la respuesta apoptótica bajo estímulos como el de
privación del factor de crecimiento. Al resultado final de
este suicidio celular
es el colapso de la célula en una masa pequeña y la
fragmentación del DNA nuclear evitándose de esta
forma que nuevas células hijas presenten su DNA
dañado y por tanto sean proclives a una
malignización neoplásica(9).

En más de la mitad de los cánceres se han
identifcado alteraciones específicas en la estructura de
gen de la p53. En todos se presenta el mismo fenotipo aunque
puede ser producido tanto por mutaciones puntuales como por
deleciones. En caso de que en un individuo heterocigótico
se produzca la pérdida de un alelo funcional por
deleción o que este se dañe como consecuencia de
alguna mutación puntual la proteína p53 en esa
célula se ausentará o funcionará de forma
defectuosa de manera que, si en esa misma célula ocurre
algún otro daño genético se dividirá
sin que sea reparado, o peor aún si el ADN está muy
afectado no es posible que la célula se destruya por
apoptosis (14,27). Algunos autores como (9,28) han encontrado
asociación entre mutaciones en el gen de la p53 y el
síndrome de Li-Fraumeni, una rara forma de cáncer
hereditario que afecta a individuos
heterocigóticos.

Otra vía de inactivación de la
proteína p53 se debe a la unión de la
oncoproteína E6 de los PVH 16 y 18 con dos sitios
diferentes en la estructura de la misma. Uno de estos sitios es
dentro de la estructura nuclear de la proteína p53.
Análisis realizados por deleción nuestran que el
punto de unión está en el residuo 135 resultando la
p53 marcada para una degradación dependiente de
ubicuitina. El otro sitio de unión de la proteína
supresora de tumores con la oncoproteína viral E6 es el
extremo C-terminal, pero en este caso no se induce
degradación (29,30).

En numerosos carcinomas han sido reportadas alteraciones
de p53 en el DNA tumoral, entre los más comunes
están los carcinomas de hígado, mama, colon y
pulmón, así como el osteosarcoma (6).

Oncogenes:

Los protooncoges son genes de una célula normal
cuyos productos están involucrados directamente en los
mecanismos de transducción de señales y su
función es desencadenar procesos de proliferación y
diferenciación en la célula. Al mutar , estos genes
se convierten en oncogenes, los cuales dan lugar a productos
alterados que predisponen la célula a una
transformación neoplásica (6,12,14,24).

De los cerca de 100 oncogenes hasta el momento
conocidos, 32 han sido identificados en genomas retrovirales
distinguiéndose estos por el prefijo v seguido del nombre
del oncogen (v-oncogen) a diferencia de sus homólogos
celulares que se identifican como c-oncogen (9).

Los oncogenes pueden activarse de dos formas
fundamentales a manera general, puede ser por daños que
alteren la secuencia genómica normal del gen como es el
caso de las mutaciones puntuales, o por eventos que cambien su
expresión pero que mantienen la secuencia codificante
inalterada como ocurre en inserciones, translocaciones y
amplificaciones. Puede suceder que un oncogen se active por
más de una vía a la misma vez, o que una
alteración determinada se asocie a un tipo de tumor
específico (9,14,24).

Mecanismo de
transducción de señales:

Las células eucariotas, a diferencia de las
procariotas, han desarrollado un alto nivel de
compartimentación celular y nuclear dado por membranas que
separan tanto en ADN del material celular como el interior de la
célula del ambiente externo. De esta manera queda
protegido el material genético de agentes externos
(nucleasas, mutágenos, entre otros) que pueden
dañarlo. A la par de ese avance evolutivo ha tenido que
ocurrir otro, el desarrollo de un mecanismo o sistema
bioquímico de comunicación que provee al núcleo
aislado por membranas de información del exterior celular
a la que tiene que responder (31).

Señales ambientales tales como citoquinas,
hormonas de
bajo peso molecular, factores de crecimiento otras
proteínas se impregnan a la porción externa de la
membrana plasmática y ahí pueden ocurrir dos
mecanismos diferentes (31).

1- Una vez unido el ligando al receptor se transmite la
señal a través de la membrana plasmática
desde el dominio unido al ligando hasta el dominio interno
localizado en la cara interna de la misma. La consecuencia
bioquímica de esta transducción de señales
es generalmente la activación de una enzima (por ejemplo:
proteínas quinasas) o una alteración en un
nucleótido determinado que se une por afinidad (por
ejemplo: GTP-unión guanosina trifosfato) estimulado por el
dominio intracelular del interruptor proteico.

2- Este otro mecanismo está dado por la
acción de algunos agentes externos con
características liposolubles que pueden atravesar la
membrana plasmática y unirse directamente con su receptor
citoplasmático.

Ambos mecanismos producen cascadas de eventos
bioquímicos que involucran activación de secuencias
de proteínas quinasas o cambios en el contenido de
fosfolípidos de la célula que conllevan a la
activación de fosfolipasa C o fosfoinositol 3 quinasa. La
fosfolipasa C degrada el fosfatidil inositol difosfato en diacil
glicerol e inositol 3 fosfato. El primero de estos productos de
la degradación es el segundo mensajero que activa una
proteína específica serina treonina quinasa C. El
inositol 3 fosfato por su parte libera calcio de almacenes
internos resultando la activación de calcio / calmodulina
quinasas además de otros efectos. El fosfoinositol 3
quinasa fosforila el fosfatidil inositol en la posición 3
del anillo de inositol (14).

Estos procesos de transducción de señales
están directamente involucrados en el control de la
proliferación y diferenciación celular. Cualquier
error en el desarrollo normal de estas vías puede
desencadenar una transformación neoplásica en la
célula (6,14,24,31|).

Clasificación de lo productos de los
oncogenes:

Una de las tantas formas de clasificar los oncogenes es
de acuerdo a la función de sus productos. Si bien la
vía detallada por la que estos actúan no es
conocida para ninguno de ellos, su vinculación con el
control del crecimiento sugiere que las proteínas
oncogénicas interaccionan con los sistemas de
control del crecimiento de las células. Aunque este
proceso solo se conoce a grandes rasgos se pueden diferenciar
cuatro tipos de proteínas fundamentales involucradas en el
mismo: los factores de crecimiento, los receptores de los
factores de crecimiento, los transductores intracelulares de
señales y los factores de transcripción nuclear
(5).

• Factores de crecimiento:

Los factores de crecimiento son proteínas
secretadas por una célula que desempeñan su
función biológica en otra (9). Estos, junto a las
hormonas, facilitan el crecimiento celular actuando como agentes
transmisores de señales. De alguna manera los factores de
crecimiento dirigen la célula para que lleve a
término los pasos necesarios para crecimiento. Los
factores y las hormonas por si mismos ni proporcionan valor
nutritivo a la célula ni juegan un papel conocido en rutas
metabólicas. Solo su capacidad para unirse a receptores
específicos de la superficie celular le permite controlar
sucesos e inducir muchos tipos de respuestas en la célula
tales como movilización de reservas de energía y
diferenciación así como la entrada al ciclo de
crecimiento (5).

Entre lo factores de crecimiento más conocidos se
encuentran el factor de crecimiento epidérmico (EGF, del
inglés
epidermical), el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF, del inglés platelet derivated) y el factor de
crecimiento transformante (TGF, del inglés transforming
growing factors); todos iniciadores de cascadas de
señalización cuyo fin es la proliferación
celular (5,32).

c-sis:

Este oncogen es el único descubierto hasta el
momento que proviene de genes que codifican para factores de
crecimiento (5). El producto es una proteína secretada que
constituye la cadena l
del factor de crecimiento plaquetario (PDGF) (9,33) que
puede transformar las células que expresen el receptor
PDGF de manera natural (5).

El gen sis, que en humanos se encuentra en el cromosoma
22, fue descubierto en retrovirus de Sarcoma de simios y se
encuentra asociado a un tipo de Leucemia crónica
denominada mielocítica que se piensa sea consecuencia de
una translocación que activa el protooncogen
(9).

El PDGF, cuyas fuentes son
las plaquetas, endotelio, músculo liso, vascular y
células tumorales; actúa en células
específicas entre las que se encuentran los fibroblastos
entre otras. Su actividad biológica y, por tanto, su
potencial oncogénico radica en que es un agente
quimiotáctico, es decir, mantiene el crecimiento de
diferentes células mesenquimatosas (32).

La unión del PDGF con su receptor conduce a una
dimerización del mismo así como a la
fosforilación de residuos claves de tirosina iniciando de
esta forma la activación de sustratos de quinasas que
constituyen el aparato de señales (12).

• Receptores de factores de crecimiento:

Los receptores de factores de crecimiento: se
caracterizan por poseer una porción intracelular, una
transmembrana y una extracelular (32). Cuando la región
extracelular se une a un factor específico, el receptor se
activa y envía por medio de una cascada de eventos la
señal para que la célula se divida. En muchos casos
los receptores de superficie celular tienen proteínas
tirosinas quinasas integradas en su dominio
citoplasmático, estos trasmiten señales mediante la
fosforilación de residuos de tirosina en una o varias
proteínas dianas, iniciandose de este modo una cascada de
acontecimientos que requiere la participación de muchos
oncogenes con funciones diferentes (5). Otros receptores se
asocian a proteínas G (12), consideradas
históricamente como interruptores para receptores
hormonales (31).

La oncogenicidad de los receptores para los factores de
crecimiento resulta de la activación constitutiva
(independiente del ligando) de la actividad tirosina quinasa, es
decir cuando un gen que codifica para un receptor es alterado
este estará activo incluso sin estar unido a su ligando
(5,9).

De todos los oncogenes que codifican para receptores
hasta el momento conocidos hay una familia muy importante que da
lugar a toda una gama de receptores para factores de crecimiento
epidérmico (EGF-R), son los genes erbB, erbB-2, erbB-3 y
erbB-4 (9,34).

erbB (EGF-R):

El gen c-erbB codifica para el receptor quinasa del
factor de crecimiento epidérmico (9). Este EGF, entre
cuyas fuentes se consideran las glándulas submaxilares,
las de Brunner, las células parietales e incluso la orina
humana; actúa en células específicas tales
como epidérmicas, epiteliales y fibroblastos. Su actividad
biológica fundamental radica en que es un mitógeno
promotor de la queratinización y en segundo lugar inhibe
la secreción de ácido gástrico
(32).

El receptor de EGF EGF-R,del inglés epidermical
growing factor receptor) es una proteína que presenta un
extremo N-terminal extracelular, una simple región
transmembrana y un extremo C-terminal intracelular responsable de
la actividad tirosina quinasa. La dimerización del extremo
extracelular activa la actividad tirosina quinasa. La
oncoproteína, es decir la proteína codificada por
el oncogen c-erbB, mantiene la tirosina quinasa y el dominio
transmembrana pero pierde el N-terminal (región que se une
al EGF) y el extremo C-terminal. Ambas deleciones son necesarias
para la oncogenicidad, el cambio en el dominio extracelular
permite que la proteína se dimerice espontáneamente
y la pérdida del C-terminal aparta un dominio
citosólico que inhibe la actividad transformante. La
combinación de ambas mutaciones hace que se active el
receptor constitutivamente (9).

Además del oncogen erbB, que fue inicialmente
hallado en el retrovirus animal de la Eritoblastosis aviar (5),
existen otros de la misma familia que también poseen
potencial oncogénico. De estos el más conocido es
el erbB-2 (ó neu) que codifica para una
glicoproteína transmembrana (gp185neu) que con
actividad tirosina quinasa también relacionada con
receptores para factores de crecimiento. La
sobre-expresión de este oncogen se ha encontrado asociada
a cánceres de mama y ovario (6,34) aunque otros autores
(5) lo reportan en neuroblastomas. Además del erbB y el
erbB-2 hay otros miembros de la superfamilia tales como erbB-3 y
erbB-4 cuyas características y funciones son muy
parecidas.

• Transductores Intracelulares:

La clase más amplia de oncogenes deriva de los
genes que codifican proteínas que actúan a modo de
transductores intracelulares, proteínas que trasmiten
señales desde el receptor hasta su diana celular
(5).

Los transductores cuya función es más
conocida son las proteínas G, una de las cuales, la Gs
controla la síntesis de AMPc. Esta percibe si un ligando
está ocupando un receptor de la superficie celular, se une
al GTP y activa la enzima adenilato ciclasa que forma el AMPc,
entonces hidroliza el GTP y vuelve a su estado
inactivo (5,12). Una mutación en el gen elimina la
actividad GTPasa y estimula constantemente la síntesis de
AMPc que puede causar una proliferación no regulada de las
células de la pituitaria y por consiguiente la
formación de tumores en dicha glándula
(5).

Otro grupo de transductores intracelulares codifican
proteínas tirosina quinasas. Estas difieren de los
receptores de superficie celular en que son proteínas
nucleares o intracitoplasmáticas que carecen de dominio
transmembrana o extracelular. Muhas de estas proteínas
tirosina quinasas tienen miristato, una larga cadena de
ácido graso unida a la glicina de extremo N-terminal. Esto
hace que estén parcialmente unidas a la membrana
citoplasmática, de manera que su dominio quinasa se
encuentra en la misma región periplasmática que las
quinasa de los receptires. El modo de acción de las
proteínas es fosforilar residuos de tirosina y de este
modo trasmitir la señal hasta la proteína diana
correspondiente (5).

Dentro de este gran grupo conformado por los
transductores intracelulares de señales se tienen, como
vimos anteriormente, dos divisiones fundamentales con sus
oncoproteínas características. Entre los oncogenes
que codifican proteínas similares a la proteína G
está el oncogen ras que posee extrema importancia como se
verá posteriormente. En cuanto a los que codifican
proteínas con actividad tirosina quinasa el más
estudiado es el c-src (9).

ras:

Es una superfamilia de proteínas
monoméricas de 20 a 25 Kd, conocidas colectivamente como
p21ras , que juegan un papel fundamental en el proceso
de transducciòn de señales en la célula. La
superfamilia la integran seis genes diferentes relacionados con
funciones celulares tales como:

• señales mitogénicas :ras
• organización del citoesqueleto : rho y
  rac
• funciones nucleares : rab
• y un sexto miembro R-ras/TC21 que no se halla
  asociado a cánceres humanos (31).

De todos los integrantes de la superfamilia los
más estudiados e importantes son los de su mismo nombre.
El oncogen ras está vinculado al mecanismo de
señales cuyo fin es el crecimiento y diferenciación
celular. La ruta es iniciada cuando un ligando (EGF ó
PDGF) se une al receptor tirosina quinasa (EGF-R ó PDGF-R)
el cual se autofosforila y se activa a su vez este es capaz de
activar quinasas citosólicas (Ser/Thr quinasas) las cuales
pueden fosforilar otras quinasa creando una cascada de eventos de
fosforilación que culmina con la activación de
factores de la transcripción que deparan cambios en el
fenotipo celular, el cual varia de crecimiento a
diferenciación. También el eslabón final de
la cadena pueden constituirlo ciertas proteínas del
citoesqueleto que podrían influir directamente en la
estructura de la célula (6,31).

Se han encontrado genes ras en especies muy distantes
evolutivamente tales como Drosphila , Dictyostelium y levadura
(sacaromyces). Esta estabilidad evolutiva, solo superada por los
genes de las histonas, sugiere la función esencial de
estos genes para la célula eucariota (13).

La localización celular de los miembros de la
superfamilia ras es amplia, incluye miembros plasmáticos,
fracción microsomal y envoltura nuclear y depende de las
modificaciones post-traducionales que puedan ocurrir. Esas
modificaciones pueden ser clivajes proteolíticos,
reaciones de metilesterificación y reaciones de
lipidación. De todas estas variaciones la más
estudiada por su real importancia es la farnesilación. Se
plantea que la interacción de la proteína ras con
la membrana plasmática requiere una modificación en
su región carboxi terminal. Esta región es una
secuencia conocida como CAAX box que presentan todas las
p21ras y que está formada por una cisteina (C)
conservada , dos aminoácidos (AA) y el residuo carboxi
terminal. Estudios genéticos han demostrado que el oncogen
ras requiere intacta la secuencia CAAX box y por tanto las
propiedades para inducir una transformación maligna. La
naturaleza
bioquímica de la modificación ha sido investigada
por lo que se sabe que primero ocurre la farnesilación del
residuo de cisteina conservado (cis 186 en p21ras de
mamíferos ). Probablemente el donante del
grupo isoprenilo sea el farnesil pirofosfato, un metabolito
intermediario de la ruta del mevalonato. Luego de la
farnesilación ocurre un clivaje del carboxi terminal
farnesil cisteina (36).

De manera general Ras es considerada como un interruptor
molecular ya que posee una actividad GTPásica
intrínseca que la convierte de su forma activa (unida a
GTP) en su forma inactiva (unida a GDP) conectando o
desconectando así la cascada bioquímica
(17,31,36,37,38,39).

La proteína p21ras por si misma posee
una baja actividad GTPásica intrínseca por lo que
la interconversión de GTP a GDP es catalizada por una
proteína activadora de GTPasa denominada GAPs ( del
inglés GTPasa activating protein) la cual estimula la
habilidad de la p21ras para hidrolizar GTP. Estas
GAPs, que incluyen p120 GAP y neurofibromina, poseen un dominio
catalítico común pero incluye diversos elementos
reguladores que deben emparejar signos
externos diferentes para el control del gen ras (40). Otra
proteína también relacionada con la actividad de
Ras es la proteína GNRF (SOS) que estimula el
reemplazamiento de GDP por GTP reactivando la proteína
(31).

Autores como Thimothy M (41) plantean que por su
localización en la cara interna de la membrana y por la
modulación que ejerce sobre el metabolismo de
fosfolípidos, p21ras puede hacer las veces de
proteína G, en interacción directa o indirecta con
determinados receptores. No obstante no se han encontrado
evidencias de
que p21ras active fosfolipasa C o fosfolipasa
A2.

Hasta el momento, del gen ras se han se han descrito 3
alelos, de ellos H-ras y N-ras son los más frecuentes en
humanos siendo el menos frecuente el K-ras (31). Los tipos H-ras
y K-ras fueron aislados y caracterizados inicialmente de dos
cepas de retrovirus agudos de ratas designadas como Harvey y
Kristen responsables de la capacidad transformante del virus y el
N-ras fue detectado por primera vez en el tumor humano
Neuroblastoma (37). El gen H-ras, primer al que se le
estudió la estructura tridimensional de su proteína
por difracción de rayos x, se
localiza en el brazo corto del cromosoma 11 y su tamaño es
5 Kb, K-ras y N-ras presentan básicamente la misma
ubicación que H-ras pero en los cromosomas 12 y 1
respectivamente. En relación al tamaño el tipo
K-ras posee 45 Kb mientras que N-ras presenta 12 Kb
mostrándose gran diferencia entre los tres alelos
(13).

El producto activado del oncogen ras se ha encontrado en
más de un 15% de las formas más comunes de
cáncer humano (18).

La activación maligna de este protooncogen
está dada por mutaciones puntuales cuya alteración
estructural en la proteína es la sustitución de un
solo aminoácido resultando un aumento de su forma
activada, la unida al GTP. De esta manera la inducción del
potencial oncogénico del producto proteico puede tener
lugar mediante varias formas. Pueden ocurrir mutaciones en los
codones 12, 13 y 61 cuyo efecto bioquímicos la
inhibición de la actividad GTPásica de la
proteína o mutaciones en los codones 116 y 119 que
producen un incremento en el intercambio de GTP por
GDP.

Otra vía, ajena a los genes ras, que puede
afectarla actividad normal de estos es una deleción que
produce una inactivación de los genes GAPs cuyo resultado
es una disminución en la actividad de los mismos
(36).

También se han encontrado mutaciones, aunque
menos frecuentes en los codones 13, 59, 63 y 146 (37).

En estudios realizados se ha encontrado que existe una
fuerte correspondencia entre el tipo de tejido afectado y el
alelo activado siendo el H-ras el que predomina en tumores de
origen epitelial como piel,
hígado y mama. Los tumores mesenquimatosos (fibrosarcomas,
linfomas y de mesénquima renal) presentan activados
fundamentalmente los genes K-ras y N-ras (42).

También se han encontrado genes H-ras en tumores
benignos de piel (queratoacantomas) con una frecuencia mayor
(80%) que en carcinomas (40%) (43).

En la siguiente tabla se muestra la
incidencia del tipo de ras con el tumor asociado por lo que
podemos deducir que para el alelo K-ras los tumores relacionados
más comunes son el carcinoma de páncreas y los
adenomas y adenacarcinomas de colon así como los de
pulmón mientras que para N-ras son más frecuentes
los melanomas y carcinomas tiroideos. Los tumores asociados a
H-ras son principalmente los carcinomas de células
escamosas y los de vejiga (36).

c-src:

El virus del Sarcoma aviar, descubierto en 1911 por
Peyton Rous, fue el primer virus oncógeno conocido.
Presenta solo tres genes codificadores de proteínas: env
(proteína de la envoltura), gag (proteína de
estructuras
internas) y pol (enzima transcriptasa inversa). En los extremos
del genoma están las secuencias LTR (representaciones
terminales largas) donde se localizan: promotor, estimulador de
la transcripción de los genes virales y las señales
para la integración del virus en el huésped.
Luego de estudios realizados mediante mutaciones y deleciones se
concluyó que la oncogenicidad del virus se debe a una
secuencia génica, llamada v-src, que se encuentra situada
en el extremo de su ARN codificador y que no es necesaria para la
integración del virus en el huésped. Secuencias
homólogas a esta v-src han sido observadas en todos los
vertebrados, incluso en el hombre donde se denominan c-src. (11)
Otros autores como (5) plantean que existe este gen en
células de invertebrados.

El oncogen c-src, que se localiza en el cromosoma 20
(11), codifica para una proteína de 60 Kd de peso
molecular nombrada p60c-src. Esta posee actividad
tirosina quinasa y es capaz de autofosforilarse así como
de catalizar la incorporación de fosfato a otras
proteínas celulares. Una vez sintetizada en los
polirribosomas libres, la p60c-src pierde su meteonina
N-terminal y la glicina que pasa a ocupar esa posición
recibe un residuo de ácido mirístico
asociándose a la membrana citoplasmática (44). La
regulación de la proteína está dada por los
múltiples sitios de fosforilación que presenta. La
fosforilación de un residuo de tirosina en la
posición 527, a 6 aminoácidos del extremo
C-terminal, causa una gran reducción de su actividad
quinasa. Puede ser activado también mediante cambios en la
región N-terminal (que no forma parte del dominio quinasa)
(5,45), así como por la unión a la proteína
T-intermedia del Polyoma que se clasifica como un activador
constitutivo de la p60c-src tirosina quinasa
(5,46).

Las alteraciones génicas más comunes
observadas en c-src son la translocación y la
amplificación asociándose ambas a Leucemias
crónicas (11).

• Factores de transcripción nuclear:

Los factores de transcripción son
proteínas nucleares codificadas por conjunto de oncogenes
que se caracterizan porque sus productos ejercen efectos directos
sobre las funciones nucleares, fundamentalmente sobre la
transcripción. Estos factores de transcripción
pueden acelerar o retardar la tasa de iniciación de
transcritos por la RNA polimerasa II en dependencia del modo en
que actúen. Pueden unirse a dos tipos diferentes de
secuencias de DNA, a promotores que se localizan en el inicio de
la transcripción o enhancers que se hallan alejados del
sitio de iniciación y actúan a largas distancias.
De ambas formas esas oncoproteínas alteran el curso normal
de la transcripción induciendo una transformación
maligna en la célula (5).

Esta clase de oncogenes presenta gran variedad aunque se
distingue por su importancia el c-myc, los demás son el
c-jun, c-fos, c-erbA, c-myb entre otros.

c-Myc:

El oncogen c-myc está localizado en el cromosoma
8 de humanos . Fue descubierto por primera vez en el retrovirus
de la Mielocimatocis aviar , aunque se han encontrado secuencias
homólogas a c-myc en especies tan distantes como
Drosophila y Maíz (11).
Además de c-myc hay dos oncogenes más que integran
esta familia : el N-myc y el L-myc, que aunque menos importantes
también se relacionan con lesiones cancerosas
(14,18).

La proteína codificada por c-myc es una
proteína nuclear denominada HLH (Helix-Loop-Helix). El gen
presenta tres exones , el primero representa una cadena líder
(no trascribible) y los otros los códigos para el producto
proteico (9).

El proto-oncogen c-myc exhibe tres formas fundamentales
de activación : inserción retroviral ,
translocación cromosomal y amplificación
génica (9). La primera vía consiste en la introducción del genoma vírico en
las cercanías del gen y en muchos casos dentro del mismo,
pero esto puede suceder en varias posiciones y por tanto activar
el gen de diferentes formas. El DNA vírico , con sus
regiones LTR en cada extremo , puede insertarse en el extremo
5’ del trascrito del c-myc en orientación correcta u
opuesta a la dirección transcripcional. En el caso de
que la orientación sea la correcta , el LTR vírico
de la derecha actúa como un promotor para la
transcripción viral y la del oncogen ; y en el otro en que
la dirección trascripcional es contraria , el LTR se
comporta como un enhancer activando la transcripción a
distancia. En los dos mecanismos anteriores el retrovirus se
incluye en el exón 1, a diferencia de la tercera forma en
la que se inserta en la región 3’ actuando
nuevamente los LTR vírales en las secuencias promotoras
del c-myc a manera de enhancer. En todas las formas de
activación retroviral se codifica el producto normal del
oncogen solo que aparentemente porque hay elevados niveles de
Rana producto del efecto carcinógeno del virus
(5,9,47).

La translocación del c-myc es otro mecanismo por
el cual es activado el oncogen. Este normalmente se encuentra en
el cromosoma 8 y la translocación consiste por tanto en el
cambio a una nueva localización cromosomal. La
expresión de c-myc tiene que ser apagada para que los
linfocitos B y T inmaduros puedan diferenciarse tanto en
células B como T inmaduros , Al translocarse el gen al
locus Ig en células B o al locus TCR en las células
T, los cuales se expresan activamente, su nivel de
expresión aumenta desde 2 hasta 10 veces manteniendo las
células en un estado diferenciado. Es de esta forma que,
cuando ocurre translocación, c-myc expresa su potencial
oncogénico (9).

El tercer y último mecanismo, de los hasta ahora
conocidos , que puede activar al proto-oncogen c-myc es la
amplificación. Esta puede ocurrir de dos formas; en una
región del cromosoma dando origen a las regiones
homogéneamente teñidas o creando pequeñas
estructuras independientes denominadas cromosomas double-minute.
En ambos casos ocurre una sobre expresión de c-myc dando
lugar al producto en exceso (9).

Cada una de estas alteraciones génicas
está asociada a tumores específicas , por ejemplo
la translocación de c-myc se ve en el Linfoma de Burkitt y
la amplificación en carcinomas de mama , pulmón y
colon. El N-myc es característico de Neuroblastoma aunque
también se ha hallado activo junto a L-myc en carcinoma de
células pequeñas de pulmón. En estos dos
miembros de la familia myc
la alteración más observada ha sido la
amplificación (11,14,18).

c-fos y c-jun:

Ambos oncogenes pertenecen al grupo de los que codifican
factores de transcripción (9). De los dos el más
estudiado es el c-fos cuyo producto tiene alrededor de 380
aminoácidos, el resto de la familia la componen las
proteínas FosB, Fra1 y Fra2 con 338, 276 y 327
aminoácidos respectivamente (48).

El producto de c-fos (nucleoproteína de 59 Kd) en
asociación con el de c-jun funciona como un regulador
transcripcional jugando un papel fundamental en funciones
celulares tales como proliferación y
diferenciación. La unión de ambos forma un complejo
llamado AP-1que regula la actividad transcripcional de diversos
genes a través de secuencias específicas (41, 49,
50).

El factor AP-1 consiste en un dímero de dos
subunidades codificadas por los genes c-fos y c-jun, el cual
activa genes determinados por el sitio de unión a
promotores y enhancer con AP-1. Este de transcripción
reconoce una pequeña secuencia (TGACTCA) originalmente
identificada en enhancer de SV40, pero encontrada luego en
promotores y enhancer celulares (9).

La participación de c-fos en el control del
crecimiento se ha corroborado con experimentos realizados en
células quiescentes que han sido estimuladas con PDGF
observándose un aumento transiente (en 50 veces) del
producto del oncogen, luego desaparece. Después de la
inducción se asegura la pérdida debido a la
inestabilidad de la proteína como del ARN que la
codifica(5).

Existe un factor activador de plaquetas(PAF) que
incrementa la expresión de c-fos en células con
ciclo celular activo. Este PAF es un
glícerofosfolípido que es sintetizado por
neutrófilos, plaquetas, monocitos y células
endoteliales. Está relacionada con trombosis, inflamación, asma y shock
anafiláctico, y actúa directamente con receptores
específicos de membranas de algunas células,
incluso de linfocitos B. La inducción transiente de c-fos
es modulada por diferentes mecanismos entre los que se encuentran
el aumento de la concentración de iones calcio y el
potencial transmembrana. El receptor PAF presenta 324
aminoácidos y características de proteínas G
(49).

Métodos
para la detección de alteraciones en oncogenes y genes
supresores de tumores:

La reciente revolución
en la biología molecular y nuestra comprensión de
la genética del cáncer han contribuido al
desarrollo de una serie de pruebas
promisorias para evaluar el riesgo de una
persona de
padecer cáncer y para descubrir los tumores mientras son
lo suficientemente pequeños como para que la
cirugía sea efectiva. Así mismo se puede determinar
la mejor forma de quimioterapia para un paciente dado, o la
posibilidad de que la enfermedad recidive después de la
cirugía. En lugar de estudios invasivos estas pruebas
pueden ser realizadas con pequeñas muestras de orina,
sangre, tejidos entre otros que no afectan la integridad del
paciente. Los exámenes citológicos existentes son
insuficientes para determinar un pequeño número de
anormalidades celulares solamente en tamaño y forma, sin
embargo el análisis de ADN puede detectar
minúsculos grupos de
células cancerosas que son vertidas de un órgano
recientemente malignizado hacia los líquidos corporales,
ya sean orina , esputo o líquido excretado por los pezones
(51).

El hallazgo de alteraciones específicas en
oncogenes y genes supresores de tumores es fundamental para el
desarrollo de terapias, ya sean profilácticas o
terapéuticas, para el cáncer. En estudios
realizados en ADN tumorales las alteraciones más comunes
encontradas han sido mutaciones puntuales, deleciones largas y
pequeñas, amplificaciones, aberraciones cromosomales tales
como translocaciones e inversiones así como
pérdidas cromosomales (14). Numerosos métodos para
detectar los diferentes tipos de alteraciones han sido descritos.
Algunos sirven para más de una alteración, otros,
sin embargo, son específicos.

Las técnicas de hibridación molecular son
las más utilizadas como referencia, incluso cuando en la
actualidad la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)
brinda un sinnúmero de ventajas como que es capaz de
amplificar de 10-100 copias de una secuencia presentando una
altísima sensibilidad. Otros métodos, no menos
importantes, son los relacionados con las corridas
electroforéticas que separan el ADN de acuerdo a su peso
molecular (51).

1-Métodos basados en la hibridación
molecular:

La técnica conocida como hibridación de
ácidos
nucleicos es una poderosa aplicación de la especificidad
con que las moléculas de ADN y ARN forman estructuras
dúplex estables. Este método de apareamiento de
bases se usa para identificar y determinar la localización
de secuencias de ácidos nucleicos específicas
dentro de grandes secuencias como puede ser un genoma o mezclas de
moléculas de ARN.

Las condiciones físicas la hibridación
pueden modificarse con el fin de utilizar una de las hebras de
ácido nucleico como sonda (secuencia del gen que se quiere
determinar) para detectar su cadena complementaria (secuencia
blanco). En condiciones rigurosas (altas temperaturas y baja
concentración de sales) una sonda solo es hibridada por su
complemento perfecto. Esta misma hibridación pero bajo
condiciones menos rigurosas es útil para detectar
secuencias deseadas que son parcialmente semejantes pero no
idénticas.

Este método permite detectar alteraciones en
genes como los que ocupan nuestro estudio, los oncogenes y los
genes supresores de tumores, en ADN extraídos de
pacientes, utilizando como sondas los genes mutados.

Aunque la técnica de la RPC es mucho más
sensible estos métodos continúan siendo las
técnicas de referencia (52).

• Dot blot (hibridación en mancha):

Consiste en la inmovilización de ADN
desnaturalizado en un filtro de nitrocelulosa o nylon. Este
último es preferible ya que brinda la posibilidad de ser
deshibridado y vuelto a hibridar con nuevas sondas sin afectar su
integridad.

Una vez inmovilizado el ADN en la membrana esta se pone
en contacto con la sonda, que puede ser marcada tanto con
radioactividad como con fluoresceína o biotina, y de
existir complementariedad entre la sonda y la muestra el marcaje
persiste luego de una serie de lavados en el filtro
revelándose mediante una
autorradiografía.

Este método presenta una alta sensibilidad pues
es capaz de detectar pequeñas cantidades de ADN aunque
presenta probablemente problemas con la especificidad apareciendo
con frecuencia falsos positivos (53).

• Hibridación por Southern blot:

En este tipo de hibridación en vez de emplear
extractos crudos de la muestra clínica como punto de
partida se utiliza el ADN celular previamente purificado con
fenol: cloroformo y digerido con enzimas de restricción.
Los fragmentos de ADN son separados mediante electroforesis y
luego de someterlos a una desnaturalización son
transferidos a un filtro de nitrocelulosa o nylon donde es
hibridado a diferentes rigurosidades con sondas que pueden ser
radioactivas o no. La detección de los oncogenes y genes
supresores de tumores es entonces concluida con el revelado
mediante una autorradiografía.

El límite de detección de esta
técnica es bajo por lo que fácilmente pueden
obtenerse falsos negativos. Para evitar esto debe garantizarse
que la cantidad de ADN esté por encima del límite
de detección siendo necesarios entonces entre
5-10m g de ADN
(52).

• Hibridación in situ:

En este método las células o secciones de
tejido son hibridadas directamente en el portaobjetos usando
sondas de ADN o ARN tanto radioactivas como no radioactivas.
El ensayo es
capaz de detectar de 20-25 copias de genes o de sus respectivos
transcritos. Este límite de detección puede
reducirse tanto como hasta una copia por célula usando
procedimientos
especiales como es el caso de RCP in situ (52, 54).

• Hibridación in situ en filtros:

Esta fue la primera técnica diseñada para
estudios epidemiológicos siendo bastante empleada en
muchas investigaciones.
En este ensayo las células son ubicadas en un filtro y
lisadas, no se requiere la extracción previa ni la
purificación del ácido nucleico, el filtro es
hibridado con sondas radiomarcadas y autorradiomarcadas (52,
54).

2-Métodos basados en la Reacción en
Cadena de la Polimerasa:

Los métodos que se basan en la reacción en
cadena de la polimerasa son en la actualidad los más
comúnmente usados en las investigaciones de la
biología molecular pues gozan de una gran popularidad
debido a su alta sensibilidad analítica. Esta
técnica es capaz de detectar cantidades tan
pequeñas como entre 10-100 copias de un gen determinado en
la porción testada de las muestras clínicas
según (54). Otra de las grandes ventajas que ofrece el
método es la pequeña cantidad de muestra que
requiere, así como el escaso procesamiento de las mismas
antes de la amplificación.

Estos métodos presentan diferentes variantes, los
que usan cebadores específicos son muy eficientes para el
gen seleccionado. Esto se logra cumpliendo con extremos cuidados
los requisitos de lo parámetros de la reacción y
las condiciones de amplificación. Además, se deben
tomar precauciones contra las contaminaciones en la RCP que,
debido a la alta sensibilidad que presenta la técnica
constituyen un serio problema (53).

3-Métodos basados en corridas
electroforéticas:

Las moléculas de ácidos nucleicos, como la
mayoría de las macromoléculas biológicas,
poseen carga que les confiere la propiedad de migrar en un
campo
eléctrico según la orientación del mismo
y la magnitud de la carga. Cada molécula de ADN o ARN
contiene un grupo fosfato cargado negativamente que une una
molécula con la siguiente en una cadena. Al someter un
fragmento de ADN a un campo eléctrico establecido de
negativo a positivo las cargas negativas de los grupos fosfato
obligan al resto de la molécula a migrar. De esta manera
el fragmento de ADN se desplazará más o menos en
dependencia de la cantidad de cargas negativas que presente, es
decir, de su peso molecular (55).

La electroforesis en geles de agarosa es el
método estándar más usado para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN. La técnica es
simple, rápida y capaz de distinguir ADNs mezclados que no
pueden ser separados por otros procedimientos como la
centrifugación en gradientes de densidad. La
distribución del ADN en el gel puede ser
determinada directamente ya que a la mezcla de ADNs se le
añade Bromuro de etidio. Un poderoso agente intercalante
que fluorece a la luz ultravioleta. Por esta vía es
posible detectar con gran sensibilidad hasta 1ng de ADN en el
gel.

Existe una relación lineal entre el logaritmo
(Log10) de la movilidad electroforética del ADN
y la concentración de agarosa en el gel. Esto nos da la
idea de que utilizando geles de diversas concentraciones se
pueden separar fragmentos de ADN de distintos rangos en cuanto a
sus pesos moleculares. Las tres conformaciones del ADN (circular
cerrado, circular relajado y lineal) presentan diferentes
movilidades en el gel. En algunas condiciones la primera forma
migra más rápido que la última, en otras
esto ocurre a la inversa. Se conoce que a bajos voltajes la
migración del ADN lineal es proporcional al
voltaje aplicado, sin embargo, el rango de separación del
ADN decrece con el incremento del voltaje.

Los geles de poliacrilamida son usados en el
análisis y preparación de fragmentos de ADN menores
a 1Kb. En dependencia de la talla del fragmento como tal
será el rango de concentración del gel (de 3,5% a
20%) (56).

Algunos ejemplos de experimentos que utilizan estas
técnicas:

De forma experimental todas las técnicas
señaladas anteriormente se pueden vincular y ser
utilizadas de manera combinada para experimentos más
específicos como los que mencionamos a
continuación.

• Screening de pérdida de
  heterocigocidad:

Todos los organismos diploides tienen dos copias de cada
cromosoma pero la secuencia de ADN de estas no es exactamente la
misma. Cuando el individuo heredó el mismo alelo del padre
y de la madre se considera homocigótico, sin embargo, si
el individuo tiene dos alelos diferentes es denominado
heterocigótico. La diferencia entre individuos
heterocigóticos y homocigóticos se puede detectar
por Southern blot basándose en el principio de que un
alelo contiene un sitio de restricción para una
endonucleasa específica y el otro no. Esto resulta en dos
bandas diferentes en el autorradiograma para dos fragmentos de
ADN de tallas distintas. Si se utiliza una secuencia de ADN
específica (marcador de ADN) en el tumor de estos
individuos la pérdida de heterocigocidad podría
resultar un dato importante y decisivo en el estudio.

La pérdida del material genético
está determinada por comparación de los genotipos
constitucional y del tumor. La pérdida de heterocigocidad
ha sido estudiada primero por análisis de Southern blot
usando marcadores de polimorfismo de grandes fragmentos de
restricción, los cuales más tarde fueron mejorados
por el uso de numerosas sondas polimórficas: marcadores
multialélicos de ADN con número variable de
repeticiones en tandems. El reciente uso de los marcadores
microsatélites ha mejorado el screening, ya que son
altamente polimórficos (57).

• Screening de mutaciones:

Los métodos de screening testan una muestra para
cualquier desviación de la secuencia estándar. Para
este propósito puede usarse la secuenciación
directa, pero el trabajo es
duro y caro si son muchas muestras a examinar. Los métodos
más empleados para el screening de mutaciones son el
análisis de Polimorfismo de Simple Cadena y la
electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes. Ambos
métodos detectan mutaciones puntuales y pequeñas
deleciones, inserciones o mutaciones regulatorias las cuales
afectan la transcripción o la traducción de la proteína. El ensayo
denominado de truncación de la proteína puede
detectar mutaciones por deleciones o inserciones. Para determinar
la naturaleza de la alteración luego de ser detectada por
cualquier método es necesario secuenciar (57).

– Polimorfismo Conformacional de Simple Cadena: El ADN
de simple cadena tiende a plegarse y formar estructuras complejas
estabilizadas por enlaces intramoleculares (puentes de hidrógeno) entre los pares de bases. La
movilidad electroforética de estas estructuras en los
geles no desnaturalizantes dependerá no solamente de la
longitud de sus cadenas sino también de sus
conformaciones, las cuales están determinadas pos su
secuencia de ADN. Para este método las muestras de ADN
amplificadas son desnaturalizadas y corridas en un gel de
poliacrilamida no desnaturalizante. Los cebadores pueden ser
marcados con radioactividad o los productos no marcados pueden
ser detectados con cualquier tipo de tinción. Esta
análisis es ineficiente para fragmentos mayores de 200
pares de bases y el patrón de bandas observado es muy
dependiente de las condiciones (57).

– Electroforesis en geles de gradientes
desnaturalizantes: En este método, el ADN dúplex
esforzado a migrar a través de un gel donde las cadenas se
funden y se separan, después de lo cual el ADN
desnaturalizado no migra mucho más. La diferencia entre un
simple par de bases entre el ADN dúplex normal y mutante
es suficiente para que los fragmentos amplificados por la RCP
migren a diferentes posiciones en el gel. En una variante de este
método, la electroforesis en gel constante
desnaturalizante, se calcula la concentración
específica de desnaturalizante a la cual el ADN de doble
cadena normal y el mutante migran diferentemente. Entonces el gel
de poliacrilamida es hecho en esa concentración de
gradiente desnaturalizante. Esta variante mejora la
resolución ya que la separación entre el ADN normal
y el mutado incrementa con el tiempo de corrida de electroforesis
(57).

– Ensayo de truncación de la proteína:
Este test es
específico para las mutaciones de marco de lectura o sin
sentido que truncan un producto proteico. El procedimiento
consiste en hacer un ADN celular mediante la RCP, usando un
cebador específico que leva en el extremo 5´ un
promotor T7 seguido de una secuencia iniciadora
eucariótica. A partir de ese ADN se realiza una
transcripción-traducción acoplada in vitro, la cual
usa el promotor T7 para hacer un ARNm y el iniciador de la
traducción para traducirlo. Al correr este producto
proteico se detectan las mutaciones que provocan el truncamiento
ya que resultan en productos cortos, cuyas tallas revelan la
posición de las mismas. Este método presenta como
limitación que solo detecta ciertos tipos de
mutación y no mutaciones que no cambien el sentido (si la
mutación cambia un aminoácido pero no afecta el
resto de la traducción de la proteína)
(57).

– Secuenciación del ADN: Para la
secuenciación, los fragmentos de ADN y un primer marcado
(radiomarcado o marcado con fluoresceína) son calentados
para desnaturalizar el ADN de doble cadena y permitir la
hibridación de los cebadores. Alternativamente, el ADN de
simple cadena es aislado por el uso de cebadores de la RCP
bipotinilados los cuales son incorporados en los fragmentos de
ADN resultantes de la reacciones de la RCP. Seguidamente se la
adiciona una mezcla de ADN polimerasa y los deoxinucleotidos de
las cuatro bases (dGTP, dCTP, dATP, dTTP). Los híbridos
ADN-cebadores y esta mezcla son divididos en cuatro tubos que
contienen los cuatro dideoxinucleótidos (ddGTP, ddCTP,
ddATP, ddTTP) que actúan como terminadores de cadena. Como
estos son incorporados aleatoriamente, todos los productos de
todos los tamaños posibles están representados
entre las cadenas de ADN recién sintetizadas. Ellos son
sometidos a una electroforesis en un gel de poliacrilamida y
expuesto a un filtro autorradiográfico. Ya en esta forma
se procede a secuenciar de manera manual o
fluorescente automatizada (57).

• Detección de mutaciones
  específicas:

Los métodos de detección de mutaciones
testan una muestra de ADN para la presencia o ausencia de una
mutación específica. Esto es muy útil para
la detección de mutaciones que aparecen frecuentemente en
la población para enfermedades donde los individuos
más afectados tienen solamente una mutación
específica y para el diagnóstico dentro de una familia. Cuando
la mutación crea o abole un sitio de restricción
natural el test de restricción de los fragmentos de ADN
puede ser mejorado. Las muestras de ADN pueden ser amplificadas
por RCP y los productos digeridos con las enzimas de
restricción apropiadas. Las diferencias entre el ADN
normal y el mutante pueden ser detectadas por las diferentes
tallas en los fragmentos de restricción. Este
método es adecuado particularmente para pronósticos ya que es simple y
rápido permitiendo procesar muchas muestras.

Para detectar deleciones o inserciones los cebadores
deben ser diseñados y localizados en un lado de la posible
mutación luego de la amplificación por RCP los
fragmentos de ADN son corridos en geles de poliacrilamida y los
fragmentos normales y mutados son comparados de acuerdo a sus
tallas moleculares. Este método brinda más
resolución para deleciones e inserciones de más de
un par de bases (57).

Avances en la
terapia contra el cáncer:

Con los conocimientos actuales es necesario buscar
terapias específicas que nos sirvan de ayuda para
controlar, ya sea profiláctica o asistencialmente, el
cáncer. Múltiples intentos se llevan a cabo
día a día con este fin, pero las particularidades
de cada gen implicado en la aparición de la neoplasia son
definitorias, por lo que esta búsqueda se hace muy
difícil.

Una de las estrategias
seguidas es bloquear la actividad de las proteínas ras
inhibiendo la enzima farnesil transferasa que cataliza la
farnesilación del extremo CAAX box. De esta manera se
bloquea la maduración de la proteína y se revierte
la transformación maligna dependiente de ras. Estas
drogas no
afectan células normales y en estudios realizados en
animales no son tóxicas.

Otra forma de terapia es la que utiliza la capacidad
viral de infectar células y sintetizar en las mismas
proteínas virales. Esto se ha aplicado con Adenovirus,
virus que contienen ADN, a los que se le ha insertado genes
determinados como el de p53. Cuando el virus atenuado infecta la
célula cancerosa o precancerosa y se sintetizan las
proteínas virales, quedará libre también en
la célula el producto del gen p53 para actuar en lugar del
que se encuentra desactivado o funcionando incorrectamente. De
esta manera queda solucionada la pérdida de
heterocigocidad en estas células (58).

Una variante importante a seguir en la lucha contra el
cáncer es la utilización de vacunas que
logren que el sistema inmune reconozca y ataque las
células cancerosas. Numerosas estrategias son seguidas con
este propósito. Entre las más interesantes
está la que utiliza ácidos nucleicos. Este tipo de
vacuna contiene copias de ARN que dirigen la síntesis de
determinados antígenos presentes en las células
tumorales que alertan al sistema inmune de la presencia de un
tumor. Otra opción de vacuna la brindan las mismas
células cancerosas que tras ser desactivadas o convertidas
en extractos son capaces de activar la inmunidad. Esta respuesta
se puede aumentar manipulando genéticamente las
células, de forma que secreten interleucinas y otras
citocinas que disparen la producción de anticuerpos contra
el cáncer. La utilización de péptidos
tumorales (fragmentos de proteínas extraídas del
tumor e inyectados al paciente) es otra de las vías para
levantar la respuesta inmune a la enfermedad. Además de
todas las posibilidades anteriores se estudia la
producción de vacunas con vectores víricos y
bacterianos. La vacuna como tal consistiría en inyectar en
virus y bacterias atenuadas los genes que fabrican los
antígenos tumorales. El paciente produce defensas contra
esos microbios así como contra los antígenos
tumorales que sintetiza (59).

En investigaciones realizadas por Allen Oleff y cols.
sobre el comportamiento
de las proteínas de los principales oncogenes y genes
supresores de tumores en células de mamíferos
asociados con cánceres humanos se estudian las posibles
terapias para eliminar las alteraciones que provocan la
malignización celular (58).

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Leticia Cristina Bequer Mendoza

Licenciada en Biología

Isis Noelia Muñiz Bernal

Licenciada en Biología

Laboratorio Biología Molecular

ISCM VC – Cuba