Efecto del enriquecimiento de un suelo agrícola sobre la superviviencia y germinación de esporas de Bacillus thuringiensi

1. Resumen
2. Introducción y
   antecedentes
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión
5. Literatura
   citada
6. Anexo

RESUMEN

La bacteria formadora de esporas Gram positiva,
Bacillus thuringiensis (Bt) se usa en el control de
insectos-plaga de los ordenes Diptera, Coleoptera y
Lepidoptera, de cultivos agrícolas, granos en
almacén
y larvas de mosquitos vectores de
enfermedades
humanas en agua. Se le
supone nativa del suelo, pero se duda que sus esporas supervivan
en este sitio o incluso se reproduzcan en ese habith. El objetivo de
este trabajo fue
determinar el efecto de la concentración de dextrosa y
extracto de levadura, sobre la germinación de esporas de
Bt. La supervivencia y germinación de las esporas
se determinó or pasteurización de las muestras de
suelo y siembra en agar nutritivo.

Los resultados indican que esporas de Bt GM-1,
GM-2 supervivieron y germinaron más que las esporas de
colección HD-1. La cual fue aparentemente más
exigente nutricionalmente, puesto para germinar requirieron de
dextrosa y extracto de levadura, ello sugiere una posible
relación con su hábitat
original de aislamiento, en donde las GM nativas del suelo,
usaron materia
orgánica de ese ambiente
mientras que la HD-1 aislada de insectos necesitó
nutrientes más específicos para la
germinación de sus esporas.

Palabras clave: biopesticida, control biológico,
demanda
nutricional

Effect amendment of soil on the survival and germination
spores of Bacillus thuringiensis.

SUMMARY

The effect of amendment of sterile soil with different
concentrations of dextrose 1.0%, 3.0% and 5.0% (w/w) and 0.01%
(w/w) of yeast extract on the survival and germination of spore
of Bacillus thuringiensis GM-1, GM-2, and HD were
inoculated alone in sterile soil. The survival and germination of
spores were determined by pasteurization of the soil samples on
nutrient agar. The results showed differences between the strains
tested. The spores of strains GM-1, GM-2 and HD-1 had better
capacity of survival and germination than the spores of strain
HD-1 which shawed high nutritional demand, since the spores of
strain HD-1 requiered, to germinate of dextrose and yeast
extract. This suggest that the nutritional exigency observed may
be related with its original habitat of isolation, since the GM's
strains are native from soils were apparently capables to
utilizate the assimilable part of the organic material of the
soil. The HD-1 isolated from insects require specific nutrient
for geminating its spore.

Key words: biopesticide, biological control, demand
nutriocional.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

El biopesticidas a base de Bacillus thuringiensis
(Bt) es una alternativa para evitar el deterioro
ecológico, es una bacteria formadora de esporas, Gram
Positivo que sintetiza un cuerpo paraesporal ó cristal de
proteína (δ-endotoxina)
durante el proceso de
esporulación (García et al, 2000). La mezcla
cristal-espora es tóxica contra insectos-plaga de los
orden: Coleoptera, Diptera y Lepidoptera.
Esté cristal no causa daño en
humanos, animales ó
plantas, es
biodegradable e induce manejado con inteligencia
(rotación de variedades de Bt) un mínimo de
desarrollo de
resistencia en
insectos (Dulmage y Aizawa, 1982; Lambert y Perferoen,
1992).

Su aplicación consiste en la aspersión del
complejo espora-cristal sobre las hojas de las plantas o en la
superficie del agua, no tiene efecto residual, pero ello debe
reaplicarse en cada ciclo agrícola
(Sánchez-Yáñez y Peña-Cabriales,
2000; Luna-Olvera y Peña-Cabriales, 1993), a causa de la
incapacidad de sus esporas para supervivir y eventualmente
germinar con los estímulos fisicoquímicos del
ambiente en cuestión, incluso como célula
vegetativa antes de esporular (Medrano et al,
2000).

Por lo anterior el objetivo de esta investigación fue determinar el efecto del
enriquecimiento de dextrosa y extracto de levadura sobre la
supervivencia y germinación de esporas de B.
thuringiensis en un suelo esterilizado.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Origen, de los aislados y cepas de Bacillus
thuringiensis.

Se utilizaron tres de Bt. denominados GM-1 y
GM-2, recuperadas de suelos del
estado de
Nuevo León y otro conocido como HD-1, proveniente de un
lepidóptero insecto-plaga de almacén de granos
aislado y donado para este trabajo por el Dr. Howard T. Dulmage
del USDA, Waco, Texas, E.E.U.U.

Los aislados se conservaron en refrigeración a 10° C en agar nutritivo o agar triptosa fosfato
pH
7.0.

II. Suelo agrícola.

Se colectó un suelo agrícola a una
profundidad de 15-30 cm, del municipio de Guadalupe, N.L., el que
se sometió a análisis físico-químico: pH,
materia orgánica, textura etc. (Ortiz y Ortiz,
1980).

III. Diseño
Experimental.

Porciones de 100 g del suelo agrícola de
Guadalupe, Nuevo León, México, se
colocaron en recipientes de cartón y se esterilizaron a
121° C por dos horas. Luego el pH
del suelo se ajustó a 7.0 con HCL 0.1N. Entonces e suelo
se enriquecido con dextrosa (QB, Baker) a nivel de
concentración de 1, a 3% (p/p). Además se
adicionó el extracto de levadura (Difco) se agregó
al 0.01% (p/p) como factor de crecimiento, la humedad se ajusto a
60% con agua destilada. Se dejó el mimo suelo sin
enriquecer ni inocular Bt como control, en este caso dada
la necesidad nutricional de Bt sólo se
ajustó en el pH y la humedad indicada.

IV. Preparación del inóculo de
Bt para el suelo.

Las esporas de Bt se cosecharon de un cultivo de
72 h en caldo nutritivo (Bioxon), se suspendieron en
solución salina (NaCl 0.85%), se pasteurizaron a
80° C/10 min. Las esporas se
lavaron por centrifugación tres veces a 3000 rpm/15 min.
La suspensión de esporas se ajusto a la turbidez del tubo
No. 1 de Mac Farland y diluyó hasta 3.0X103
esporas/ml, concentración que se inóculo en el
suelo agrícola (Pruett et al.,1980).

V. Recuperación de las esporas de Bt
inoculadas en el suelo.

Se realizaron muestreos diarios del suelo
agrícola y el suelo sin Bt usado como control
absoluto. Para determinar la supervivencia y germinación
de las esporas, se tomaron 5.0 g. de cada suelo y se suspendieron
en 45 ml. de solución salina esterilizada pH
7.0.

Se pasteurizaron a 80°
C/10 min, y cuando fue necesario se realizaron diluciones para
determinar su densidad en agar
nutritivo. Se reporto el número de esporas viables/g de
suelo seco agrícola.

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

I. Análisis fisicoquímico del
suelo.

El suelo de acuerdo con el análisis, se
clasificó como franco arenoso con un 93.16% de arena, pH
8.0 alcalino y extremadamente rico en materia orgánica con
un valore de 5.2% (Ortiz y Ortiz 1980).

II. Efecto del enriquecimiento del suelo con dextrosa
y extracto de levadura sobre la supervivencia y
germinación de las esporas de Bt.

En el cuadro1 se muestra la
supervivencia de las esporas Bt GM-1, en el cual se
detectó que estas germinaron con los nutrientes del suelo,
probablemente derivados de la materia orgánica por el
proceso de esterilización al que se sometió, en
contraste con los reportes de Petras y Casida (1985), West et
al (1985) sobre la incapacidad de las esporas Bt que
por principio perdieron rápidamente su viabilidad en un
suelo agrícola no esterilizado.

Cuando el suelo se enriqueció con dextrosa en
concentración de 1 y 3% se observó una
germinación de las esporas similar a la detectada en el
suelo sin enriquecer, y que se utilizó como control
relativo, lo que sugiere que la materia orgánica del suelo
no enriquecido contiene compuestos de carbono,
probablemente ácidos
orgánicos asimilables para Bt como la dextrosa como
lo señalan, Sekijima et al (1977) y Luna y
Peña-Cabriales (1989) inferior a la germinación de
las esporas de Bt cuando se enriqueció con dextrosa
al 5%.

Como se observa en el cuadro 2 en donde las esporas de
Bt GM-1 mostraron la máxima germinación con
los nutrientes disponibles en el suelo no enriquecido, como se
reporta sobre las esporas de B. subtilis en suelo
agrícola. Estos resultados son inusuales para Bt,
que en lo general no germina en suelo, en contraste la GM-2,
respondió a la concentración de dextrosa al 3 y 5%
que estimularon la germinación de sus esporas como lo
señala Pruett et al., (1980), Aranson et
al., (1986) y Lambert y Perferoen (1992) al especificar que
entre aislados de Bt existen diferencias en el
patrón de utilización de azucares sencillos en
función
de su origen.

En el cuadro 3 se presenta que para lograr la
germinación de las esporas de HD-1 fue necesario agregar
además de dextrosa, extracto de levadura al 0.01%, ello
supone que la supervivencia de las esporas de HD-1, y su
rápida germinación en el suelo usado como control
indica que la germinación de sus esporas no depende de
carbono externo adicional externo, ello sugiere que HD-1 no
comparte con GM1 y GM2 una respuesta fisiológica similar a
la utilización de fuente de carbono simple contrario a la
respuesta GM-1 que germinaron al adicionar dextrosa sólo
al 5%, probablemente por una interacción de este azúcar
con arcillas del suelo, pues concentraciones de 1 y 3% retardaron
o inhibieron la germinación de sus esporas.

Estos resultados con las esporas de Bt sugiere
diferencias en su exigencia de carbono y factor de crecimiento,
lo cual apoya una aparentemente relación con su
hábitat original de aislamiento, pues GM-1 y GM-2 se
aislaron de suelo asimilaron nutrientes de este sitio como se
observó en aquel usado como control absoluto, en donde
nada se agregó. Mientras HD-1 aislada de insectos
mostró mayor exigencia nutricional, está observación también la reporta
Aronson et al., (1986). Lo que indica que entre los
aislados de Bt podría establecerse una
división basada en habitat de origen (suelo, agua, planta)
en sus características bioquímicas y su
relación con insectos.

Conclusión

Con base en la literatura revisada y los
datos
obtenidos en el presente trabajo se supone Bt
sufrió una evolución a partir de una estrecha
relación con los insectos, durante este proceso se dieron
cambios genéticos que repercutieron en su comportamiento
bioquímico que la independizaron de los insectos hasta
convertirse en lo que es hoy, los resultados aquí
obtenidos sostiene esta hipótesis.

Agradecimientos:

A la Dirección de Investigación Científica de la
Universidad
Autónoma de Nuevo León por el apoyo para la
realización de esta investigación. A la CIC de la
UMSNH por el proyecto 2.7
(2005-2006), por las facilidades para su publicación. A
Beatriz Noriega por su trabajo de escritura.

LITERATURA CITADA

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17:657-665.

ANEXO

Cuadro 1. Efecto de la adición de diversos
niveles de dextrosa sobre la germinación de esporas de de
Bacillus thuringiensis GM-1 en suelo agrícola
esterilizado.

Todas los valores
son el promedio de 4 repeticiones, valores con
letras iguales sin diferencia estadística significativa.

Cuadro 2. Efecto de la adición de dextrosa
sobre la germinación de Bacillus. thuringiensis
GM-2 en suelo agrícola esterilizado.

Todos los valores son el promedio de 4 repeticiones.
Valores con letras iguales sin diferencia estadística
significativa.

Cuadro 3. Efecto de la adición de dextrosa al
5% de amonio al 3% y sobre la germinación de esporas de
Bacillus. thuringiensis HD-1 en suelo agrícola
esterilizado y extracto de levadura (0.1%).

Todas los valores el promedio de 4 repeticiones. Valores
con letras iguales sin diferencia estadística
significativa.

1Delmas-Mata, J T

J M
Sánchez-Yáñez2*

1Lab. de Microbiología Industrial y del Suelo. Fac,
Ciencias
Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo
León, Apdo. Postal 414. San Nicolás de los Garza,
Nuevo León México. 2Microbiología
Ambiental. *autor correspondiente

Instituto de Investigaciones
Químico Biológicas. Universidad Michoacana San
Nicolás de Hidalgo,

Ed. B1, C.U. cp. 58030, Morelia, Michoacán,
México