- Resumen
- Materiales y métodos 1. Cepas y
condiciones de crecimiento. - Resultados
- Discusión
- Conclusiones
- Agradecimientos
- Referencias
Dos grupos de genes, nar
(GHJI) y mol (moa, mob, mod, moe, mog y molR),
codifican para los componentes estructurales de la enzima
inducible Nitrato Reductasa Respiratoria A (NRA). En estudios
previos, se observó que la mutación narC-8 bloqueaba la
manifestación del carácter Lac+ conferido
por la fusión transcripcional moa::Iac. Para
determinar el posible papel controlar del operón
narC, se caracterizó otra mutación independiente
y fue clasificada como narC-MM78. Cepas isogénicas mutantes,
doble y simple, fueron construidas y se observó que la
referida mutación parece ejercer el mismo efecto que
narC-MM78. Cepas isogénicas mutantes, doble y simple, fueron
construidas y se observó que la referida mutación
parece ejercer el mismo efecto que narC-8. Las condiciones
de cultivo que controlan la biosíntesis de la NRA, no
lograron suprimirlo fenotípicamente aún adicionando
concentraciones variables de nitrato,
molibdato, nitrito, azida o clorato. Sin embargo, cuando la cepa
de fusión era narC+, esas mismas condiciones
modularon la manifestación del carácter Lac+. Los
resultados obtenidos permiten proponer un papel controlador de
narC+ activando la expresión de moa. Esa
acción seria ejercida
dentro de un sistema coordinado de circuitos de control fisiológico y
genético, el cual mantendría un balance adecuado en la
biosintesis de la NRA durante la respiración
anaeróbica del nitrato, en E. coli K12.
Palabras claves: Nit- pleiotrópicos; operón
nar; regulación moa; regulación
nar-moa; E. coli.
Abstract
Characterization of a nar mutation and its effect on the
transcriptional expression of a moa::lac operon fusion in
Escherichia coli K12
Two gene groups, narC (GHJI) and mol (moa, mob, moe, mog
y molR), encode for the structural compenents of the respiratory
nitrate reductase A (NRA) inductible enzyme. In previous studies
it was observed that narC-8 mutation blocked the Lac+ character
expression confered by the transcriptional moa::lac fusion. In
order to determine the posible controler role of the narC operon,
another independent mutation was characterized and was classified
as narC-MM78. Double and simple mutant isogenic strains were
constructed and it was observed that the mutation could have the
same effect as narC-8. The culture conditions controlling the NRA
biosynthesis did not suppress it phenotipically even when
variable concentrations of nitrate, molybdate, nitrate, azide or
clorate were added. However, the same conditions modulated the
Lac+ character expression when the fusion strain was nar+. The
results permit to propose a nar+ controler role by activating the
moa expression. That action could be carried out in a coordinated
system of physiological and genetic control circuits, that could
keep an adequate balance in the NRA biosynthesis during the
anaerobic nitrate respiration, in E. coli K12.
Key words: Nit- pleiotropic; nar operon;
moa regulafion; nar-moa regulafion; E.
coli
La reducción del nitrato a nitrito es un proceso respiratorio inducible
que juega un papel central en el metabolis mo anaeróbico de
las bacterias entéricas y
desempeña un control epigenético clave en la
regulación de otras vías metabólicas de
oxidorreducción inducibles (Ingledew and Poole 1984). La
Nitrato Reductasa A (NRA) de E. coli es la enzima terminal
de la cadena respiratoria y requiere de un molibdocofactor (MoCo)
para su activación catalítica (Amy and Rajagopalan
1979, Giordano et al. 1990, Miller and Amy 1983; Ruíz-
Herrera and DeMoss 1969, Stewart 1988, Stewart and MacGregor
1982, Wootton et al. 1991). Los genes nar (anteriormente
chlC) (Puig and Azoulay 1967, Stewart and MacGregor 1982)
mapean en el minuto 27 sobre el cromosoma de E. coli
(Bachmann 1990) y codifican para:
i. la apoNRA (operón narGHJI) (Bonnefoy-Orth et
al. 1981, Edwards et al. 1983, Sodergren and DeMoss
1988);
ii reguladores transcripcionales del operón
narGHJI (operón narX, L) (Li et al. 1994, Walker and
DeMoss 1993); iii. y una proteína que media la exportación de nitritos
(gen nark) (Rowe et al. 1994). Otros genes renombrados
mol (moa, mob, mod, moe, mog) (anteriores chlA, B, D,
E y G) (Bachmann 1990, Shanmugan et al. 1992),
además del moiR, participan en el metabolismo del MoCo (Amy
and Rajagopalan 1979, Amy 1981, Jhonnson et al. 1984, Jhonson
and Rajagopalan 1987a, 1987b; Lee et al. 1990, Miller and Amy
1983, Pitterle, Rajagopalan 1989, Rivers et al.
1993).
Las mutaciones en el operón narGHJI
confieren el fenotipo Nit- (defecto en la reducción del
nitrato a nitrito), mientras que en los genes mol ocasiona
la pérdida pleiotrópica en la actividad de distintas
molibdoenzimas (reductasas y deshidrogenasas), por ejm. la NRA y
la Formiato Deshidrogenasa del sistema Formiato Hidrógeno Liasa (fenotipo
Nit- Gas-) (Puig, Azoulay 1967,
Stewart 1988). Los primeros mutantes Nit- fueron seleccionados
por resistencia al clorato
(Piéchaud et al. 1969), pero en su mayoría las
mutaciones son pleiotrópicas (Ball, Ortega 1985, Casse 1970,
Fiimmel and Haddock 1979, Miller and Amy 1983, Ortega de L. 1982,
Puig and Azoulay 1967, Stewart and MacGregor 1982); no obstante,
recientemente fue desarrollado un método nuevo referido como
TNC que permite ampliar la variedad de genes mutados (Ortega de
L., 1994). En la biosíntesis de la apoNRA, el nitrato y la
anaerobiosis, además de productos codificados por los
genes reguladores narL, fnr, him y mol son requeridos para
la expresión transcripcional máxima del operón
naGHJI (Chippauz et al. 1981, Pascal and Chippaux 1982,
Ruiz-Herrera and Salas Vargas 1976, Shroder and Darie 1993, Spiro
and Guest 1990, Stewart 1883), la azida y el molibdato modulan
los niveles de biosíntesis (Chippauz and Pichinotty 1970,
Giordano et al. 1980). Por el contrario, se conoce muy poco sobre
la regulación de la biosíntesis del MoCo y la
expresión de los genes mol (Miller and Amy 1983,
Miller et al. 1987, Pascal and Chippaux 1982, Stewart
1988).
En estudios con fusiones traduccionales
moa:lacZ, la expresión del operón moa
(anteriormente chlA) (Bachmann 1990, Shanmugan et al. 1992) fue
sensible al control negativo mediado por la aerobiosis y
posiblemente por el MoCo. (Baker and Boxer 1991). Otros estudios
realizados con una fusión trascripcional moa::lac
(Ortega de L. 1989), la composición del medio y el estado fisiológico del
cultivo actuaban como moduladores (Ortega de L. 1994), igualmente
permitieron evidenciar por primera vez que la presencia de una
mutación nar-, la llamada chlC-8 (Puig et al. 1969b),
bloqueaba totalmente la expresión de la fusión
(fenotipo Lac-), detectado por incapacidad de crecer y fermentar
la lactosa y ausencia de actividad enzimática
galactosidasa (Ortega de L., resultados inéditos).
El presente trabajo está dirigido a
caracterizar una nueva mutación, clasificada preliminarmente
como nar-, la nar-MM78 (Ball 1986, Ball y Ortega de
L. 1985), y estudiar su posible efecto sobre la expresión de
la fusión transcripcional moa::lac, en células crecidas bajo
diferentes tratamientos.
MATERIALES Y MÉTODOS 1.
Cepas y condiciones de crecimiento.
Las cepas bacterianas de E. coli y de fago se
encuentran relacionadas en la tabla 1. Las bacterias se
cultivaron a 300 C. Los cultivos aeróbicos fueron agitados
en fiolas de 250 ml conteniendo 10 ml de medio; los
anaeróbicos se prepararon por inoculación en tubos
totalmente llenos con el medio y sin agitación; cuando fue
necesario se incubó en anaerobiosis estricta bajo atmósfera de hidrógeno y
bióxido de carbono, utilizando el sistema
Gas-Pack.
2. Medios de
cultivo.
Las sales de medio mínimo contienen (por litro):
5.98g de KH2PO4; 10.18 g de K2HPO4. 3H20; 1.12g de Na3H5C6O7 .
2H20; 0.31g de MgSO4. 6H20 y 2,0 g de (NH4) 2SO4. Los
amino-ácidos se agregaron a 40
ug/l. Cuando se indicó, las sales fueron suplementadas con
KNO3 (Nit), KNO2 (Nir), NaN3 (Azi), K2MO4 (Mob), KC1O3 (Chl) a la
concentración señalada en el texto. La composición de
los medios ricos (LB, nutritivo y diferencial) fue reportada
(Miller 1972).
El medio agar MNT contiene (por litro): 40g de MacConkey
base, 2.5g de KNO3, 4g de glucosa y l0g de trimetil
amina N-óxido (Stewart and MacGregor 982). El medio agar
diferencial TNC contiene (por litro): sales de medio mínimo
agarizadas suplementadas con 0,lg de cloruro de 2, 3, 5 trifenil
tetrazolio (TTC), 2 g de KNO3, 2g de casaminoácidos, 2 g de
glucosa y vitamina B1 (Ortega de L. 1994); se adicionó
triptófano según el requerimiento de la cepa
bacteriana. Cuando fue necesario se utilizó (por mililitro:
30 g de kanamicina (Kn), 15 g de tetraciclina
(Tc), 50 g de ampicilina (Ap) y 40 g de 5-bromo
-4-cloro-3 indolil--D-galactósido (X-Gal). Como
fuente de carbono en los medios sintéticos se utilizó
la glucosa, galactosa y lactosa; g/1 y 1 g/l en los cultivos
anaeróbicos y aeróbicos, respectivamente.
3. Técnicas
genéticas.
La transducción generalizada mediada por el fago P1
vir se realizó siguiendo el procedimiento de Lennox
previamente descrito (Miller 1972). La mezcla de
transducción se lavó por centrifugación y
concentrada diez veces antes de sembraren superficie sobre los
medios de aislamiento. Clones transductantes independientes
fueron reaislados en el mismo medio y sometidos a los ensayos fenotípicos y
fisiológicos para caracterizarlos. El grado de ligamiento de
la mutación con el marcador de transductantes con respecto
al total de los clones ensayados.
4. Caracterización de las cepas
bacterianas.
Ensayos fenotípicos. Los requerimientos
nutricionales, fermentación de
azúcares y resistencia a drogas fueron ensayados
según descrito (Miller, 1972). El método de Stewart y
MacGregor (1982) se utilizó para distinguir entre grupos de
mutaciones nar; el tamaño y color de las colonias evaluados
por crecimiento en el medio MNT, bajo anaerobiosis estricta; la
sensibilidad al clorato fue valorada por crecimiento con
diferentes concentraciones de clorato utilizando el método
de Piéchaud et al. (1969) modificado por Ortega de L.
(1982).
5. Ensayos fisiológicos.
5. 1. Reducción fisiológica del nitrato
(Nit+), se valoró
espectrototompréticamente agregando reactivo de nitritos a
cultivos crecidos anaeróbicamente con caldo nutritivo
glucosado conteniendo nitrato (Piéchaud et al. 1969).
También en medio sólido ensayando la producción de nitritos a
partir de colonias previamente crecidas por rayado sobre agar
nutritivo glucosado; un papel filtro impregnado con nitrato se
colocó sobre los rayados y después de 20 seg. fue
reemplazado por otro impregnado con reactivo de nitritos
(Chippaux et al. 1981);
5.2. Reversión fenotipica por molibdato, se
verificó la acumulación de nitritos, como se indica en
el punto anterior, pero el caldo fue suplementado con 10-3 M de
molibdato (Glaser and DeMoss 1971),
5.3. Aparición de colonias rojas (TNC+), por
crecimiento en superficie sobre el medio diferencial TNC
(tetrazolio, nitrato, casaminoácidos) (Ortega de L. 1994),
5.4 Liberación de gas (Gas+), se verificó la presencia
de burbujas en tubos durham, después de una noche de
crecimiento anaeróbico en caldo nutritivo glucosa (Puig et
al. 1969).
6. Ensayos enzimáticos.
6.1. La actividad ßgalactosidasa (ßGal), se
estimó en células enteras previamente tratadas con
cloramfenicol (50 µg/ml) y mantenidas en frío hasta el
momento de realizar el ensayo; se siguió la
hidrólisis del -nitro fenil-ß- D-galactopiranósido
(ONPG), y los valores fueron expresados
como Unidades Miller (Miller 1972).
6.2. La actividad específica NR, fue estimada en
células enteras inducidas durante una noche; la
reducción del nitrato a nitrito se valoró
espectrofotompréticamente en cultivos crecidos
anaeróbicamente una noche con glucosa y en una mezcla de
reacción con formiato y bencil viológeno reducido
(BVH), respectivamente (Ruiz-Herrera, DeMoss 1969); las proteínas fueron
determinadas por el método de Lowry modificado por Markwell
et al. (1978).
Caracterización de la mutación nar-MM78 Las
mutaciones en cualquiera de los genes nar confieren el fenotipo
no pleiotrópico Nit- Gas+ (Puig and Azoulay 1967) y son TNC+
(Fimmel and Haddock 1979; Ortega de L. 1994). Para el presente
trabajo se escogió la cepa MM78, que fue aislada como un
clón independiente TcR ChlR, después de la
mutagénesis por translocación del transposón
Tn10 portado por el fago NK55 y caracterizada
preliminarmente como nar-MM78 (Ball y Ortega de L. 1985);
presentó el fenotipo Nit- TNC+ y además, conservó
la actividad fumarato reductasa (Frd+), lo cual descartaba la
presencia de una mutación fnr que también
confiere el fenotipo no pleiotrópico (Lambden and Guest
1976).
Se determinó la actividad enzimática NR
asociada con diferentes donadores de electrones (Tabla 2). Los
valores obtenidos para la cepa
MM78 se corresponden con la cepa mutante de referencia LCB426 que
contiene la mutación chl C- 8 (Puig et al. 1969b).
Estos resultados muestran que el fenotipo Nit- de la MM78 sé
corresponde con la cepa mutante de referencia LCB426 que contiene
la mutación chlC-8 (Puig et al. 1969b) que el fenotipo Nit-
de la MM78 es atribuible a una mutación nar y el factor de
disminución en la actividad BV-NR, respecto a la cepa
parental silvestre Pc90, fue similar al reportado para una
mutación narG (Stewart and MacGregor 1982).
El método desarrollado por Stewart y MacGregor
(1982) se utilizó para determinar preliminarmente la
localización de la mutación dentro de la región
nar, comparado su comportamiento con distintas
cepas control genéticamente caracterizadas (Tabla 1). Se
analizaron el tamaño y color de las colonias y la
sensibilidad a diferentes concentraciones de clorato, pero en
ninguno de los ensayos realizados los resultados obtenidos se
correspondieron con lo esperado (Tabla 3).
Tabla 3. Actividad enzimática NR con
diferentes donadores de electrones.
a Los valores se expresaron como µmoles de
NO2/min/mg proteínas. b Variación relativa
de actividad específica MM78/PC90
La localización cromosomal y el origen de la
mutación nar-M778 (espontáneo o por
inserción del transposón Tn 10).
Se realizaron experimentos de transducción
mediados por el fago P1 vir para determinar la localización
y el origen de la mutación nar (espontáneo o por
inserción del transposón Tn 10)y además construir
cepas isogénicas simples y dobles mutantes conteniendo la
fusión transcripcional moa::lac. La cepa MM78 se
utilizó como donante del fenotipo TNC+ a la receptora M120
(Tabla 4, cruce 1) y se observó un 28% de
contransducción con Trp+ como marcador de selección; todos los TNC+
fueron Nit-. Este valor cae dentro del rango esperado de 20 – 50%
para mutaciones nar (Fimmel and Haddock 1979), Guest 1969,
Puig et al. 1969b, Venables and Guest 1968), lo cual comprueba la
localización originalmente propuesta. Ninguno de los
transductantes Trp+ Nit- analizados recibió el fenotipo TcR,
indicando el origen espontáneo de la mutación nar-MM78,
y descartando así la presencia de una inserción
nar::Tn10, en cuyo caso el ligamiento esperado
entre los fenotipos TNC+ y TcR debió ser del 100%. Ambos
hechos fueron corroborados en un segundo cruce (Tabla 4, cruce 2)
utilizando KnR como marcador de selección más proximal,
conferido por un transposón híbrido insertado en la
posición zch-31 17::Tn10KnR a los 27', 25" del
cromosoma de la cepa de E. Coli CAG1855l (Singer et. al. 1989),
entre la región nar (27') y el operón trp
(28') (Bachmann 1990). La cepa MM78 fue utilizada como receptora
y el 67% de los KnR fueron TNC- y Nit+; además todos ellos
conservaron el fenotipo TcR, contrario a los esperado en una
inserción nar::Tnl0.
Tabla 4. Resultados de ligamiento. a
Sólo se indicaron los genotipos y fenotipos considerados en
cada cruce.
Todos los clones TNC+ y TNC- fueron Nit- y Nit+,
respectivamente.
Efecto de la mutación narMM78 sobre la
manifestación del fenotipo lac positivo conferido por
la fusión moa::lac.
Cepas con la doble mutación moa-MA25::lac
nar MM78 se construyeron utilizando como receptora a uno
de los clones transductantes Trp+ TNC+ obtenidos en el primer
cruce (Tabla 4, cruce 1), el denominado JM1 , y la cepa MA25 como
donante de la fusión (Tabla 4, cruce 3). El 20% de los
transductantes aislados como Gal+ se hicieron Gas-, debido al
efecto pleiotrópico dominante de la mutación moa (Puig
and Azoulay, 1967) y ninguno de ellos revirtió
fenotípicamente al carácter Nit+ por crecimiento con
molibdato (Glaser and DeMoss 1971). Este valor porcentual
también se observó cuando esa misma fusión fue
contransducida con Gal+ a la cepa nar+, obteniéndose la is
ogénica simple mutante M128 (Ortega de L. 1982). Por el
contrario, todas las cepas con la doble mutación moa::lac
nar-MM78 aquí obtenidas se comportaron como Lac-, siendo
incapaces de crecer y fermentar la lactosa y dar colonias azules
en el medio XGal, indis tintamente de las condiciones de
aeración. Por lo tanto, los resultados sugieren que la
mutación nar-MM78 está afectando negativamente
la expresión de los genes lac bajo el control del
promotor pmoa, igual a lo observado previamente con la
mutación chlC-8 (Ortega de L., resultados inéditos)
donada por la cepa LcB426 (Puig et al. 1969b).
En un cruce siguiente se verificó
genéticamente la presencia e integridad funcional de la
fusión moa::lac (Tabla 3, cruce 4). Uno de los clones
doble mutante (Tabla 4, cruce 3), denominado JM5, fue utilizado
como donante para contrasducir la fusión a la receptora
isogénica M120 nar+. El 20% de los transductantes
Gal+ recibieron simultáneamente loS fenotipos TNC+ Nit- Gas-
Lac+ conferidos por la fusión original moa- MA25::lac
(el clón JM15 fue recuperado para estudios subsiguientes),
descartándose la posibilidad de que el fenotipo Lac- de la
cepa JM5 se hubiese originado por alteración en la
integridad física del fragmento que contiene la
fusión, ocurrida durante el proceso de
transducción.
Influencia mediada por factores
fisiológicos.
Era de interés investigar la
posibilidad de revertir fenotípicamente el efecto de la
mutación nar-MM78 sobre la expresión de la fusión.
Los siguientes factores fisiológicos fueron evaluados
individualmente, ensayando concentraciones graduales: i. El
nitrato (Nit), molibdato (Mob) y asida (Azi) que controlan la
biosíntesis de la NRA (Stewart, 1988); ii. el clorato (Chl),
utilizado en la selección de mutantes Nit-, y iii. el
nitrito (Nir), por ser el producto resultante de la
reducción del nitrato (Puig and Azoulay 1967).
El crecimiento anaeróbico de la cepa doble mutante
JM5, a expensas de lactosa, fue cuantificado comparando con cepas
isogénicas de referencia: dos con la simple mutación
moa::lac (JM15, Ml 28) y una con la deleción
?lac (M120) (Tabla 5). Ninguna de las condiciones
ensayadas permitió el crecimiento detectable en la
doble
Tabla 5. Expresión anaeróbica
de la fusión moa::lac, ensayando el crecimiento a
expensas de lactosas en cultivos sometidos a diferentes
tratamientos.
a La lactosa (Lac), glucosa (Glu) y galactosa (Gal)
fueron adicionadas a una concentración final de 2 g/l. Otras
concentraciones variables de Molibdato (Mob), Nitrito (nir),
Azida(Azi), Nitrato (Nit) y Clorato (Chl) también fueron
ensayadas (Ver leyenda de la Fig. 1), pero los resultados se
mantuvieron invariables a las 24 y 48 hs. de incubación.
Crecimiento celular (A 600) mutante, comportándose como el
control que presenta la delación ?lac, ni tampoco
afectó el MedULA, Revista de la Facultad de
Medicina, Universidad de los Andes. Vol. 4
Nº 1-4. 1995. Mérida, Venezuela crecimiento de las
cepas simple mutantes. La incapacidad de utilizar la lactosa no
está relacionada con alguna alteración en el
metabolismo anaeróbico del piruvato, la cual es conferida
por una mutación en el gen ana ligado al operón
narGHJI (Bachman 1990, Pascal et al. 1981), ya que los
valores alcanzados por la doble mutante son muy similares a los
controles creciendo anaeróbicamente a expensas de glucosa
(Tabla 5). La expresión anaeróbica de la fusión
moa::lac también fue evaluada cuantificando la actividad
enzimática ßGal, pero tampoco se detectó actividad
en la doble mutante, igual que el control con la delación
?lac. No obstante, en el caso de la simple mutante M128
todos los factores ensayados influyeron parcialmente sobre la
expresión (Fig. 1); siendo favorecida con el incremento en
las concentraciones de Mob, Nit y Chl, respectivamente, contrario
al efecto ejercido por Nir y Azi.
Por último se estudió el efecto de la edad del
cultivo sobre la expresión anaeróbica de la fusión
a las 12 "24 h. de incubación (Fig. 2). La cepa doble
mutante JM5 no presentó crecimiento ni actividad ßGal
detectables. En el caso de la simple mutante JM15, que contiene
la fusión donada por la doble mutante JM5 (Tabla 1), los
valores de actividad permanecieron invariables a las 24 h. de
incubación, y fueron comparables a los cuantificados en la
cepa Ml 28. Estos resultados corroboraron que la doble mutante
JM5 contiene una fusión potencialmente funcional y que el
fenotipo Lac- es atribuible al efecto negativo de la
mutación nar-MM78 sobre la expresión del
promotor pmoa. Figura 1. El número de las barras
indica las concentraciones ensayadas de Molibdato (Mob), Nitrito
(Nir), Azida (azi), Nitrato (Nit) y Clorato (Chl), en el orden
creciente (mM): 1(10- 4), 2(10-2), 3(10-1) y 4(1); 5(20), 6(30),
7(40) y 8(200); 9(4), 10(8), 11(12), 12(16) y 13(80). El
asterisco indica la concentración utilizada como referencia.
La actividad ßGal se cuantificó a las 24 hs. de
incubación.
DISCUSIÓN
La Nitrato Reductasa A (NRA) de E. coli está
constituida por una apoproteína y un molibocofactor (MoCo)
requerido para su activación catalítica. Los genes nar
y mol participan en la biosíntesis de la apoNR y del MoCo,
respectivamente (Shanmugan et al. 1992, Stewart 1988).
En una investigación previa pudo
observarse por primera vez que una mutación dentro de la
región nar, identificada como ChlC-8 (Puig et al. 1969), fue
capaz de bloquear totalmente la Figura 2. La actividad Gal
(unidades Miller) se cuantifico a las 12 (£) y 24 hs. (///)
de incubación. El valor entre paréntesis indica el
crecimiento celular (A600) expresión de una fusión
transcripcional moa- MA25::lac (Ortega de L. 1982).
En el presente trabajo se escogió una mutación
independiente clasificada fisiológicamente como nar-MM78
(TNC+ Nit- Gas+) (Ball 1986, Ball y Ortega de L. 1985) para
investigar su capacidad de ocasionar un efecto
similar.
Se realizaron diferentes análisis para determinar
la localización y el origen de la mutación nar- MM78.
Se aplicó el método de Stewart y MacGregor (1982) para
distinguir mutaciones entre grupos de genes nar, pero los
resultados de los distintos ensayos siempre difirieron con lo
esperado, y, por lo tanto, no se pudo obtener la información deseada. El
factor de disminución de actividad especifica BV-NRA, con
respecto a la cepa parental isogénica, fue similar al
reportado MedULA, Revista de la Facultad de Medicina, Universidad
de los Andes. Vol. 4 Nº 1-4. 1995. Mérida, Venezuela
para mutaciones en el cistrón narG (Stewart and MacGregor
1982), descartando la posibilidad de una mutación en el gen
fnr, en cuyo caso dicha actividad estaría totalmente
ausente (Schroder and Darie 1993).
Los análisis genéticos por ligamiento
confirmaron la localización de la mutación dentro de la
región nar. Se trata de una mutación
espontánea, descartando la posibilidad de una inserción
nar:: Tn10. Cuando esa mutación estuvo presente en
una cepa que se le contrasdujo la fusión transcripcional
moa::lac (Lac+), los dobles mutantes obtenidos fueron
fenotípicamente Lac- Este resultado no es atribuible a la
ausencia y/o alteración estructural de la fusión, ya
que el doble mutante JM5 podía transferir el fenotipo Lac+
ligado a Gal+ y el porcentaje de cotransducción fue igual al
esperado. Por lo tanto, la mutación nar- MM78,
tal como la chlC-8 (Ortega de L., resultados
inéditos), bloquea totalmente la expresión de la
fusión transcripcional moa- MA25::lac.
La influencia de diferentes factores fisiológicos
fue valorada individualmente, cuantificando el crecimiento
celular y la biosíntesis acumulativa de ßGal. Pudo
observarse que la expresión anaeróbica de la
fusión bajo estudio fue controlada por factores que influyen
sobre la biosíntesis de la NRA (nitrato, molibdato y asida),
sólo cuando la región nar se encontraba en
estado silvestre, ya que no
fueron capaces de antagonizar el efecto negativo ejercido por la
mutación nar-MM78. Estos resultados sugieren la
participación de un circuito de control fisiológico que
regularía conjuntamente la biosíntesis de la apoNRA y
del MoCo, manteniendo un balance adecuado en la
concentración de NRA requerida por el metabolismo celular.
Los resultados confirmaron el posible papel del clorato como
factor de control que modula la regulación anaeróbica
del operón moa y en consecuencia afectaría
indirectamente la biosíntesis de la NRA y el resto de
molibdoenzimas que comparten el mismo MoCo; el papel modulador
del clorato fue reportado previamente para la fusión bajo
estudio moa-MA25::lac, en experimentos de
cinética con cultivos creciendo aeróbicamente en medio
sintético (Ortega de L. 1985).
El efecto fuertemente negativo de las mutaciones
nar-MM78 y chlC-8, descarta la participación de la segunda
Nitrato Reductasa, denominada NRZ (Barret and Rigs 1982; Blasco
et al. 1992, Bonnefoy-Orth et al.1987, Iobbi el al. 1987), como
factor de control genético sobre la expresión
transcripcional de la fusión bajo estudio, además es un
hallazgo difícil de explicar en una cepa simple mutante
nar– moa+. Productos codificados por los operones
moa y moe participan en la biosíntesis de la
molibdopterina (MPT), durante las primeras etapas en el
metabolismo del MoCo (Jhonson and Rajagopalan 1987a, 1987b,,
Wootton et al. 1991) por lo tanto, sería de esperar que las
cepas mutantes Nar- estuviesen afectadas pleiotrópicamente
en la actividad de las distintas molib-doenzimas que requieren
del MoCo, pero esto no sucede. En consecuencia, los resultados
aquí obtenidos pudieran indicar la participación de un
control autógeno positivo de moa::lac nar, este tipo
de control fue reportado previamente en estudios con cepas de
fusión traduccional moa::lac (Baker and Boxer 1991).
Por lo tanto, como hipótesis de trabajo,
puede considerarse la participación de productos Nar+ y Moa+
que actuarían, indistintamente y en fórma
sinérgica; en este último caso se alcanzarían los
niveles de expresión máxima del operón moa;
diferentes niveles de expresión fueron reportados
previamente para la fusión bajo estudio
moa-MA25::lac, en experimentos de cinética con
cultivos creciendo bajo diferentes condiciones de aeración
(aeróbicas, anaeróbicas y de transición) (Ortega
de L. 1985). Esta hipótesis considera la
participación de un circuito de control genético que
complementaría al fisiológico propuesto al inicio de la
discusión, todo ello como un mecanismo que mantiene un
balance adecuado en la concentración de NRA requerida por el
metabolismo celular, durante la respiración anaeróbica
del nitrato.
1.- La mutación no pleiotrópica nar-MM78 es de
origen espontáneo y está localizada en el cistrón
narGHJI.
2.- La presencia de la mutación nar-MM78
bloqueó la expresión de una fusión transcripcional
moa::lac, indistintamente de las condiciones de
aeración.
3.- Factores fisiológicos que controlan la
expresión transcripcional del operón narGHJI no
antagonizaron el efecto negativo de la mutación nar-MM78, en
cultivos crecidos en medio sintético, por el contrario,
controlaron la expresión de la fusión moa:lac en una
cepa isogénica nar+. Este mismo comportamiento fue observado
al ensayar los efectos individuales del clorato y
nitrito.
4.- El efecto fuertemente negativo de las mutaciones
nar-MM78 y chlC-8 en las cepas doble mutantes, permite sugerir
que productos Nar+ y Mol+, individualmente y/o en forma
sinérgica, pudieran controlan la expresión
transcripcional del operón moa en E.
coliK12.
Se le agradece al Dr. Marck Chippaux (CNRS. LCB,
Marsella, Francia) su amabilidad por las
cepas bacterianas suministradas y los comentarios sobre este
trabajo. Al Dr. John DeMoss (Universidad de Texas, Houston, USA)
por su evaluación de los resultados
experimentales. Nos complace reconocer el apoyo financiero
aportado por el Consejo de Desarrollo Científico,
Humanístico y Tecnológico de la Universidad de los
Andes (CDCHT – ULA) para realizar la presente
investigación.
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