Selección de microorganismos capaces de biodegradar fracciones pesadas del petróleo

2. Resumen
4. Materiales y
   métodos
5. Resultados y
   discusión
6. Conclusiones
7. Bibliografía

RESUMEN

En la industria del
petróleo, la presencia de compuestos
pesados constituye un problema tanto para la extracción,
como para la transportación y refinación, siendo
mayores los daños al medio
ambiente, lo que implica disminución del beneficio
económico reportado por los petróleos con estas
características. En este caso se encuentran la
mayoría de los petróleos cubanos.

Es por ello que el presente trabajo tiene
como objetivo
fundamental la selección,
aislamiento e identificación de microorganismos con
capacidades para biodegradar fracciones pesadas del petróleo
(resinas y asfaltenos), como una alternativa para la
solución de los problemas
generados por estos compuestos en la industria petrolera
cubana.

La selección se realizó a partir de dos
fuentes:
muestras de suelos
contaminados tomadas en diferentes sitios del país y cepas
conservadas con capacidades biodegradadoras ya conocidas.
Las muestras se cultivaron en un medio salino con un
petróleo crudo pesado como única fuente de carbono
durante 14 días.

Al concluir se extrajo la fase orgánica de cada
cultivo y se determinó su composición en fracciones
del petróleo (hidrocarburos
saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos) mediante
cromatografía de elusión,
calculando la tasa de biodegradación de cada
fracción para seleccionar aquellos microorganismos que
fueron capaces de oxidar las fracciones pesadas en más de
un 20% sin afectar los hidrocarburos saturados y
aromáticos. Las cepas seleccionadas fueron identificadas
hasta especie según el Manual Bergeys,
1994.

Como resultado del estudio se seleccionaron dos cepas
bacterianas capaces de biodegradar resinas y asfaltenos:
Pseudomonas aeruginosa 8g-2 y Bacillus circulans
271/1.

INTRODUCCION

Existe un gran número de microorganismos
heterotróficos capaces de utilizar los hidrocarburos del
petróleo como fuente de carbono y energía para su
crecimiento, produciendo dióxido de carbono, agua, biomasa
y otros productos
parcialmente oxidados menos tóxicos. (Davis, 1967).

Estos microorganismos presentan una especificidad
biodegradadora hacia los diferentes componentes del
petróleo. Los hidrocarburos saturados son los más
propensos a la oxidación y le siguen los hidrocarburos
aromáticos. (Whyte, Bourbonniére y Greer, 1997).
Las resinas y asfaltenos se consideran como compuestos
resistentes a la biodegradación. Esto se debe a que su
estructura es
muy compleja y deben intervenir diferentes tipos de enzimas que sean
capaces de oxidar tanto alcanos lineales
como cíclicos, hidrocarburos aromáticos,
poliaromáticos y heteropoliaromáticos. (Pineda y
Mesta, 2001)

En la industria del petróleo, la presencia de
compuestos pesados constituye un problema tanto para la
extracción, como para la transportación y
refinación, siendo mayores los daños al medio
ambiente, lo
que implica disminución del beneficio económico
reportado por los petróleos con estas
características. (Pineda y Mesta, 2001). En este caso se
encuentran la mayoría de los petróleos cubanos.

Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo
fundamental la selección, aislamiento e
identificación de microorganismos con capacidades para
biodegradar fracciones pesadas del petróleo (resinas y
asfaltenos) como una alternativa para la solución de los
problemas generados por estos compuestos en la industria
petrolera cubana.

MATERIALES Y METODOS

1. En todos los ensayos se
   utilizaron reactivos puros para análisis así como, medios de
   cultivos para microbiología producidos por la empresa
   BIOCEN. Para los ensayos de biodegradación se
   utilizó un crudo de petróleo extrapesado y
   altamente sulfuroso, con las siguientes
   características físico-químicas:
   densidad
   0,9937 g/cm3, gravedad
   API 10,9o, viscosidad
   cinemática a 40oC 3566
   mS/cm, azufre total 5.72 %, Asfaltenos en C7
   completo 19.98 %.

2. Reactivos, materias primas y medios de
   cultivos

   Los muestreos de suelos contaminados con hidrocarburos se
   realizaron según la norma ISO
   10381-6:1993, en diferentes sitios del país donde
   existían derrames antiguos, mayormente
   asfaltenizados.

3. Muestreo

   Para la selección de microorganismos a partir de
   muestras de suelo, se
   pesaron 10 g de muestra y se
   añadieron en 100 mL de solución salina
   fisiológica con unas gotas de Tween 80, agitando en
   zaranda durante 1 hora a 30 oC y 150
   rmin-1. Se tomó 1,0 mL del sobrenadante y
   se inoculó en 30 mL de caldo nutriente, incubando en
   zaranda durante 24 horas a 30 oC y 150
   rmin-1.

   Se probaron, además, tres cepas de la especie
   Pseudomonas aeruginosa: 6g-21, 3g-2 y 8g-2
   pertenecientes al cepario del Centro de Investigaciones del Petróleo, las
   cuales fueron previamente adaptadas al consumo de
   asfaltenos como única fuente de carbono y
   energía durante un año (Mesa y col., 2003),
   así como las cepas aisladas de las muestras de suelo
   que dieron mejores resultados en el experimento anterior. Las
   cepas se sembraron en tubos de agar nutriente y se incubaron
   durante 24 horas a 30oC.

   Al concluir la incubación, se arrastró la
   biomasa obtenida sobre la estría y se suspendió
   en 30 mL de caldo nutriente, incubando en zaranda durante 24
   horas a 30 oC y 150 rmin-1.

4. Preparación de inóculos microbianos

   Los cultivos obtenidos en el punto 3, fueron inoculados en
   erlenmeyers estríados de 500 mL que contenían
   270 mL de medio salino de Solana (sulfato de sodio 2,0 g,
   fosfato dipotásico 0,5 g, cloruro de amonio 1,0 g,
   nitrato de potasio 2,0 g, sulfato de hierro
   (II) 0,01 g) y 1% de petróleo crudo (Solana, 1985).
   Los cultivos se incubaron en zaranda durante 14 días a
   30 oC y 150 rmin-1.

5. Ensayo de biodegradación

   En el caso de las muestras de suelo, al finalizar la
   incubación, se tomó 1,0 mL de cada cultivo y se
   realizó el aislamiento de las bacterias
   aeróbicas presentes según lo indicado en la
   norma ISO 6222: 1988.

6. Aislamiento de microorganismos

   A todos los cultivos obtenidos del ensayo de
   biodegradación, se les realizó una
   extracción de la fase orgánica presente
   utilizando n-hexano como solvente y posterior
   evaporación, determinándose el contenido de
   hidrocarburos saturados y aromáticos por
   cromatografía de elusión según la norma
   ASTM D2549/2000 modificada así como el contenido de
   asfaltenos con n-pentano según la norma ASTM D
   2007/2000.

7. Análisis químico

   De acuerdo a las concentraciones de cada uno de los
   componentes del petróleo (hidrocarburos saturados,
   aromáticos, resinas y asfaltenos) determinados para
   cada muestra, se calculó la tasa de
   biodegradación de cada fracción según la
   siguiente expresión:

   Cb – Cm

   TB = ___________ * 100

   Cb

   Donde:

   TB: tasa de biodegradación de cada fracción
   expresada en %

   Cb: Concentración del blanco (%)

   Cm: Concentración de la muestra (%)

8. Determinación de la tasa de
   biodegradación
9. Selección de microorganismos

Se realizó teniendo en cuenta los siguientes
parámetros:

1. Se prefirieron las muestras que crecieron en 24 horas o
   menos

2. Tiempo de crecimiento de cada cepa.

   Se prefirieron los microorganismos que produjeron
   concentraciones de 108 células/mL o
   superiores

3. Concentración celular obtenida (producción de biomasa)
4. Capacidad de biodegradación de fracciones pesadas
   del petróleo (resinas y asfaltenos).

En este caso se seleccionaron los microorganismos que fueron
capaces de biodegradar las resinas y los asfaltenos por encima
del 20%. Estas tasas de biodegradación se fijaron
empíricamente, de acuerdo a los resultados obtenidos, ya
que en la literatura consultada no se
encontraron reportes sobre la oxidación microbiana de este
tipo de estructuras.

d) Tasa de biodegradación de los hidrocarburos
saturados y aromáticos menor del 10%. Se consideró
este valor como no
significativo ya que se reporta la transformación
mayoritaria de estos compuestos en tiempos menores de 14
días. (Kanaly y Harayama, 2000; Pineda y Mesta, 2001)

1. Identificación de microorganismos

La identificación de las bacterias aeróbicas
aisladas de las muestras de suelos se realizó según
el Manual Bergeys, 1994

RESULTADOS Y
DISCUSION

Selección de microorganismos a partir de muestras de
suelos e identificación de la cepa seleccionada

En la tabla 1 se observan los resultados correspondientes al
estudio de las muestras de suelos contaminados con
hidrocarburos.

Tabla 1. Estudio de biodegradación de muestras de
suelos

Como puede apreciarse, la mayoría de las muestras
estudiadas no fueron capaces de biodegradar asfaltenos y resinas
en mas de un 20%, por lo que fueron eliminadas del estudio Este
resultado es lógico si tenemos en cuenta la complejidad de
estas estructuras y su resistencia a la
biodegradación. (Pineda y Mesta, 2001). Solamente las
muestras 269, 270 y 271 cumplieron con este requisito, entre
ellas, la 270, degradó la fracción de hidrocarburos
saturados en más de un 10%, por lo que también fue
eliminada.

Las muestras de mejores resultados fueron 269 y 271, de
acuerdo a todos los parámetros evaluados, ya que son las
de crecimiento más rápido (24 horas), mayor
concentración celular (108-1010
células/mL) y capacidad para biodegradar asfaltenos mayor
del 20%, sin afectaciones para los fracciones de hidrocarburos
saturados y aromáticos.

Ambas muestras presentaron un comportamiento
similar ya que degradan asfaltenos pero no resinas. Por tanto,
entre las dos se decidió escoger la muestra 271, compuesta
por una sola cepa (271/1), la cual exhibió mayor
producción de biomasa (1010 células/mL),
teniendo en cuenta que este constituye un parámetro muy
importante si se quiere desarrollar el proceso
biodegradativo a mayor escala.

Después de realizar las pruebas de
identificación, la cepa seleccionada fue identificada como
perteneciente a la especie Bacillus circulans, la cual es
típica de la microflora del suelo (Manual Bergeys, 1994).
Al género
Bacillus pertenecen un gran número de
microorganismos degradadores de petróleo (Davis, 1967) y
esta especie en específico ha sido reportada anteriormente
en suelo costero impactado con hidrocarburos de la Bahía
de La Habana, lugar cercano al sitio de muestreo.

En dicho trabajo, se comprobó que los
microorganismos pertenecientes a esta especie fueron capaces de
crecer en petróleo crudo, queroseno y naftaleno
(Ríos, 2001), lo que nos da una medida de su versatilidad
nutricional con respecto a los compuestos hidrocarbonados. Esta
cepa, además, es capaz de formar esporas, lo que la hace
más resistente a ambientes agresivos.

2. Estudio de biodegradación de cepas
pertenecientes al cepario CEINPET

En la tabla 2 se observan los resultados del estudio de
biodegradación realizado a las cepas escogidas del cepario
CEINPET.

Tabla 2. Estudio de biodegradación de las
cepas pertenecientes al cepario CEINPET

Según nos muestra la tabla, entre las cepas
pertenecientes al cepario CEINPET, la 8g-2 es la de mejores
resultados, ya que es capaz de biodegradar tanto resinas como
asfaltenos a una concentración superior al 20 %, sin
afectar los hidrocarburos saturados y
aromáticos.

Al igual que el resto de las cepas estudiadas, presenta
un crecimiento rápido (24 horas) y buena producción
de biomasa (1010 células/mL). Los otros dos
microorganismos provenientes del cepario solo degradan resinas y
en una proporción mucho menor. Por tanto, entre las tres,
se seleccionó la 8g-2 como mejor biodegradadora de
fracciones pesadas del petróleo.

La especie Pseudomonas aeruginosa, a la que
pertenece esta cepa, también se encuentra entre las de
mayor resistencia a ambientes agresivos y capacidad nutricional
para mineralizar gran variedad de hidrocarburos del
petróleo. Se reporta con capacidades para degradar tanto
compuestos alifáticos como aromáticos y
poliaromáticos en condiciones aeróbicas,
microaerófilas y desnitrificantes. (Whyte, Bourbouniere y
Greer, 1997; Chayabatra y Ju, 2000).

CONCLUSIONES

De los estudios realizados se seleccionaron las cepas
Pseudomonas Aeruginosa 8g-2 perteneciente al cepario del
CEINPET y Bacillus circulans 271/1 aislada de suelo
contaminado con hidrocarburos de la Refinería Ñico
López, las cuales fueron capaces de biodegradar más
del 20% de las fracciones de resinas y asfaltenos en 14
días de cultivo, sin afectar los hidrocarburos saturados y
aromáticos.

Estas cepas presentaron, además, las mayores
velocidades de crecimiento y producción de
biomasa.

BIBLIOGRAFIA

• "Bergeys Manual of Determinative Bacteriology",
  9th. Ed., Williams and Wilkins, USA,
  1994
• Chayabatra, Ch. and Ju L. K. " Degradation of n-
  hexadecane and its metabolites by Pseudomonas aeruginosa
  under microaerobic and anaerobic denitrifying conditions" Appl.
  Env. Microb. Vol. 66, No.2, p. 493- 498, (2000)
• Davis, J.B. "Petroleum microbiology". Ed. Elsevier.
  Inglaterra.,
  1967.
• Kanaly, R. A and Harayama Sh. "Biodegradation of
  High-Molecular-Weight Polyciclic Aromatic Hydrocarbons by
  bacteria". Journal of Bacteriology, Vol. 182, No. 8, p.
  2059-2067, April 2000
• Mesa, D, Musacchio A., Martínez A. L., Ibarra
  E. "Desarrollo
  de un proceso biológico para degradación de
  hidrocarburos en aguas residuales del proceso de
  extracción de petróleo" II Jornada
  Científica y de Calidad.
  CEINPET, Cuba,
  2003
• Norma ASTM D 2007/2000. "Standard test method
  for determination of asphaltenes by elution
  cromatography"
• Norma ASTM D 2549/2000. "Standard test method for
  separation of representative aromatics and nonaromatics
  fractions of high-boiling oils by elution
  cromatography"
• Norma ISO 10381-6: 1993 (E). " Guía para la
  colección, manejo y conservación del suelo para
  procesos
  microbianos aeróbicos en el laboratorio"
• Norma ISO 6222: 1988 (E) " Calidad del agua –
  Enumeración de microorganismos viables– Conteo de
  colonias mediante inoculación en agar
  nutriente"
• Pineda-Flores, G.; Mesta-Howard, A.M. "Petroleum
  asphaltenes: generated problematic and posible biodegradation
  mechanisms" Rev. Latinoamericana de Microbiología. Vol.
  43. No. 3, p. 143-150, 2001
• Ríos, Y. "Identificación y
  caracterización de bacterias pertenecientes a la
  microbiota de un suelo impactado de la Bahía de la
  Habana" Tesis de
  Diploma. Facultad Biología. Universidad
  de La Habana. Cuba, 2001
• Solana, A.M. "Biodegradación marina en
  la
  contaminación por hidrocarburos". Mundo
  Científico. 1(8): 913-920, 1985.
• Whyte, L.G., Bourbonniére, L y Greer, C.W.
  "Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotropic
  Pseudomonas strain possessing both alkane (alk) and
  naphtalene (nah) caabolic pathways". App. Env. Microbiol.
  63(9): 3719-3723, 1997.

Autor:

Diana Mesa Penín

Regla M. García Laurreiro

Xiomara Grillo Barreira

Ricardo Campos Rodríguez

Dolores Ruiz Martínez

Danae Dorta López

Yaíma Barrios San Martín

Centro de Investigaciones del Petróleo.
Washington # 169 esq. Churruca.

Cerro. C. Habana. Cuba 12 000