Teocintle (Zea mays sp mexicana) una maleza fuente de bacterias benéficas de raíces para maíz (Zea mays)

1. Resumen
2. Introducción y
   antecedentes
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión

RESUMEN

El teocintle es una gramínea silvestre, para
algunos una maleza, reconocida como el ancestro del maíz.
En general abundante información existe al respecto, pero no
así sobre el tipo bacterias benéficas de
raíces (BBR). El objetivo de
este trabajo fue
aislar e identificar las BBR dominantes de la rizósfera de
teocintle ( Zea mays sp mexicana L), potencialmente
benéficas para el maíz.

Para ello se colectaron, raíces y semillas de
teocintle y suelo de la
región en donde crece silvestre, en el norte del municipio
de Morelia, Mich. Las raíces se usaron como fuente de
aislamiento de las BBR, por siembra en agar Watanabe (medio
mineral sin nitrógeno combinado), PCAT (agar selectivo
para Burkholderia spp). La capacidad para fijar
N2 de las BBR teocintle, se demostró por la
técnica de reducción de acetileno y se
realizó su identificación bioquímica
parcial.

Los resultados indican que las BBR asociada a las
raíces de teocintle, son predominantemente del tipo Gram
negativo entérico, en orden descendente
Burkholderia spp, y Azotobacter spp, parcialmente
concluye que en sus raíces existe un grupo de BBR
similares a la reportada en maíz, con potencial para
emplearse como inoculante y disminuir el uso de fertilizante
nitrogenado en su producción.

Palabras clave: Teocintle, raíces,
enterobacterias, Burkholderia.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

El teocintle (Zea mays sp mexicana L) es
una gramínea distribuida en América
conocida por su relación con el maíz (Zea
mays sp L). Teocintle, significa grano de Dios (13,16), con
este nombre se le registró cuando se le introdujo en
Europa, en
México se
le denomina con otros nombres que lo asocian a las aves que se
alimentan de sus semillas o por su semejanza con el maíz
(31 ,32).

En general, una gama de argumentos concluyen que el
maíz se originó del teocintle (5,), cambios en su
composición genética
(4,20) señalan sus características
anatómicas y fisiológicas distintas al del
maíz común: la forma de las mazorcas, la dureza del
grano, topografía y morfología
de las semillas, así como la flexibilidad del teocintle
para adaptarse a las condiciones adversas del ambiente:
desecación, pobreza de
nitrógeno combinado a otros nutrientes esenciales: P, Fe,
etc, a la alcalinidad del suelo (20), al ataque de
patógenos de raíces y aéreos (31) y porque a
diferencia del maíz, el teocintle no es protegido por
el hombre por
el contrario se le combate con herbicidas (27,33).

El teocintIe utiliza como defensa natural (4,5), una
producción elevada de semillas liberada a la madurez (32),
en el maíz, las hojas de las mazorcas lo evitan, por ello
depende para su reproducción del hombre
(23,27).

Parte de la adaptabilidad del teocintle a diferentes
ambientes se atribuye a la asociación de sus raíces
y tejidos con
microorganismos, los cuales al usar productos del
metabolismo de
la planta, los transforman en promotores del crecimiento
vegetal (SPCV). Además una característica de
esas bacterias, es su capacidad de competencia para
sobrevivir a las condiciones adversas del ambiente y establecer
interacciones positivas con las raíces de vegetales y
estimular su desarrollo
(14,25). Como las BBR (7), que producen SPCV

(10,12), o por solubilización de minerales de
fósforo y el hierro (25).
Se sabe que teocintle y maíz están
genéticamente relacionados, por ello se cree que comparten
el mismo tipo de BBR (33), como lo reportan Calderón et
al. (9) y Sánchez-Yáñez et al.
(33) lo que ya se conoce en otras gramíneas
domésticas.

Las BBR dominantes en la rizósfera del
maíz (Zea mays sp L) son: Azospirillum spp
una bacteria Gram negativas (-) en forma de coma, de uso
comercial como inoculante para el crecimiento del maíz,
con excelentes resultados en ciertos suelos y climas y
negativos en otros, de venta en el mundo
incluso en México (29). Aunque esta BBR en condiciones de
anegación del suelo, provoca pérdida de N por
desnitrificación.

Otra BBR es Herbaspirillum, recién
descubierta en maíz y en evaluación
para proponer su uso como inoculante en otras gramíneas
bajo un esquema de producción sin
hiperfertilización nitrogenada (3).

Otro ejemplo de BBR en maíz es Azotobacter
chroccoccum un bacilo Gram (-), formador de quistes, que
inoculado en: trigo y avena desde principios de
siglo XX en Rusia y
Estados
Unidos, ha dado resultados parcialmente consistentes al
reducir la dosis de fertilización y mantenimiento
de rendimiento (22), así como Rahnella aqualilis
una bacteria entérica, pero que por su asociación
con bacterias enteropatógenas para humanos, tiene problemas para
su aplicación en la agricultura
(7).

Finalmente Klebsiella lerrigena otra
entérica encontrada en raíces del maíz y que
promueven el crecimiento del maíz pero por su
patogenicidad potencial para humanos su futuro como inoculante es
incierto (6).

En general los reportes sobre la BBR asociadas al
teocintle son escasos al respecto Calderón et al.
(1999), Sánchez-Yánez et al. (1998),
reportaron un grupo de BBR similares a las conocidas en el
maíz, lo que se corroboró por García et
al. (1995, 2001), que encontraron BBR en la rizósfera
del teocintle y también endófitas.

Por lo anterior los objetivos de
este trabajo fueron: 1) Aislar e identificar BBR de teocintle,
potencialmente benéficas para maíz.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. ORIGEN DE LAS PLANTAS.

El teocintle en madurez y senectud, al igual que las
semillas y suelo se colectaron del Rancho "Los Ramírez"
al norte del Municipio de Morelia, Mich., México (31,32),
además se sembraron semillas en macetas en el suelo
original de colecta, esas macetas se mantuvieron en invernadero
en el Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas, Universidad
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich. para
su posterior análisis, las raíces de plantas en
madurez y senectud se transportaron en bolsa de plástico,
para su estudio en el laboratorio
(22).

2. AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS DE TEOCINTLE

Las raíces de teocintle se lavaron con agua
corriente, se desinfectaran con etanol al 90% por 15 minutos y se
lavaron tres veces con agua destilada estéril, se
trituraron en un mortero en condiciones asépticas y se
diluyeron desde 10-1 hasta 10-6 en tubos de
18 x 150 mm con 9.0 mL de solución salina estéril
(NaCl 0.85% p/v), de cada dilución se tomaron 0.2 mL para
sembrar en el medio mineral sin carbono ni
nitrógeno, llamado Watanabe (W), el cual consiste en
cuatro soluciones:
Solución A g/L: ZnS04 .
7H2O, 0.43, MnS04 .
H20. 1.30; NaMo04.
2H2O 0.75; H3B03, 2.8;
CuS04 . 5H2O, 0.026;
CoS04.7H2O,
0.07.

Solución B g/L: MgS04
. 7H2O,2.00; CaCI2
. 2H2O,2.00; FeS04
. 7H20, 0.44; EDTA, 0.40;
solución A, 20mL. Solución C g/L: K2HPO4
60; KH2PO 4,40. medio final:
Solución B, 50mL; Solución C, 15mL; en 1000 mL de
agua destilada, pH de 6.8 a
7.0. Solución D (g/L): manitol l0, almidón 10,
sacarosa 5, ácido málico 5, los azúcares y
el ácido se agregan, esterilizados por filtración
con membrana Millipore de 0.2 micras (Gelman, Co. ) al medio base
después de esterilizar. Para mantener la mezcla
semisólida se agregó 0.5% de agar-agar y para
solidez total 18g/L (35).

3. REDUCCIÓN DE ACETILENO DE LAS BACTERIAS DE
TEOCINTLE

Las bacterias sospechosas de fijar N2
(característica frecuente en las BBR) se conservaron en
agar W y para su pureza se resembraron en AN y se mantuvieron en
glicerol al 10% y -5 °C (22). Esas BBR se sembraron en tubos
de 18 x 15O mm con 3.0mL de caldo W y se ajustaron a l x
l0-3 bacterias/mL con el tubo No. 1 de Mac Farland,
los tubos se sellaron con tapones de hule y se incubaron á
35°C por 48 h., después se usó una jeringa
Hamilton de 5.0 mL para extraer de cada tubo el 10% de la fase
gaseosa y sustituir por una inyección del mismo volumen de
acetileno etileno producido en cada tubo, se determinó por
cromatografía de gases (Beckman
modelo
GC-72-5) empacado con una columna Porapack Q.

4. IDENTIFICACIÓN DE LAS BBR DE
TEOCINTLE

Se realizó una identificación parcial de
las BBR dominantes de teocintle. Así las bacterias que
fijaron N2 en PCAT y en agar W, inclusive sus
características morfológicas microscópicas
como: la forma, arreglo celular, movilidad, reacción al
Gram.

La producción de oxidasa, catalasa y otras
pruebas
bioquímicas para identificar Burkholderia spp
(6,35,36).

El segundo grupo clasificado que fija N2,
solo creció en agar W pero no en PCAT se sometió a
las pruebas bioquímicas como: (23,24) crecimiento en
anaerobiosis, ácido de: glucosa,
lactosa, sacarosa, manitol y almidón, utilización
de citratos como única fuente de carbono y energía,
producción de H2S a partir de cistina y lisina,
formación de indol de triptofano y la síntesis
de pigmento intra o extracelular (8,9,33) y las indicadas
previamente para Burkholderia (36). –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la tabla 1 se muestra la
actividad de reducción de acetileno (ARA) medida por la
producción de etileno, la ARA para Burkholderia
vietnamiensis TVV7S cepa de referencia usada como control positivo
(aislada de arroz), fue de 196 nnmol de etileno/día/tubo,
mientras que cero para Bacillus cereus G4 (cepa de
referencia de Paspallum sp) no fijadora de
N2. "'.:'

Mientras que los aislados de teocintle mostraron una
tendencia de ARA relati vamente alta, lo que no significa que
sean mejores fijadores de N2 que B.
vietnamiensis TVV7S, ya que condiciones específicas
nutricionales para cada género
bacteriano son específicas, las que frecuentemente no
favorecen la ARA de cualquier bacteria (6,23), por tanto la ARA
es principalmente variable cualitativa, (10,21,24),
¿cuánto y bajo qué condiciones?
Burkholderia de teocintle fijan N2, es tema de
investigación de otro tipo
(8,9).

En oposición a lo esperado en las raíces
de maíces franceses y australianos el tipo de
Burkholderia no fijan N2 (36), ello sugiere una
especificidad bacteria-raíces de teocintle
(1,6).

En la tabla 2, se muestran las características
bioquímicas de las BBR dominantes del teocintle que
crecieron en PCAT y se identificaron presuntivamente como
Burkholderia spp, independientemente del estado
fisiológico del teocintle; a nivel de plántula,
floración, madurez y senectud lo que indica que estos
bacterias colonizan y dominan sus raíces hasta su muerte (17)
como se reporta en otras gramíneas (27).

Así observó que Burkholderia spp,
es parte de la rizósfera del teocintle desde la
germinación de la semilla (17,25) hasta el final de su
ciclo. Esto apoya la investigación exploratoria en
progreso (8,9), la que se muestra que la permanencia de
Burkholderia en sus tejidos y en la parte externa de la
raíz, en donde la selección
de bacterias es regulada por los exudados radicales
(15,36).

Por ello el aislado clave STL, es un representante del
grupo dominante, que se sabe que es de los más
competitivos (19,30). Pruebas de inoculación de
invernaderos y campo demuestran que efectivamente influyen
positivamente en el crecimiento y rendimiento de maíz a
dosis reducida de urea (30).

Tabla 3 y 4. Se presentan las características
bioquímicas de bacterias dominantes de las raíces y
suelo alejado de las raíces del teocintle. En ambos casos
se detectó Azotobacter sp conocido por su capacidad
de asociación y fijación biológica
N2 en la rizósfera de gramíneas (22). En
donde las características bioquímicas basadas para
su identificación fueron: la producción de quiste
en n-butanol como fuente de carbono, su movilidad, la
producción de oxidasa, de un pigmento fluorescente verde y
la utilización de azúcares (ramnosa,
almidón, glucosa, etc.), así como otras pruebas
bioquímicas adicionales que apoyan que el comportamiento
bioquímica corresponde a este tipo de BBR , en progreso se
realiza la identificación de estas BBR definitiva con
bases genéticas se trata de un Azotobacter
(33).

CONCLUSIÓN

En las raíces de teocintle, existen diversos
tipos de BBR en el orden que sigue: bacterias entéricas
Gram negativas, Burkholderia spp y Azotobacter
spp, así como otras bacterias no identificadas,
potencialmente benéficas para el maíz.
Investigación en progreso lo anterior y posteriormente,
los resultados se presentaron.

Tabla 1. Actividad relativa de la reducción de
acetileno por Burkholderia spp de raíces de
teocintle (Zea mays sp mexicana L), en Morelia,
Mich .

aNúmero de repeticiones. +cepa de
referencia no fijadora de N2. bPromedio de
la actividad máxima de producción en nmol de
C2H4/día/tubo.*(cepa de referencia
donada por el Dr. Tran Van Van). STL Burkholderia sp
aislada de teocintle rancho "Los Ramírez", Morelia, Mich.,
México.

Tabla 2. Características bioquímicas de
Burkholderia spp dominante de raíces de teocintle
(Zea mays sp mexicana L), en Morelia,
Mich.

*Cepa de referencia donada por el Dr. TranVan Van.
Reacción (+) positiva, (-) negativa, TSI = Agar triple
azúcar
hierro, LIA = Agar Hierro Lisina, SIM = H2S lndol
Movilidad, STL= aislado de teocintle.

Tabla 3. Comportamiento bioquímico de
Azotobacter spp de las raíces de teocintle (Zea
mays sp mexicana L) en Morelia, Mich.

Reacción (+) positiva, (-) negativa; * Cepa de
referencia donada por el Dr. G .R. Vela, UNT, USA Denton, Tx;
STL= aislado de teocintle.

Tabla 4. Comportamiento bioquímico de las
bacterias benéficas entéricas fijadoras de
nitrógeno del suelo alejado de las raíces de
teocintle (Zea mays sp mexicana L) en el municipio
de Morelia, Mich.

Reacción (+) positiva, (-) negativa, TSI= Agar
triple azúcar hierro, LIA = Agar Hierro Lisina, SIM=
H2S Indol Movilidad, T= aislado de teocintle, b o c =
aislados de suelo sin raíces de diferentes plantas;
°Cepa de referencia.

AGRADECIMIENTOS.

A la Agencia Internacional de Energía
Atómica que por medio del contrato num.
311-D 1-Mex-7944, financió parcialmente este
trabajo

A la Coordinación de Investigación Científica de la UMSNH
por el proyecto 2.7
(2005-2006) estudio de la Microbiota Fijadora de Nitrógeno
asociada a teocintle y maíz, por su apoyo para la
realización de ciertas fases experimentales y su
publicación

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Juan Manuel
Sánchez-Yáñez

Microbiología Ambiental, Instituto de
Investigación Químico-Biológicas, Univ.
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Edif. B-3
*

Cd. Universitaria, Morelia, 58030,Michoacán,
México.