- Las técnicas
moleculares. Basamentos teóricos - Tipos de técnicas
moleculares - Marcadores moleculares basados
en la reaccion en la cadena de la polimerasa
(PCR) - AFLPS: polimorfismo en la
longitud de fragmentos amplificados (ciat
2001) - Microsatélites ( Roca y
Ramírez,1999) - Aplicación de las
técnicas moleculares para la identificación de la
diversidad en musa - Otras técnicas aplicadas
en musa - Perspectivas a
futuro - Bibliografía
- Anexos
En muchos aspectos, las Musàceas son
consideradas como un producto de
vital importancia, ya que tanto en el ámbito comercial,
como agronómico, incluyendo su valor
nutricional, representa una parte importante en el
desenvolvimiento de distintas comunidades en América.
Específicamente en Venezuela, la
importancia se refleja en las estimaciones del consumo por
persona
año, en el caso del cambur es de unos 33 Kg mientras que
en el plátano es de unos 20 Kg, aunado al hecho de un
marcado tradicionalismo en su consumo.
Sin embargo todo esto tiene como marco desarrollo, un
referencial tecnológico, tradicional o tradicional
mejorado, con bajos y medianos rendimientos, con elevados niveles
de perdidas por deficiente manejo tanto en cosecha como en
post-cosecha (DEL VALLE, comunicación personal, 2002),
apuntando a la la necesidad de programas de
investigación donde el principal objetivo, sea
la competitividad
de las Musàceas frente a otros mercados.
La inclinación de la investigación a
raíz de los últimos descubrimientos, se ha enfocado
en buscar la información necesaria para saber porque y
como, podemos llegar a ser más productivos, a obtener
mayores rendimientos, y a establecer diferencias entre los
distintos productos que
se pueden llegar a obtener para ajustarlo a las condiciones que
se tengan presentes tanto agronómicas como
económicos.
El avance acelerado, de las nuevas tendencias
tecnológicas, ha aumentado las preguntas y complicados las
respuestas, trayendo consigo la gran responsabilidad de obtener los conocimientos
necesarios, para establecer conclusiones razonables, adecuados al
momento y lugar donde se den. Como consecuencia la agricultura ha
querido obtener los mayores beneficios, y específicamente
en lo relacionado con las Musàceas, se ha movido el
interés, de que estas tecnologías
sean aplicadas, para lograr el aprovechamiento y la
simplificación del entendimiento de los distintos factores
que se mueven dentro de la producción de este rubro. (Del Valle.
Comunicación personal. 20002).
Una de las grandes ramas científicas donde el
desarrollo tomo un ritmo mas acelerado, y de donde distintos
aspectos de la agricultura han sacado sus mayores progresos; es
la biología.
En la segunda mitad del siglo XX ha evolucionado mas deprisa y
más espectacularmente que ninguna otra rama del conocimiento.
De la simple observación y clasificación de los
fenómenos biológicos, hemos pasado a una
comprensión a nivel molecular de las leyes que
gobiernan los organismos vivos, inaugurándose la nueva
etapa de la "biología molecular. (Contreras,
2001).
Lo anterior trajo consigo, la creación de nuevas
metodologías, revolucionarias, que han permitido el
conocimiento, a profundidad de los materiales
vegetales, ya que estos solo se han venido estudiando por sus
características morfológicas (taxonomía), lo cual requiere observaciones
muy exhaustivas de los organismos, en diferentes estados de
desarrollo. Los criterios que se utilizan, carecen muy a menudo
de definición, y objetividad, y en cualquier caso, son
marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales.
(Claros, 2002).
El uso de plantas en
cultivo desde la época Pre-histórica, ha
incentivado el hombre a la
selección de los mejores tipos de plantas,
basados en esos criterios de tipo morfológico (fenotipo).
Las mejoras eran posibles gracias a la variabilidad genética,
a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la
eficacia e
intensidad de la selección aplicada, y al tiempo
necesario para realizar un ciclo de selección. Sin embargo
quedaban muchos aspectos desconocidos en los factores
genéticos que influyen en este tipo de criterios (Claros,
2002).
La complejidad adicionado a la velocidad, con
la que se mueve los progresos tecnológicos han permitido
que Además de los marcadores morfológicos, en los
últimos años se han descubierto otro tipo de
marcadores genéticos como los isoenzimas en la
década de los años 70, y marcadores
moleculares como los RFLPs (restricted fragment length
polymorphisms) en los años 80, y los RAPDs (random
amplified polymorphic DNA) en los años 90. Estos
marcadores han permitido el confeccionar mapas de
ligamiento de alta densidad en el
genoma. Existen hoy mapas de ligamiento con marcadores
moleculares muy completos en varios cultivos como el tomate,
maíz,
trigo, cebada, soja, almendro,
Brassica, etc. Estos marcadores con un efecto neutro o al
menos no adversos en la planta pueden ser una ayuda valiosa en la
selección. (Moreno, 2002).
Este tipo de nuevos marcadores a nivel molecular han tenido
diferentes usos entre los cuales se destaca la
identificación y distinción de variedades,
líneas puras e híbridos. (Moreno, 2002), y cuando
se trabaja con grupos
provenientes del genero musa, es
particularmente interesante, su uso, ya que aunque las especies
comerciales provienen del cruce del genoma de Acuminata
con Balbisiana; existe una diversidad de clones
originarios de la selección, que en algunos casos es
difícil de identificar, dentro de un grupo (incluso
dentro de una sección), y donde aun cuando los marcadores
morfológicos son señalizaciones de la planta que le
dio origen, como se ha mencionado anteriormente, presentan
problemas de
ambigüedad. ( Del Valle, 1999).
Las posibilidades de este tipo de metodologías son
ilimitadas, tanto en musa como en otros cultivos, donde la
juventud del
conocimiento, es un incentivo a los programas de
investigación encaminados a descubrir y preservar, el
legado cromosómico productivo que proviene de
Musa.
LAS
TÉCNICAS MOLECULARES
Un poco de historia:
Desde la prehistoria, el
hombre ha
seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y
microbianas basándose en el fenotipo. Las mejoras
genéticas eran posibles gracias a la variabilidad
genética, a la heredabilidad del carácter que se
quería aislar, a la eficacia e intensidad de la
selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un
ciclo de selección. Sin embargo, quedan muchos aspectos
desconocidos, como son el número y efecto de los genes
implicados en la expresión de un carácter, la
localización de estos genes, y su función
fisiológica. Por otra parte, la taxonomía siempre
ha estudiado características morfológicas, lo cual
requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en
diferentes estadios de desarrollo. Los criterios utilizados
carecen muy a menudo de definición y objetividad y, en
cualquier caso, son marcadores ambiguos debido a las influencias
ambientales.
Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares
está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una
selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la
identificación de especies y variedades de una forma
más rigurosa y repetitiva.
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se
basaron en la identificación de proteínas
e izo enzimas por
electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con
ellos se abrió el conocimiento de la estructura y
heterogeneidad genética entre diferentes especies,
variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico.
Pero esta técnica tenía una limitación muy
importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo
entre variedades o especies próximas debido a que las
proteínas son el resultado de la expresión
génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros,
de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente
a otro, y de una época del año a otra. Los avances
de la tecnología del DNA recombinante han
permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados
en el DNA, consiguiendo estabilidad en la
identificación de especies y variedades. (Claros
Díaz 2002)
QUE SON LOS MARCADORES MOLECULARES (Roca y Ramírez;
1999)
Los marcadores moleculares (MM) son un grupo de técnicas
que permite el estudio del genoma de un organismo a nivel del
DNA. Los MM están basados en el grado de poliformismo
(diferencias) que ocurre naturalmente en el material
genético de los organismos eucarióticos superiores,
debido a la gran complejidad en la estructura de sus genomas.
Para ser útil, un marcador molecular debe reunir las
siguientes propiedades:
- Que sea altamente polimorfico, es decir, que permita
claramente diferenciar dos individuos; - Que sea codominante, para que permita discriminar un
individuo
homocigoto de un heterocigoto; - Que este distribuido a través del genoma;
- Que no presente efecto pleiotropico, es decir, que un gen
no afecte mas de una característica; - Que sea de fácil y rápida ejecución,
con mira a una posible automatización; - Que tenga alta reproducibilidad;
- Que permita el fácil intercambio de datos entre los
laboratorios.
Los marcadores moleculares permite estimar:
- El numero de genes responsables de una
característica. - La localización cromosomica de genes, por ejemplo,
cerca de que marcador molecular - El efecto fenotípico, es decir, cuando afecta cada
gen la característica. - La dosis génica ( o acción génica): un individuo con
dos copias del gen es diferente de aquel que presente una
sola copia - La pleiotropia: un gen afecta mas de una
características - La sensibilidad ambiental: la función de los genes
es similar en diferentes ambientes - La epistasis: el efecto de un gen influencia el efecto de
otros genes
Es concepto de
marcadores moleculares ha revolucionado la habilidad de detectar
regiones ( segmentos) dentro del genoma, responsables de
caracteres importantes (cuantitativos), y ha acelerado el
proceso de
construcción de mapas genéticos lo
cual permite un mejoramiento mas dirigido. Los MM son discretos,
codominantes, no deletéreos, sin efecto ambiental, libre
de epistasis y pueden ser generados en numero ilimitado,
permitiendo una cobertura saturada del genoma.
USOS DE LOS MARCADORES (Moreno; 2002)
Los marcadores moleculares se han utilizado o se pueden
utilizar en los siguientes aspectos de la mejora genética
de plantas:
(A) Estimación de distancias genéticas entre
poblaciones, variedades, líneas puras e híbridos.
Esto permite: la clasificación taxonómica de
ecotipos o muestras que acceden a los Bancos de
Germoplasma como un complemento de los datos morfológicos
que han sido utilizados desde los tiempos de Linneaus; y (ii) la
asignación de líneas puras a grupos
heteróticos con objeto de predecir el valor de los
híbridos resultantes del cruce. Las distancias
genéticas mas usadas son la modificada de Rogers utilizada
con poblaciones segregantes y la de Nei-Li utilizada con
líneas puras e híbridos.
(B) Identificación y distinción de variedades,
líneas puras e híbridos para proteger los derechos del obtentor
vegetal en el Registro de
Variedades Protegidas. Los marcadores de DNA permiten una
distinción mas precisa de genotipos que los "descriptores"
morfológicos requeridos hoy día. Sin embargo estos
marcadores moleculares no han sido todavía adoptados por
los organismos oficiales encargados de la protección de
variedades.
(C) Establecimiento de relaciones de parentesco o "pedigree"
entre líneas o variedades para realizar estudios
genéticos. El método es
similar al utilizado en las pruebas de
paternidad y parentesco en genética humana.
(D) Localización e identificación de genes
cualitativos o mayores y también de genes con efectos
pequeños afectando a caracteres cuantitativos (los
así llamados QTLs).
El numero de técnicas descritas es cada vez mas
numerosa por lo que se reúne en 3 categorías: RFLP,
MAAP y STS.
En cada una de estas categorías, solo se
procederá a detallar lo que han sido usadas mas
comúnmente en la evaluación
de la diversidad en poblaciones de musaceas.
RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los
fragmentos de restricción).
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en
la detección de fragmentos de DNA de distinto peso
molecular (por digestión con la misma enzima de
restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos
más fáciles de analizar son los pequeños
derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o
los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o
mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de
bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa,
donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para
moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA
cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo
que es necesario utilizar sondas específicas para
visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la
técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta
técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos,
aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones
inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un
tipo de polimorfismo en cada ensayo, el
resultado es muy preciso. Los primeros mapas geonómicos
basados en la distribución física de los genes
en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron
utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar
de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le
denomina PCR-RFLP ( Claros Díaz 2002)
Figura 1: Base molecular del polimorfismo de los marcadores
moleculares RFLP. 1. digestión de segmentos
homólogos de DNA genómico de dos individuos (A y B)
con una misma enzima de restricción (ER) 2.
separación de los fragmentos por electroforesis. El
polimorfismo se aprecia en la diferencia de los tamaños de
los fragmentos de restricción. Fuente : (Roca y
Ramírez, 1999).
MARCADORES MOLECULARES BASADOS EN LA REACCION EN
LA CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
RAPD (DNA polimórfico amplificado al
azar): Es una de las técnicas más
versátiles desde que se desarrolló en el año
1990. Se usa una colección de decanucleótidos para
amplificar por PCR áreas específicas distribuidas
al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de
alineación (36°C) aseguran que se unen a infinidad de
secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos
fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de
agarosa para obtener perfiles electroforéticos que
variarán según el polimorfismo de los distintos
individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una
huella dactilar característica. Es muy cómoda,
rápida, requiere poco DNA que además no necesita
estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la
secuencia, y se pueden distinguir rápida y
simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son
que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA
ligado a algún carácter, sino redundante, y que no
da información sobre el número de copias que el DNA
genómico contiene de la secuencia amplificada. Esta
tecnología ha sido utilizada para la catalogación
de frutos, selección de variedades, y
diferenciación de líneas clonales. También
se está utilizando para el análisis de las
variedades de apio, uva, limón y olivo. (Claros
Díaz 2002).
AFLPs: POLIMORFISMO EN
LA LONGITUD DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS (CIAT 2001)
La técnica AFLP se basa en la amplificación
selectiva, vía PCR, de fragmentos de restricción de
DNA genómico. La técnica comprende cuatro
etapas:
- Generación de fragmentos de
restricción de DNA genómico. - Ligación de adaptadores específicos a
los fragmentos. - Amplificación selectiva de un grupo de
fragmentos vía PCR.La base molecular del polimorfismo de los AFLPs,
al igual que el de los PFLPs, se debe a las diferencias en
los sitios de reconocimientos de las enzimas de
restricción utilizados en el estudio (en este caso
EcoRI y Msel). Estos cambios se deben a mutaciones
puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglos en el
genoma debido a translocaciones e inversiones, lo cual causa la perdida o
ganancia de secuencias de reconocimiento.Los AFLPs, al igual que los RAPDs, son marcadores
dominantes, lo cual no permite diferenciar individuos
homocigotos de heterocigotos.El poder de
la técnica de AFLP se basa en las variaciones
genéticas que existen entre especies, variedades o
cultivares estrechamente relacionados. Estas variaciones en
su secuencia de DNA son explotadas por esta técnica
para la obtención rutinaria de "fingerprintings"
(huellas dactilares) de un genotipo en particular. Estos
"fingerprintings" son simples RFLPs amplificados
selectivamente vía PCR.Desde su desarrollo, esta técnica ha sido
utilizada para discriminar genotipos, para mapeo
genético localizado (Bulk Segregant Análisis)
y para la construcción de mapas
genéticos.MICROSATÉLITES ( Roca y
Ramírez,1999).Los microsatélites o secuencias simples
repetitivas (SSR – Simple Séquence Repeats)
son secuencias pequeñas de 1 a 4 nucleótidos
que se repiten en bloque. En los genomas de los organismos
eucarióticos, estas secuencias simples son mas
frecuentes, bien distribuidas y presentan loci
genéticos altamente polimorficos.Este tipo de secuencias varía entre
animales y vegetales. Por ejemplo en los mamíferos las secuencias mas comunes
son (GT)n y (CA)n, donde n representa el numero de veces
que se repite la secuencia. En plantas, las secuencias mas
comunes son (AA)n y (AT)n. Se encontraron en 1993 que en el
genoma de maíz y arroz las secuencias mas comunes
son (GA9N, 8gt9n y las complementarias (CT)n y
(CA)n.Los microsatélites pueden ser amplificados
individualmente vía PCR, utilizando un par de
"primers" especialmente diseñados (de 20-30 bases),
complementarios a las secuencias únicas que limitan
(flanquean) los microsatélites. Los segmentos
amplificados son separados por electroforesis en un gel de
agarosa y visualizados, después de la tinción
con bromuro de etidio, en una pantalla con luz
ultravioleta.La base molecular de polimorfismo radica en la
diferencia del numero de unidades repetitivas en los
diferentes loci de microsatélites . Cada segmento,
de tamaño diferente (amplificado generalmente desde
varias decenas hasta centenas de pares de bases) representa
un alelo diferente de un locus.Los microsatélites amplificados vía
PCR ofrece ventajas como: - Separación de los fragmentos amplificados
por electroforesis y análisis de los fragmentos
amplificados. - Su alto polimorfismo, y por consiguiente son
altamente informativos; - Son codominantes, lo que permite diferenciar
individuos homocigotos y heterocigotos; - Disponibilidad de una buena colección de
diferentes microsatélites, algunos de los cuales
ocurren en alto numero de copias; - Están mas o menos dispersos a través
del genoma;Por estas características, los
microsatélites son ideales parta el mapeo
genético y mapeo físico de genomas , para la
identificación y discriminación de genotipos y para
estudios de genética de poblaciones.APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS
MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA DIVERSIDAD
EN MUSA.La existencia de la diversidad de clones del
genero Musa, proviene de la contribución relativa de
las dos especies que dieron origen a los bananos
cultivados; Musa acuminata y Musa balbisiana,
este hecho abrió la puerta que condujo a la
clasificación entre grupos y sub-grupos que hoy
reúnen a los principales cultivares comerciales.
(Del Valle, 1999).Dicha clasificación de estos clones, solo
se trabajan por medio de marcadores morfológicos
característicos de ambas especies, adicionado al
conocimiento del número básico de cromosomas que poseen, sin embargo los
estudios de mejoramiento en banano y plátano han
diversificado las características y se ha hecho
necesario, el poder diferenciar con mayor exactitud los
cultivares, y por supuesto salvaguardar el banco
geonómico de las distintas variedades que salen al
mercado.
(Carrel, et al, 2000).El uso de las técnicas moleculares ha
facilitado mucho estos objetivos, ya que han "simplificado" la
evaluación del rico genoma de los clones de Musa,
conocidos y por conocer.En este orden de ideas, que impone el ritmo
acelerado del conocimiento, es evidente la importancia de
dar a conocer las investigaciones que son generadoras de
avances en el establecimiento de patrones de
identificación en el genero musa. Visser (2001)
trabajando en Uganda con el objetivo de establecer una
metodología de caracterización
con 37 cultivares de banano y plátano, usando la
técnica de RAPD. La metodología empleo
Primer arbitrarios para amplificar al DNA obtenido y
aplicar los protocolos ya determinados, los resultados
que se consiguieron fueron visualizados y totalmente
analizados por un método aritmético (UPGMA) y
ejecutado el análisis de cluster, para agrupar las
accesiones basados en la composición de su
genoma.Polimorfismo para casi todos los cultivares fueron
obtenidos por cada uno de los primer usados, llegando a ser
posible distinguir claramente entre las accesiones de los
genotipos AAB y ABB con el Primer OPAH-13
reflejándose el uso de RAPD como una alternativa
simple para documentar la identidad de los cultivares.Una de las grandes ventaja del uso de estas
técnicas es la posibilidad de trabajar con una gran
cantidad de población sin imponer restricciones
del tipo geográfico para su aplicación, en
este sentido Carrel, et al (2000), presento la
caracterización del germoplasma de Musa mantenido en
el banco de genes de INIBAP con marcadores de
microsatélites STMS-PCR. Esta colección
internacional de germoplasma de Musa mantenida por el
INIBAP y hospedada por la UNIVERSIDAD CATOLICA DE LOVAINA (KUL),
contiene mas de 1100 accesiones. El objetivo de este banco
genético consiste en conservar la diversidad de Musa
para beneficio de la comunidad
internacional y distribuir las especies y cultivares de
Musa para los propósitos de investigación y
desarrollo. El proyecto
consistió en obtener la caracterización
molecular de este germoplasma con el fin de facilitar la
clasificación y el manejo del banco genético.
Cada año desde 1998, cerca de 200 individuos
están siendo caracterizados en el CIRAD-FLHOR en
Guadalupe con la ayuda de los marcadores moleculares. Hasta
ahora han conseguido estudiar màs de 464 clones,
donde se han identificado 34 errores de
clasificación, y se completo la clasificación
de 23 clones y 31 clones no clasificados fueron asignados a
un grupo, y cuando fue posible, a un sub-grupo. Estos datos
ayudan a completar la base de
datos morfológicos del germoplasma.Por su parte Reyes y Belalcazar (2002), trabajando
en la colección colombiana de Musàceas,
realizaron una investigación donde se busca la
integración de distintos marcadores
para la caracterización de sus clones. La
colección colombiana de Musàceas tiene 35
clones del genotipo acuminata, 35 clones de la
combinación acuminata y balbisiana, dos
clones del genoma de balbisiana y seis clones con un
número cromosómico menor de once. Esta
colección está basada en
genotipos que crecen a un nivel medio de altitud,
pero aún no han sido completamente caracterizados.
Este estudio pretende mediante la caracterización
genética (morfológica, citológica),
bioquímica y molecular, brindar a los
fitomejoradores nueva información sobre la
diversidad y variabilidad genética de los clones de
plátano de la colección colombiana de
Musàceas; lo que contribuirá a efectuar
prácticas mucho más racionales de
fitomejoramiento y a integrar los estudios
citogenéticos de mapeo y diversidad genética
con el objeto de lograr una descripción coherente del genoma de
Musa. Entre las conclusiones que aporto este
trabajo,
en el aspecto molecular, se estandarizaron las
metodologías de RAPD's y RFLP's con los clones de
balbisiana, observando un gran polimorfismo en
éstas metodologías.Una de las dificultades que ha encontrado el
fitomejorador cuando se enfrenta al reto de
obtención de cultivares mejorados es sin duda la
poliploidia de las especies de Musa. Este problema adquiere
mayor magnitud si se le adiciona los descubrimientos de
cultivares silvestres de los cuales se desconoce su origen
y en algunas ocasiones sus características
morfológicas son de engorroso uso para su
clasificación. La importancia de una
determinación sencilla de la clasificación de
estos cultivares radica en que algunos poseen
potencialidades comerciales muy importantes. En Brasil
Souza et al, (2000), usando la técnica de
microsatélites realizaron una investigación
en cultivos "pome y "silk" (AAB), usados principalmente por
pequeños agricultores, y con híbridos
tetraploides y diploides que se conseguían en forma
silvestre.Los objetivos de este trabajo consistieron en
caracterizar 33 cultivares comerciales triploides e
híbridos tetraploides, màs de 49 genotipos
diploides silvestres del programa de
mejoramiento de EMBRAPA, Los iniciadores fueron adquiridos
en RESEARCH GENETICS INC. (Hunfsville, al EEUU), y los
fragmentos amplificados fueron registrados en geles de
policrilamida desnaturalizados y teñidos con nitrato
de plata. Basándose en el análisis de los
agregados, los cultivares triploides y tetraploides se
agruparon de acuerdo a la composición
genòmica (presencia del genoma B), y ala
clasificación de sub-grupos. No se detectaron
diferencias entre los cultivares de los sub-grupos
"Cavendish" y "Pome" . Los cultivares se identificaron
clasificándolos en un sub-grupo erróneo. Las
selecciones tetraploides del mismo cruzamiento no fueron
idénticas y presentaron la similitud esperada con
los triploides maternos. Los diploides fueron altamente
diversos, con las principales líneas diploides
parentales empleadas para desarrollar híbridos
tetraploides muy distintas.La búsqueda de nuevas alternativas que
contribuyan a dar soluciones a los problemas en el proceso de
producción constituye una de las grandes
motivaciones para el estudio de nuevas especies. Los
plátanos y los bananos componen los principales
productos de pequeños agricultores y en torno a
ellos gira la economía familiar de muchos
países en el mundo. En Malasia el banano es el
segundo cultivo frutícola y contribuye con mas de 20
millones RM (dólares malayos) en ganancias por
exportación. (Othman, et al, 2000).
Sin embargo los problemas de las enfermedades muy diseminadas sigue siendo la
principal limitación para la industria y requieren que se realicen
intensos esfuerzos para introducir nuevos cultivares
resistentes. El programa bananero en la Universidad de
Malasia y Universiti Putra Malaysia estableció
recientemente un grupo de mejoramiento molecular que se
concentrara en las especies indígenas locales con
principal énfasis en el banano silvestre Musa
acuminata ssp malaccensis. Actualmente el
programa incluye un proyecto de etiquetas de secuencias
expresadas (expressed séquense tag. EST),
análisis de los genes potenciales de resistencia a las enfermedades y estudios
taxonómicos basados en citometrìa de flujo y
citología.La integración es una parte fundamental del
éxito de investigaciones basadas en
marcadores moleculares, ya que las conclusiones y el
alcance dependen de la utilidad
que representen. En el Alto San Juan, Risaralda, se tiene
un protocolo para la multiplicación
masiva in Vitro de plantas de plátano primitivo
(Musa acuminata) y un stock de 5300 plantas in Vitro
en cámara de crecimiento. (Marulanda; 2002).En este
trabajo se estableció una parcela demostrativa de
plantas de primitivo procedentes del laboratorio procedentes del laboratorio,
para evaluar su comportamiento agronómico, y fomentar
entre los agricultores la siembra del material vegetal
producido en el laboratorio, aunado al desarrollo de un
protocolo de extracción de ADN de
la especie Musa, habiéndose extraído
ADN de 7 procedencias diferentes de plátano
primitivo.OTRAS TÉCNICAS APLICADAS EN
MUSAEn la actualidad no solo los estudios moleculares
son de importancia en el estudio genético de las
especies vegetales ya que desde los años 70 se viene
usando las técnicas bioquímicas. Y aunque
estas presenten mas desventajas que las moleculares aun se
siguen usando como punto de referencia en distintos
estudios con especies vegetales y por supuesto incluyendo
Musa; diversas isoenzimas entre ellas la Malato
deshidrogenasa y las peroxidasas se han estudios con este
genero. (Mandal et al; 2001)Los trabajos con este tipo de inventivas, son de
carácter integral, ya que la evaluación de
los clones tanto por técnicas bioquímicas
como moleculares, deben ser acompañados por
evaluaciones agronómicas en general
(climáticas, edáficas, etc.), que permitan
determinar sus bondades y su impacto social, ya que como se
ha mencionado anteriormente este prototipo de
metodologías necesitan ser la composición de
investigación básica y la aplicada. (Rivas,
et al; 2000).La idea de la utilización de
técnicas como las isoenzimaticas, es buscar la
estandarización de métodos que permitan la
caracterización de clones, y aumentar con ello la
velocidad en la
globalización de estas metodologías
(Reyes y Belalcazar;2002).Otra de las practicas innovadoras es la
aplicación de la citometria de flujo (método
para estimar el contenido de ADN nuclear), y la
citogenética para lograr determinar el cariotipo de
las especies de Musa, (Dolezel, et al 2000)La aplicación de los resultados
unificadores de todas estas innovadores habilidades,
estimularan el progreso en el entendimiento del genoma de
Musa a escala
molecular, bioquímica y cromosomica.Es indudable que los descubrimientos, en la
biología y genética son cada vez de mayor
envergadura y rapidez. El género Musa como
otras especies vegetales, están bajo la mira de
diversas investigaciones que conlleven a dar soluciones mas
aceleradas a los problemas productivos que aquejan a los
agricultores (tanto grandes como pequeños). Sin
embargo este tipo de investigación es de tipo
primario ya que solo generan un conocimiento que necesita
acompañarse del estudio de la aplicabilidad para de
este modo poder visualizar mejor su importancia.El futuro de la aplicación de las
técnicas moleculares, es amplio y complejo, donde la
realidad inclusive puede llegar a superar nuestra
imaginación, y donde el acoplamiento de los
descubrimientos realizados en humanos con los hechos en
vegetales pueda llegar incluso a ser rutinario.Como ejemplo alo anterior podemos citar una
investigación realizada en Francia
por Baurens et al (11998), usando Primer de humanos para
una secuencia ALU (elemento repetitivo de una secuencia del
genoma primate). Las secuencias de este tipo ha sido
raramente reportadas en genoma de plantas , sin embargo
entre sus conclusiones llego a establecer que el genoma del
banano puede ser discriminado con esta técnica, y
aun cuando su uso este aun en discusión.Lo anterior refleja las perspectivas, ilimitadas
de estas prácticas y las posibilidades prometedoras.
Sin embargo también es obvio la necesidad de
mantenerlas en constante marcha, y que sus conclusiones
puedan ser discutidas y conocidas por todos cuan se
encuentren interesados.- BAURENS; F-C, NOYER; J-L, LANAUD; C, y LAGODA ;
P.J.L. 1998. Inter–ALU PCR like genomic profiling
in banana. Revista Euphytica.99:137-142. - CARREL;F, DUARTE; V.A, VANDEN;H.I, y SHARROCK;
S. 2000.Caracterización del germoplasma de
Musa mantenido en el banco de genes de INIBAP con
marcadores STMS-PCR . En 2º Simposio Internacional sobre la
biología molecular y celular de bananos. Byron
Bay. Australia. 20pp. - CONTRERAS; J. 2001. Introducción a la biología
molecular. Barquisimeto.185pp.(No publicado).[ en
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(Resumen 2333)
- BAURENS; F-C, NOYER; J-L, LANAUD; C, y LAGODA ;
- La técnica puede ser
automatizada.
RESUMENES TRABAJOS DE HORTICULTURAL
ABSTRACTS
CARACTERIZACION DE BANANO Y PLATANO USANDO
RAPD.
RAPD, fue usado para valorar la diversidad genética
entre 37 cultivares de banano y plátano. Arbitrarios
primer deca-nucleotidicos, fueron usados con éxito para
amplificar el ADN obtenido del semillero. Los resultados fueron
visualizados y analizados por el método
aritmético de medias unweighted pair-group (UPGMA), fue
llevado a cabo el análisis de cluster. Las accesiones
fueron agrupadas basándose en la composición de
su genoma. Polimorfismos para casi todos los cultivares fue
obtenido para cada uno de los primer usados. También fue
posible distinguir entre accesiones para los genotipos AAB y
ABB con el primer OPAA-13. el uso de RAPD-reacción en
cadena de la polimerasa, puede proveer de un simple
método alternativo para identificar varios cultivares de
Musa.
UBICACIÓN DE LA SECCION DE 3 ÁRBOLES
ORIGINARIOS DE MUSA BASADOS EN AFLP.
La tradicional aproximación a la clasificación
de las especies de Musa (Musaceaea), es la
separación en 4 secciones (Musa, Rhodochamys,
Callimusa, y Austalimusa), basados en el numero de cromosomas
y los caracteres morfológicos. La sección que ocupa
Musa beccarii, esta aun sin resolver debido al
único numero de cromosomas que tiene. La sección de
2 nuevas especies de Sabah, Malaysia, M. monticola y M.
suratii, también es indeterminada. El estudio empleo
AFLP como una herramienta molecular para determinar la
ubicación de la sección de estas 3 especies entre
el genero Musa. 8 primeras combinaciones generaron 17
marcadores genéticos, el cual confirmo que M monticol y
M.suratii como distintas especies. Los datos de la AFLP
apoyan la inclusión de M. Beccarii y M. monticola
en la sección Australimusa, mientras que los resultados
mostrados para M. suratii caen entre la sección
Callimusa y la sección Australimusa
sugiriendo que estas dos secciones pueden no ser mantenidas en el
tiempo como distintas.
MARCADORES ISOENZIMATICOS EN LA
IDENTIFICACIÓN DE VARIEDADES DE BANANO.
Un polipéptido de sal soluble y unas pocas
isoenzimas fueron perfiladas para la identificación de
cultivares de banana disponible en Andamans, India. La
sal soluble perfilada fue inapropiada en la
identificación de cultivares. Sin embargo, isoenzimas
tales como las peroxidasas, pudieron identificar a "Jungli
Kela", ·Tissue cultured Dwarf Cavendish" (TCDC), "Lal
Kela", "Rajbel" y "Baratang Wild", mientras que la esterasa
identifico todos los cultivares excepto "Rajbel" y "Takari
Kela". El segundo cultivar puede ser identificado con el uso de
la Malato deshidrogenase (MDH) y perfiles de
peroxidasa.
MDH representa cultivares específicos
distinguiendo el bandeado paterno en "Khatta Champa", "Takari
Kela", y "Baratang Wild",. "China Kela",
puede ser identificado fácilmente por la superoxidasa
dimutasa (SOD). Entre 4 isoenzimas las esterasas fueron las mas
eficientes en la identificación de 8 cultivares entre
10; por lo tanto esta isoenzima puede ser usada a menudo como
marcador para identificar cultivares de banana
Erika Trujillo