- Resumen
- Control de plagas.
Generalidades - Seguridad de hongos como agentes
de control biológico - Regulación y registro.
Generalidades - Resultados
- Conclusiones
- Bibliografía
Los plaguicidas de origen biológico se consideran
una opción ambientalmente benigna para el control de las
plagas. Sin embargo, esto no significa que están libres de
riesgos para
la salud y el
ambiente. Como
parte del proceso de
desarrollo de
nuevos productos, de
los procedimientos de
registro y el
interés
de comercializarlos ha aumentado la necesidad de evaluación
de la seguridad y el
impacto
ambiental de agentes de control biológico. Por tanto,
la evaluación toxicológica de los plaguicidas
microbianos, garantiza la seguridad de dichos productos ya que
está diseñada para evaluar la patogenicidad,
infectividad y la toxicidad de los agentes microbianos y de los
contaminantes microbianos de la formulación.
Palabras claves: Toxicidad, pesticidas
microbianos.
Abstract
Pesticides of biological origin are generally considered to
provide an environmentally benign pest control option. However,
this does not mean that they are entirely free of hazards to
health and the environment. Because of interest in the
registration and commercialization, the need of safety and
environmental impact evaluation of biological control agents have
been increased, both as part of the product development process,
and as part of the registration procedure. Toxicology evaluation
of microbial pesticides is therefore necessary to provide the
security of these products and is designed to evaluate
pathogenicity, infectivity and toxicity of the microbial agents
and of microbial contaminants.
Key Words: Toxicity, Microbial pesticides
Los nemátodos constituyen una de las plagas que
más ataca a los cultivos agrícolas, se estima que
provocan pérdidas de alrededor del 10% del rendimiento de
cultivos de importancia económica, equivalentes a 80 mil
millones de dólares anuales en todo el mundo (Handoo,
2001). En el trópico, cultivos como el cafeto, tabaco,
plátanos y hortalizas son gravemente afectados por estos
organismos, fundamentalmente por especies del género
Meloidogyne (Luc et al, 1990). En Cuba, los
programas de
producción diversificada de alimentos
están seriamente afectados por la alta incidencia de
nemátodos agalleros; especialmente Meloidogyne
incógnita (Kofoid y White) Chitwood. (Hidalgo,
1999)
Durante años, se han empleado una amplia gama de
nematicidas, muchos de los cuales son biocidas de marcada
influencia negativa sobre los organismos beneficiosos presentes
en el suelo (Hooper y
Evans, 1993). La resistencia de
plagas e insectos frente a plaguicidas químicos,
así como problemas de
contaminación ambiental que han impactado
negativamente en la biodiversidad
de los agroecosistemas, de seguridad y salud
pública inherentes a la fabricación y uso
inadecuado de los agroquímicos; han conducido a la
búsqueda y desarrollo de alternativas ecológicas
para el tratamiento de las plagas agrícolas. Es en este
contexto, el desarrollo y aplicación de agentes de control
biológico (ACB), adquiere una importancia relevante como
alternativa ambiental segura para el manejo de las plagas, ya que
son un componente natural del ambiente y usualmente son mucho
más selectivos que los plaguicidas químicos.
Según datos publicados,
resultados de evaluaciones y la experiencia ganada en su uso, los
bioplaguicidas presentan un potencial de riesgo más
bajo (Goettel y Jaronski , 1997).
No obstante, la introducción de cualquier organismo
viviente en el ambiente es a menudo un paso irreversible por lo
que debe hacerse con cautela, para que el organismo no se
convierta en una plaga por sí misma, o interfiera con el
funcionamiento natural de otros agentes de control de plagas, y/o
cause toxicidad en las especies no-diana, incluyendo el humano y
otras formas de vida que cohabitan en el ambiente. De ahí
que, la seguridad de los hongos utilizados
en el control biológico deba ser considerada a todos los
niveles, ya sean efectos directos e indirectos sobre todos los
miembros del ecosistema y
sobre el ecosistema mismo (Hajek y Goettel, 2000).
En tal sentido, una vez demostradas las potencialidades del
microorganismo
como agente de control de
plagas y antes de su inclusión en programas de control
biológico se hace imprescindible llevar a cabo un conjunto
de estudios toxicológicos para determinar seguridad e
inocuidad para el hombre, los
animales, las
plantas y el
ambiente; con especial énfasis en los estudios de
toxicidad aguda en mamíferos que constituyen la etapa inicial
de esta evaluación.
A finales del siglo XIX, ante las dificultades encontradas por
el hombre en
dominar las múltiples formas en que las plagas lo atacaban
y asediaban, tuvo que recurrir a los medios
químicos para su control. La química
orgánica de los plaguicidas, nacida hace algo más
de 30 años, puso en sus manos las más
mortíferas armas
químicas, jamás soñadas por el hombre, para
la lucha contra las plagas. Desde el punto de vista de
prevención y control, el empleo de
dichos plaguicidas permitió de forma relativamente
rápida y efectiva eliminar estos problemas. Sin embargo,
esta efectividad está unida a una serie de efectos
desfavorables como son entre otros: las afectaciones sobre la
fauna
beneficiosa, la
contaminación ambiental y el desarrollo acelerado de
resistencia de los insectos a los plaguicidas (Zavaleta-Mejia,
1999).
Una de las vías de reducción del empleo de estos
plaguicidas es la introducción de los medios de control
biológico y el Manejo Integrado de Plagas (MIP); ya que
ambos ofrecen una salida alternativa a esta crisis mundial
y demuestran cada día que son capaces de forjar una
agricultura
ambientalmente segura, socialmente justa y económicamente
viable.
Los ACB de origen microbiano tienen un futuro promisorio
dentro del MIP (Lacey y Goettel, 1995). Los microorganismos como
componentes naturales del ambiente constituyen un grupo
importante de elementos biológicos de uso fitosanitario,
debido a su diversidad y la posibilidad de crear epizotias, que
en ocasiones logran mantener las plagas y enfermedades por debajo del
umbral de daño,
sin necesidad de nuevas aplicaciones. Algunos de estos productos
han sido utilizados durante muchos años sin ningún
efecto dañino aparente sobre la salud humana o el ambiente
(Goettel y Jaronski, 1997).
Los nemátodos constituyen una de las más serias
amenazas para los sistemas de
producción intensiva de hortalizas, ya que la inmensa
mayoría de los cultivos hortícolas son buenos
hospedantes de nemátodos del género
Meloidogyne, especialmente M. incógnita.
(Stefanova y Fernández, 1995). Para su control se
invierten anualmente grandes cantidades de recursos; por
ejemplo en los Estados Unidos
(EEUU) se emplean aproximadamente siete billones de
dólares por año para el control de esta plaga (Cook
et al, 1996).
Muchos nematicidas químicos tienen efectos adversos
sobre la salud de las aves y los
mamíferos y algunos pueden tener efectos tóxicos y
alergénicos sobre organismos no-diana, especialmente
durante la producción/ formulación y la
aplicación; como es el caso del bromuro de metilo que
está demostrado que produce efectos tóxicos y
degrada el ozono; por lo que se ha prohibido su uso en muchos
países y está en vías de prohibirse incluso
su producción a escala mundial
(Stirling, 1991). Esta prohibición ha incrementado los
problemas agrícolas de los nemátodos y por ende la
necesidad de la búsqueda de nuevos nematicidas.
(Lopez-Llorca y Jansson, 2001).
1.1.1 Hongos contra nemátodos
Existe un número considerable de hongos antagonistas de
fitonemátodos con potencialidades para el control
biológico, y un gran interés en su
aplicación (Duncan , 1991). Sin embargo, ninguno es
ampliamente usado en la práctica agrícola (Fravel,
1999) debido fundamentalmente al deficiente conocimiento
entre otros aspectos del: modo de acción,
producción de metabolitos y eventos o
condiciones que afectan su actividad como bioplaguicida
(López-LLorca y Olivares-Bernabeu , 1998)
Arthrobotrys robusta Dubbington, es un hongo atrapador
de nemátodos, que ha sido vendido en Europa con fines
nematicidas y Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson, ha
sido usado en las Filipinas como parásito de huevos de
nemátodos (Stirling, 1991)
Uno de los hongos nematófagos más estudiado es
P. chlamidosporia considerado como uno de los ACB
más eficaces para el manejo de poblaciones de
nemátodos agalleros (Kerry , 2001) en particular de huevos
de M. incógnita. (Hidalgo, 1999)
P. chlamydosporia var catenulata, cepa Vcc-108
(IMI SD No. 187) es un Deuteromycete, parásito facultativo
de huevos de nemátodos agalleros, función
que alterna con la de saprófito en la rizosfera.
Está ampliamente distribuido y en las dos últimas
décadas ha sido aislado de importantes nemátodos de
quiste y agallas en gran diversidad de suelos y
agro-ecosistemas,
en todo el mundo. Aparece como parte de un complejo de diferentes
especies relacionadas (Kerry y Bourne, 2002) parasitando quistes,
huevos o nemátodos de vida libre. (Gams, 1988).
La segunda edición
del Compendio de Protección de Cultivos del 2001 informa
la siguiente posición sistemática:
Reino: Fungi
Phylum: Hongos mitospóricos
Clase: Hyphomycetes
Género: Verticillium
Especie Verticillium chlamydosporium
P. chlamydosporiaparásita huevos de
nemátodos formadores de agallas formando apresorios,
desarrollados a partir de la hifa indiferenciada que permite la
colonización de la superficie de los huevos de los
nemátodos. Sin embargo, la penetración, es el
resultado de una presión
física y
una actividad enzimática. Una enzima proteasa serina
alcalina (subtilasa) designada como VCP1 ha sido parcialmente
caracterizada y en pruebas in
vitro demostró eliminar la membrana vitelina
más externa de la cáscara del huevo y expuso la
capa de quitina de nemátodos formadores de agallas de
raíces (Segers et al, 1996).
De los aislamientos estudiados por Hidalgo y cols (1999), se
seleccionó a la cepa Vcc-108 de la var. catenulata
como la más promisoria con un 68% de huevos de M.
incognita parasitados en condiciones semicontroladas y el 70%
de las masas de huevos colonizadas sobre la rizosfera del
tomate,
después de seis meses de aplicado el hongo en una
sucesión de cultivos (Atkins et al. 2003).
Con esta cepa se han desarrollado metodologías de
reproducción masiva en bandejas mediante
formulación sólida (Hidalgo, 1999) y posteriormente
mediante una tecnología de
Fermentación en Estado
sólido en Bolsa para obtener mayores rendimientos y
desarrollar ensayos de
campo a mayor escala (Hidalgo et al, 2004.). En estos ensayos de
campo se ha demostrado que con una sola aplicación del
hongo a razón de 5000 clamidosporas por gramo de suelo,
después de dos ciclos consecutivos de tomate este logra
infestar más del 60% de los huevos expuestos en la
rizosfera, reduciendo significativamente el número de
juveniles en el suelo. (Peteira et al, 2004)
Además se desarrolló un sistema que
permite una identificación integral, desde el punto de
vista cultural, morfológico y molecular, como parte de la
evidencias
necesarias para su detección, monitoreo y registro (Montes
de Oca, 2002.)
1.2 Seguridad de hongos como
agentes de control
biológico
Dentro del grupo de bioplaguicidas de origen microbiano se
destaca el uso de los hongos por su amplio número de
géneros y especies eficaces en el control de diferentes
plagas. Sin embargo, dichos hongos también contienen
muchas especies que son plagas y que causan pérdidas
incalculables a las cosechas, bosques, productos almacenados,
edificios y afectan a la salud humana y animal. (Goettel et al,
2001). Por consiguiente, el desarrollo y uso de los hongos como
ACB requieren una valoración de efectos imprevistos
asociados con su uso.
Revisiones anteriores sobre la seguridad de los hongos
utilizados como plaguicidas han sido informadas por Goettel y
Johnson (1992) y Evans (1998, 2000). Las revisiones sobre la
seguridad de agentes microbianos para el control de plagas (AMCP)
en general son las de Laird et al (1990), Cook et al. (1996) y
Goettel y Jaronski (1997).
Las guías para evaluar la patogenicidad e infectividad
de entomopatógenos a los mamíferos han sido
analizadas por Siegel (1997) y las guías para evaluar
efectos de entomopatógenos en los organismos invertebrados
no-diana por Hajek y Goettel (2000). Sin embargo, se han
realizado muy pocos estudios para determinar los efectos de los
hongos nematófagos sobre los organismos no-diana.(Goettel
et al, 2001).
El término "organismo no-diana" se aplica a todas las
especies que aparecen en el área donde vive la plaga que
se quiere controlar y el efecto no-diana que puede producirse
sobre estos organismos es más preocupante cuando se
afectan especies de importancia comercial. (Hajek y Goettel ,
2000)
Un grupo que trabaja con AMCP identificó los siguientes
aspectos potenciales de seguridad y efectos no-diana asociado con
el desarrollo de microorganismos para el control de plagas (Cook
et al, 1996):
- Desplazamiento competitivo de microorganismos no-diana
- Alergenicidad a humanos y otros animales
- Toxicidad a organismos no-diana
- Patogenicidad a organismos no-diana
La disminución de la población diana, es otro efecto indirecto
que por su importancia, también debe ser considerado como
un aspecto potencial de seguridad.( (Hajek y Goettel , 2000)
El potencial de los efectos imprevistos variará en
dependencia de los organismos potenciales diana y no-diana y los
ecosistemas que ellos habitan. Estos efectos potenciales no
intencionales sobre organismos no-diana son también
efectos intencionales sobre organismos diana, excepto la
alergenicidad. Dichos efectos intencionales sobre organismos
diana, a diferencia de los no intencionales, son independientes
del origen del organismo (nativo o exótico) y de la forma,
si es natural o modificado; de ahí que la habilidad para
evaluar el potencial de riesgo dependerá mucho de estos
factores (Cook et al, 1996).
1.2.1 Desplazamiento competitivo
El control biológico a través del desplazamiento
competitivo tiene gran potencial para el manejo de plagas de las
plantas ya que utiliza cepas relacionadas y ecológicamente
similares a los patógenos; ya sean organismos naturales o
modificados genéticamente (Freeman y Rodríguez ,
1993)
Como efecto intencional los hongos introducidos o aplicados
como ACB tienen potencial para ocupar competitivamente un nicho y
afectar adversamente uno o más organismos nativos dentro
de ese nicho. Los efectos imprevistos ocurrirían si este
desplazamiento del competidor afectara un organismo no-diana
(llevándolo quizás a su extinción), o si de
alguna otra manera afectara perjudicialmente un componente del
ecosistema (Bennett , 1993)
Los microorganismos introducidos para el control
biológico desplazan organismos no-diana como parte de las
interacciones microbio-microbio mediada a través de la
competencia por
sitios o nutrientes. Desafortunadamente es muy difícil
monitorear los efectos del desplazamiento competitivo sobre la
ecología
de los microorganismos no-diana (Cook et al, 1996).
Se han realizado estudios de compatibilidad de P.
chlamydosporia con otros microorganismos, tales como
Micorrizas, Tricoderma y Rhizobium donde se
ha demostrado que no se produce desplazamiento competitivo de
estos microorganismos beneficiosos que también forman
parte de la rizosfera.¨
1.2.2 Alergenicidad
No existe ningún efecto diana de alergenicidad
como mecanismo de control de plagas (Cook et al, 1996). Sin
embargo, está demostrado que los hongos
mitospóricos pueden causar alergias o reacciones
alérgicas; no obstante, los ACB fúngicos reales o
potenciales no están entre las especies que producen
alergenos comunes (Latgé, 1991).
Existen informes de
reacciones alérgicas relacionadas con los hongos de
control microbiano, principalmente, en personas expuestas durante
la producción masiva y la aplicación (Austwick,
1980). Un grupo de científicos que trabajan con
Bauveria bassiana (Bals) Vuill informaron la
aparición de reacciones alérgicas de grado moderado
a severo, y por consiguiente la Agencia de Protección
Ambiental (EPA) lista este hongo como un sensibilizante
dérmico (Saik et al, 1990). Además, se ha
demostrado que el extracto crudo de Metarhizium anisopliae
contienen uno o más potentes alérgenos (Ward et al,
1998).
1.2.3 Toxicidad
La toxicidad como efecto diana está basada en la
capacidad que tienen los microorganismos para producir compuestos
que inhiben el crecimiento, desarrollo y comportamiento
de otros organismos (Cook et al, 1996.)
Los hongos secretan una amplia variedad de compuestos
muchos de los cuales son tóxico a las plantas, los
invertebrados o los vertebrados. M. anisopliae produce
destruxins y cytochalasins; B. bassiana: oosporein,
beauvericin, bassianolide y beauveriolide, Hirsutella
thompsonii: hirsutellin y Trichoderma harzianum:
peptaibols, por sólo nombrar algunos. El papel que
éstas toxinas juegan en la patogénesis no
está definido; aunque se sabe que algunos pueden
contribuir a la capacidad del hongo de superar a su hospedero.
Sin embargo, la producción de toxinas varía
según el aislamiento y necesariamente no juega un papel
importante en la virulencia en cada caso. La seguridad de estas
toxinas para los vertebrados se establece por la
combinación del conocimiento del modo de acción de
la toxina y los datos de pruebas de seguridad acumulados a
través de los años (Laird et al, 1990).
La producción de toxinas de un candidato
fúngico no debe utilizarse como único elemento para
impedir su uso como ACB. Primero deben hacerse consideraciones
respecto a los posibles efectos de la presencia de la toxina en
el producto
formulado, su destino después de la aplicación (ej.
proporción de degradación) y la posible
bio-acumulación en el hospedante o ambiente (Goettel et
al, 2001).
1.2.4 PatogenicidadEl principal uso de los
microorganismos empleados para el control biológico ha
sido, como patógenos de plagas (Cook et al, 1996), de
ahí que la patogenicidad hacia el organismo diana
normalmente es el efecto deseado. Sin embargo, la patogenicidad
hacia los organismos no-diana podría aparecer como un
efecto imprevisto y es sin duda el problema más importante
y controversial relativo al uso de los patógenos
microbianos como ACB (Goettel et al, 2001).
Los hongos, incluso las especies utilizadas para el
control biológico, pueden infectar una amplia variedad de
hospedantes que a veces incluyen mamíferos, . por ejemplo,
se informa de B. bassiana infectando caimanes americanos
cautivos (Saik et al, 1990; Semalulu et al, 1992 ) y
Aspergillus ochraceus Wilhelm que se cita como
patógeno oportunista en humanos (Sinski, 1975).
Además, se han informado varios casos de infecciones en
humanos por M. anisopliae (Burgner et al, 1998;
Revankar et al, 1999) y por P. lilacinus (Itin et al,
1998; Gutierrez-Rodero et al, 1999) en individuos
immunocompetentes e immunoincompetentes. En 1999, este
último fue nombrado por la Fundación Nacional para
las Enfermedades Infecciosas como un importante patógeno
fúngico (Toscano y Jarvis, 1999). Conidiobolus
coronatus es otro hongo entomopatógeno que ha sido
asociado con lesiones encontradas en humanos y caballos (Saik et
al, 1990)Evidentemente la evaluación de agentes
fúngicos de control microbiano debe incluir una
evaluación de su patogenicidad en organismos no-diana,
sobre todo los vertebrados, teniendo en cuenta la exposición
humana durante los procesos de
producción y aplicación.1.2.5 Disminución
de la población dianaEl potencial de riesgo en el uso
de los microorganismos depende de las consecuencias que se
derivan de la depleción de la población diana por
debajo del umbral natural ya que teóricamente no es
posible reducir drásticamente el nivel poblacional de una
plaga, sin afectar, también de forma adversa, otros
componentes del ecosistema.( Goettel et al,.1990)
La meta de cualquier programa de
control biológico es disminuir la población de una
plaga y esta reducción a su vez puede afectar
perjudicialmente a otros organismos no-diana que de una manera u
otra dependen de esta plaga. La gravedad del daño a la
población no-diana dependerá en gran medida de la
magnitud y velocidad de
la disminución del hospedero y del tiempo en el
que dicho hospedante ha sido su diana (Goettel et al,
2001).
El hongo P. chlamydosporia ha sido asociado con
suelos que suprimen naturalmente la multiplicación de
nemátodos de quistes, donde coexisten varias especies de
hongos nematófagos; además se ha demostrado que
produce alrededor de un 70% de parasitismo, por lo que no debe
producir daños por esta vía. (Hidalgo,
1999).1.2.6 Características específicas de P.
chlamydosporia relacionadas con el riesgo de toxicidadEl
potencial de efectos adversos de un hongo depende no sólo
del patógeno en cuestión y de su origen (nativo o
exótico), sino también de la forma de uso propuesta
(liberación inundativa o inoculativa) y el área
donde se va a aplicar (Hajek et al, 2003). Dentro de las
características de los hongos relacionadas con el riesgo
tenemos: rango de hospedero, susceptibilidad relacionada con la
dosis, persistencia y dispersión, organismos naturales o
genéticamente modificados y organismos exóticos o
nativos.Los hongos nematófagos utilizan gran diversidad de
tipos de asociaciones con sus hospederos y se agrupan en
atrapadores o parasitarios (Stirling, 1991). Los atrapadores han
especializado estructuras
como anillos contráctiles y/o clavijas para atrapar
nemátodos y se considera que tienen poca especificidad de
hospedante; en este grupo, el género Arthrobotrys
ha recibido la mayor atención. Más recientemente, ha
cambiado el interés hacia al uso de hongos
parásitos que atacan fases sedentarias de los de
nemátodos. Las dos especies más estudiadas han
sido: P. lilacinus y P. chlamydosporia (Kerry ,
2000). Estos hongos son parásitos oportunistas; cada
aislamiento puede diferir del resto en su capacidad de atacar
huevos y quistes de nemátodos (Goettel et al, 2001). Otros
autores han demostrado que el mecanismo de acción de P.
chlamydosporia es dosis dependiente, siendo la dosis
mínima efectiva 5000 clamidosporas /g de suelo y el
parámetro que podría afectar su efectividad es la
temperatura
del suelo, donde aparece de 22-30° C como el rango óptimo (Hidalgo,
1999).
Todos los estados de P. chlamydosporia ocurren en
el suelo. Las clamidosporas le permiten al hongo sobrevivir
cuando el hospedante es escaso (Kerry , 1984) y pueden ser usadas
para el establecimiento del hongo (De Leij FAAM y Kerry, 1991)
sobreviviendo en un número considerable, hasta tres meses
(Kerry et al, 1993). La dispersión en el suelo producto
del crecimiento de las hifas es muy limitada (Kerry, 1988) no
obstante el hongo puede colonizar la rizosfera y proliferar en el
suelo (Bourne et al, 1996). Como AMCP se usará en su forma
natural y se propone un uso inundativo, pero con una sola
administración al año (Hidalgo et
al, 2004) que es lo suficientemente baja como para que los
riesgos sean mínimos.1.2.7 Hospedante como alimento
humano La mayoría de los ACB son destinados para el
uso contra plagas, por lo que sólo podrían ser
accidentalmente consumidos por los humanos. No obstante, el
riesgo en el consumo humano
de patógenos se analiza con ensayos estándar que
emplean situaciones de máximo reto que normalmente
requieren estudios agudos de toxicidad / patogenicidad en
mamíferos (Tabla 1) (Goettel et al, 2001)
Con relación a esto, no se conocen ejemplos
documentados de efectos tóxicos producidos en animales o
humanos que hayan ingerido partes de plantas tratadas con agentes
microbianos (Cook et al, 1996).
Tabla 1. Ensayos requeridos para el registro de un
plaguicida microbiano bajo la Subdivisión M de las
guías de la EPA.
Para ver la tabla seleccione la
opción "Descargar" del menú superior
Fuente: Código
de Regulaciones Federales, 40, parte 158.740.
EP: producto final
TGAI: grado técnico de ingrediente
activo
Jaronski
- Regulación y registro.
Generalidades.El uso de AMCP ha aumentado
considerablemente en las recientes décadas, con los
productos registrados disponibles en la mayoría de los
países desarrollados y muchos países en
desarrollo (Copping LG, 2001). Los requisitos regulatorios
son costosos y consumen tiempo, no por la falta inherente de
seguridad, sino debido al costo del
desarrollo y registro de productos de mercado de
nicho pequeño. No obstante, es indiscutible que
el
conocimiento básico de los posibles efectos
tóxicos, tiene que ser evaluado antes del registro de
un producto basado en un patógeno fúngico y ser
considerado como requisito básico para cualquier AMCP
(Cook et al, 1996). De hecho, existe una tendencia general
hacia el cumplimiento de requisitos regulatorios más
exigentes (Barratt et al, 1999)
La implementación de las regulaciones es
considerada por muchos países y se espera que tenga un
aumento significativo durante la próxima década
como respuesta a los acuerdos tomados durante la Sexta
Convención de Diversidad Biológica (Convention on
Biological Diversity, 2002; Hokkanen et al, 2003).
Actualmente los AMCP representan apenas el 2% del
mercado mundial de los plaguicidas. En EEUU a finales del 2001
fueron registrados aproximadamente 195 ingredientes activos y 780
productos clasificados como bioplaguicidas, estimándose
cerca de 72 a base de bacterias, 47
de hongos, 40 de nemátodos y 2 de protozoos
(Agencia de Protección Ambiental (EPA), 2004)1.3.1
Regulación de los hongos como plaguicidas
microbianosEn la mayoría de los países se exige
el registro de los patógenos utilizados como AMCP; por
ejemplo, en EEUU el registro de agentes microbianos está
bajo la jurisdicción de la EPA, la Oficina de
Prevención, Plaguicidas y Sustancias Tóxicas y la
División de Prevención de Contaminación y se legisla bajo el Acta
Federal de Insecticida, Funguicida y Rodenticida (7 USC 136)
(Jaronski et al, 2003).
Antes de 1996, los métodos de
evaluación de los microorganismos estaban basados en los
protocolos de los
plaguicidas químicos, quedando aspectos que no estaban
bien definidos para este tipo de producto. Debido a esto y a la
experiencia obtenida con los primeros registros
solicitados para AMCP (US Environmental Protection Agency, 1996)
se revisaron las guías y se adoptó un nuevo sistema
separado de los plaguicidas convencionales, en la llamada Serie
OPPTS 885 que refleja una mejor comprensión de los datos
necesarios para los productos microbianos (OTA. Biologically
Based Technologies for Pest Control, 1995).En 1996 la
Organización para la Cooperación
Económica y el Desarrollo (OECD) armonizó los
requisitos para el registro de los plaguicidas biológicos
en los países miembros de la OECD al encontrar que
existían diferencias reales en los datos exigidos por cada
país, fundamentalmente en lo relacionado con las
propiedades físico-químicas, la
ecotoxicología y el comportamiento ambiental. Estas
diferencias en los datos exigidos, han sido uno de los aspectos
más perjudiciales dentro de las regulaciones de los AMCP.
En muchos casos, una compañía que desee registrar
un producto en varios países tiene que proporcionar
diferente documento de registro para cada país y cada uno
con requisitos y estructura
diferente, lo que aumenta significativamente los costos del
registro y aumentaría también el riesgo en los
países con menor desarrollo y menor exigencia en sus
regulaciones ya que se verían invadidos de ACB
potencialmente tóxicos (Goettel y Jaronski, 1997).Se han
realizado esfuerzos promisorios hacia la armonización de
los requisitos regulatorios entre los países. Por ejemplo,
bajo los auspicios de un Acuerdo norteamericano de Libre Comercio,
el Grupo de Funcionamiento Técnico de Plaguicidas, en
EEUU, Canadá y México ha
trabajado para armonizar los datos que exige el registro de los
AMCP en sus países (Neale y Newton, 1999;
OECD, 1999).
En la Unión
Europea se realizan esfuerzos similares para desarrollar
requisitos comunes de registro (OMS, 1981). Un proyecto
aún más ambicioso es regular y armonizar los datos
que se exigen para el registro de plaguicidas microbianos en los
29 países miembros de la OECD (OECD, 1999).El principio de
la evaluación de datos sometidos a una solicitud de
registro son las propiedades básicas del microorganismo,
tales como: la caracterización taxonómica, la
historia de su
uso, la biología, la especificidad de hospedero, el
modo de acción, la persistencia en el ambiente, la
presencia de ingredientes involuntarios (contaminantes,
metabolitos de preocupación potencial), y las propiedades
físicas y químicas; que unido a los estudios de
seguridad tienen el objetivo de
evaluar el riesgo que posee un candidato como AMCP, por medio de
pruebas de laboratorio
cuidadosamente seleccionadas. Estos protocolos de ensayo
combinan elementos de evaluación de máximo reto con
diferentes métodos de exposición (Goettel et al,
2001).La Organización Mundial de la Salud fue la
primera en proponer una estrategia de
pruebas por baterías de complejidad creciente para evaluar
el riesgo en mamíferos de los agentes microbianos
(ISO, 1992).
Los elementos de esta propuesta están incorporados en las
guías regulatorias actuales para Canadá, EE.UU. y
la Unión Europea. Estas guías reemplazan los
ensayos a largo plazo que se utilizan en la evaluación de
los plaguicidas químicos con exposiciones a corto plazo (1
mes) y combinan elementos de pruebas toxicológicas
convencionales tales como exposiciones orales y dérmicas
con vías más invasivas, inyección
intravenosa o intraperitoneal. Se utilizará una vía
u otra en dependencia del AMCP, la primera es la más
invasiva y la intraperitoneal se utiliza para agente microbianos
de gran tamaño de partícula que podrían
ocluir la vena cuando son administrados. Esta batería de
ensayos se refiere como Nivel I en el Código de
Regulaciones Federales 40, parte 158.740 (Siegel, 1997; Code of
Federal Regulations, 2001).
1.3.2. Ensayos de seguridadEl llamado Nivel I es
la batería inicial de pruebas toxicológicas,
consiste en bioensayos de laboratorio que evalúan un
riesgo máximo (por ejemplo, 10-100 veces la cantidad
recomendada en el campo). En la mayoría de los casos,
sólo se evalúa la calidad
técnica del ingrediente activo (es decir, el agente
microbiano no formulado). Sin embargo, bajo ciertas
circunstancias, la EPA puede exigir la comprobación del
patógeno formulado; como por ejemplo en los casos que se
sospeche que la formulación pueda reforzar el efecto del
microorganismo. Los resultados negativos en el nivel I, o sea la
ausencia de infectividad o patogenicidad indicarían que es
poco probable que el AMCP cause problemas al ser liberado en el
campo; ya que aunque remota, también existe la posibilidad
que pueda producir infección o mortalidad en especies
susceptibles o en situaciones únicas durante el uso real
del producto (Jaronski et al, 2003).
Los datos del nivel I se usan junto con la información disponible con respecto a los
modelos de
uso, rango de hospedero, persistencia, y otros factores para
evaluar el potencial de efectos adversos del agente. Si se
observan efectos adversos en este nivel, se realizarían
las pruebas del nivel II que tienen el objetivo de cuantificar
los niveles del agente microbiano a los que puede estar expuesto
el organismo no-diana susceptible. Si este agente muestra
persistencia en el ambiente en niveles elevados, entonces se
exigen los estudios del nivel III para determinar los efectos de
exposición crónica a los niveles microbianos. En el
nivel II y III se determina el riesgo real del AMCP. Los ensayos
de este último están diseñados para evaluar
el potencial de estos agentes o contaminantes microbianos de las
formulaciones que se reconocen como parásitos
intracelulares de células de
mamíferos o que han demostrado que lo son por los datos
obtenidos en los estudios de los niveles I y II e incluyen
pruebas adicionales agudas para evaluar el rango de especies
no-diana susceptibles, la ruta óptima de exposición
y/o relaciones exactas de dosis-respuesta. Finalmente, los
estudios del nivel IV, en las pruebas de campo reales o
simuladas, evaluarían si hay un problema en el uso, que
haría necesario la imposición de restricciones del
mismo. Jaronski et al. (2003) plantean que hasta el momento no se
le ha exigido estudios de los niveles III ó IV a
ningún agente microbiano. El AMCP no tiene que ser inocuo
ni en todas las pruebas ni en todas las concentraciones
evaluadas, pero sí deben ser analizadas las circunstancias
bajo las que produce infección o mortalidad.Este gran
grupo de pruebas evalúa los efectos del AMCP sobre
organismos no-diana entre los que se incluyen plantas, peces,
artrópodos beneficiosos, aves y mamíferos. Aunque,
tanto los plaguicidas químicos como los microbianos tienen
en común, aspectos de seguridad relacionados con la
toxicidad, la principal diferencia es la capacidad que tienen
estos últimos para multiplicarse y causar
infección. La infección puede ocurrir no
sólo en el organismo diana del agente microbiano, sino
también en especies no-diana, lo que indica la necesidad
de estudios de infectividad (Siegel, 1997).Siegel (1997) define
la infección como la alteración causada en el
hospedero por agentes vivos ya sea por multiplicación en
el tejido, por producción de toxinas o ambos; esta
definición relaciona la presencia de microorganismo al
daño tisular y sugiere este último como una
condición necesaria para considerar que existe
infección en los estudios de seguridad en
mamíferos. El simple recobrado de un AMCP no es
sinónimo de infección. Asumiendo que la respuesta
inmune del hospedero es constante, el recobrado de una
porción del inóculo así como la
redistribución del mismo entre los tejidos del
hospedero ocurrirán en una duración de tiempo que
dependerá de la vía de administración y la magnitud de la dosis.
En condiciones de infección, hay que demostrar que existe
multiplicación del agente microbiano (recobrado de una
cantidad superior a la administrada, recobrado de formas
vegetativas cuando se administran esporas, problemas de
aclaramiento en el tiempo) unido a daño tisular. Esta
asociación es esencial, porque la aparición
solamente de daño en los tejidos (como sucede en la
respuesta inflamatoria) o muerte en los
animales de experimentación puede ser causada por la
naturaleza
física del inóculo y/o la respuesta del hospedero a
una proteína extraña y dichas reacciones son
independientes del agente. De ahí que los grupos controles
tratados con el
vehículo autoclaveado sean tan importantes en estudios de
infectividad ya que se puede determinar si el efecto adverso se
debe únicamente a la presencia de esa proteína
extraña. El término patogenicidad denota la
capacidad intrínseca de un microorganismo para penetrar
las defensas del hospedero y el término virulencia se
refiere a la velocidad e intensidad con que esto se logra
(Siegel, 1997).
1.3.3 Estudios de toxicidad aguda e
irritación
Los estudios de Toxicidad / Infectividad / Patogenicidad
(TIP) del nivel I están diseñados para detectar
efectos tóxicos agudos de los componentes
biológicos o no-biológicos de la formulación
del AMCP; si en estos estudios se observaran efectos
tóxicos en ausencia de signos de
infectividad o patogenicidad sería necesario realizar
estudios de toxicidad aguda del nivel II.
La evaluación toxicológica se realiza con
respecto a tres puntos finales:
- Patogenicidad del AMCP y de los contaminantes
microbianos - Infectividad / persistencia inusual del AMCP y de los
contaminantes microbianos - Toxicidad del AMCP, de los contaminantes microbianos
y del producto final.
Los ensayos de TIP Aguda tienen como objetivo evaluar el
riesgo de un AMCP, a través de la determinación de
la Toxicidad / Patogenicidad de una dosis única
administrada por diferentes vías a los animales de
experimentación. La vía oral es la recomendada por
la EPA y otras agencias regulatorias para el ensayo que
inicia el estudio toxicológico ya que es la vía
posible, directa o indirecta, de entrada del producto al
organismo humano y a otras especies animales que estén en
contacto con él; con la intraperitoneal se obtiene
información de riesgo una vez que el microorganismo haya
atravesado la barrera de la piel. En el
caso de la vía dérmica, en la EPA se plantea que en
raras ocasiones podría esperarse que un microorganismo
pueda pasar la barrera de la piel o infectar células
epiteliales de animales hospederos sanos, sólo por el
hecho de haber sido puestos en contacto con ella; de ahí
que el propósito de este ensayo sea evaluar efectos
tóxicos debido a componentes químicos o
no-biológicos de una formulación del AMCP aplicado
por esta vía (OECD, 1996).
El objetivo de los estudios de irritación es
determinar el potencial irritante que pueda tener la sustancia de
ensayo sobre determinadas estructuras del organismo, en
dependencia de las cuales se clasifican en estudios de
irritación dérmica u ocular. Los ensayos de
irritación ocular son requeridos por muchas agencias
reguladoras como la OECD (García et al, 1988) la
Organización Internacional de Estándares (ISO)
(Price y Andrews, 1985 ) y el Centro Estatal para el Control de
Medicamentos (CECMED), entre otros, para el etiquetado y
clasificación de los productos. García y
colaboradores (1988) establecieron la tabla de
clasificación del potencial irritante de los productos e
indicaron como límite de aprobación o rechazo, el
valor de 20
(Tabla 6), debido a que por consideraciones
oftalmológicas, aquel producto que en el ensayo de
irritación ocular muestre un valor de hasta 25 en la
escala de Draize (Draize et al 1994), se clasifica como no
irritante para el humano (US Environmental Protection Agency,
1996).
La rata como especie roedora y el conejo como no roedora
son los animales de laboratorio más utilizados y
recomendados por las principales agencias regulatorias en
investigaciones farmacotoxicológicas lo que
está avalado por el considerable volumen de
información que existe sobre cada especie y que son de
fácil obtención y manipulación en
condiciones de laboratorio. En los estudios dérmicos y
oculares el conejo es la especie preferida debido a la
permeabilidad superficial característica de su piel y al
tamaño de los animales que hace que sea mayor el
área a trabajar, así como, ser muy sensibles para
la detección de la irritación ocular y tener ojos
no pigmentados (permiten observar las lesiones en el iris) y de
gran tamaño con respecto al peso corporal que facilita la
observación.
En estos estudios se emplean grupos controles para
asegurar que los efectos observados están asociados con la
exposición a la sustancia de ensayo. Los grupos controles
negativos no tratados, como su nombre lo indica no reciben
tratamiento alguno. El control tratado con el AMCP inactivado se
utiliza para descartar posibles efectos que pueden producirse en
el animal de ensayo a través de mecanismos diferentes a la
infección y brinda una información útil para
determinar el mecanismo de patogénesis. El grupo control
tratado con el vehículo se utiliza si se emplean otros
vehículos para administrar la sustancia de ensayo
diferentes de solución salina o agua destilada
(OECD, 1996).
El reto básico de los estudios de seguridad es
determinar si el AMCP es razonablemente seguro.
Así lo resumió Burges (1981) cuando planteó
que:
"una situación de cero riesgo no existe,
ciertamente no sólo con plaguicidas químicos,
sino también con agentes biológicos ya que no se
puede demostrar un efecto negativo absoluto. El registro de un
químico es esencialmente una declaración de uso
en el que los riesgos son aceptables y el mismo debe ser
aplicado a los agentes biológicos".
Se ha visto cómo los hongos pueden ser utilizados
como agentes de control biológico de manera segura y con
éxito,
de hecho, son producidos para el control inundativo de plagas de
artrópodos, nemátodos y cizañas sin efectos
perjudiciales sobre el ambiente o sobre la seguridad de los
organismos no-diana. También se han utilizado
patógenos fúngicos para el control biológico
clásico de insectos y cizañas. Goettel et al (2001)
plantearon que hasta la fecha no se ha documentado ningún
efecto perjudicial relacionado con el uso de los hongos como ACB.
Sin embargo, se ha demostrado que poseen propiedades que los
hacen potencialmente peligrosos tanto para el hombre como para el
ambiente en general. Por consiguiente, el desarrollo y uso de
hongos como agentes de control de plagas requiere una
valoración de sus riesgos potenciales, comenzando con los
efectos tóxicos en mamíferos (Hajek et al,
2003).
Existe muy poca información publicada acerca de
los perfiles de seguridad de los AMCP y los pocos que existen han
sido generados por la industria en
el curso de desarrollo y registro de nuevos productos. Estos
datos son privados y de difícil acceso. Sin embargo, se
han publicado los resultados de algunos estudios agudos
utilizando diferentes vías de exposición, como son:
inhalación, inyección subcutánea,
intraperitoneal e intravenosa, irritación dérmica y
ocular, estudios dérmicos de sensibilización y
estudios en la dieta.(Goettel y Jaronski, 1997; Ward et al, 1998;
Smits et al, 1999; Vestergaard et al, 2003; Strasser et al,
2000)
Con respecto a la toxicidad, se conoce que muchos
metabolitos producidos fundamentalmente por hongos
entomopatógenos (que son los más estudiados) causan
toxicidad en mamíferos, lo que se considera como un
problema de seguridad para esos AMCP (Undeen, 1990 ; Trammer et
al, 1999)
La germinación del microorganismo en el hospedero
(rata o conejo) puede ser inhibido o estimulado por varios
factores como por ejemplo pH,
presión osmótica, presencia de iones
específicos, propiedades biológicas de las esporas
y la temperatura corporal de los mamíferos, donde valores por
encima de 30°C, pueden ser una barrera importante frente a la
infección (Mier et al, 1994; Solter et al, 1997)
.
En el caso de la vía oral pueden ocurrir tres
eventos:
- Las clamidosporas pueden pasar a través del
tracto digestivo sin ser digeridas y mantenerse viables en las
heces fecales (Hylis et al, 1998 ) - El tejido del hospedero puede no ser el idóneo
para el establecimiento, desarrollo o reproducción del
patógeno. (Hajek y Butler, 2000; Vey et al,
2001) - El hospedero puede destruir activamente al
patógeno durante su migración al tejido diana por vía
de la respuesta celular inmune y la posibilidad de la inmunidad
humoral.
En el caso de la patogenicidad, se ha demostrado la
presencia de los hongos, tales como P. Lilacinus, en
infecciones en humanos (Toscano y Jarvis, 1999). Sin embargo,
las pruebas de seguridad en mamíferos de este hongo
nematófago que incluyeron toxicidad aguda oral,
dérmica y pulmonar en ratas y estudios de
irritación en conejos indicaron la relativa seguridad de
este microorganismo; por lo que se ha sugerido que posiblemente
ese aislamiento de P. lilacinus colectado de
nemátodos no presenta riesgos para la salud animal y
humana (Goettel et al, 2001.
Relacionado con la infectividad, se ha demostrado que
los hongos poseen una gran variedad de estados de vida que hacen
que pueda sobrevivir cuando las condiciones ambientales no son
las óptimas para su normal crecimiento y desarrollo
(esporas); por lo tanto no es sorprendente que estos
microorganismos se mantengan viables en los tejidos de los
mamíferos durante algún tiempo (Siegel,
1997.
Estos resultados apoyan la utilización segura de
los hongos en ambientes en los que pueda ocurrir
exposición humana accidental, sin considerar que para
tales prácticas se deben usar medios de protección
como medida de seguridad y ante el eventual estado de
inmunosupresión que pudiera tener algún operario
relacionado con la aplicación del ACB.
De manera general, con los estudios de toxicidad se ha
podido demostrar la seguridad para los mamíferos durante
el uso de algunos ACB de origen fúngico, como es el caso
de Bacillus spp., utilizado ampliamente en el mundo para
el control de insectos y del cual se informa que tiene bajo
potencial para producir patogenicidad en los vertebrados. Las
cepas registradas se han evaluado extensivamente para determinar
posibles efectos sobre organismos no-diana, incluyendo
mamíferos como parte de las exigencias del registro y no
se ha observado ningún efecto dañino (Laird et al,
1990). Así mismo, varios aislados de B. bassiana
han sido evaluados en estudios de seguridad en vertebrados y se
ha demostrado que el hongo no produce infección ni
toxicidad, aunque se aclara que se deben tomar precauciones para
evitar la inhalación de grandes cantidades de conidios.
(Goettel y Jaronski, 1997; Copping, 2001).
Zimmermann (1993), realizó una revisión de
datos de seguridad de M. anisopliae en animales de
sangre
caliente y concluyó que hubo ausencia de síntomas
de toxicidad o patogenicidad cuando los conidios de este hongo
fueron aplicados por diferentes métodos a las aves,
ratones, ratas, curieles y conejos.
Los plaguicidas de origen biológico, generalmente
proporcionan una opción medioambiental benigna para el
control de plagas. Sin embargo, esto no significa que ellos
están completamente libres de riesgos para la salud y el
ambiente. De hecho, además del potencial de riesgo para
organismos no-diana (toxicidad, patogenicidad, desplazamiento
competitivo y alergenicidad), existe también riesgo por
contaminantes microbianos y por otras sustancias utilizadas en la
formulación final (ejemplo: excipientes, diluentes,
protectores ultravioleta, etc.) y riesgos por el hecho de que
algunos patógenos microbianos generales son infecciosos
para vertebrados e invertebrados. La evaluación
toxicológica de plaguicidas microbianos es por
consiguiente necesaria para proteger la salud y seguridad del
hombre, los animales y el ambiente.
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Liseth García García
Gleiby Melchor Orta
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
Grupo Farmacología-Toxicología,
Carretera de Tapaste y Autopista Nacional, La Habana,
Cuba.