Detección y distribución de la población bacteriana activadora de núcleos de hielo en cítricos

1. Resumen
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión
5. Conclusión
6. Literatura
   citada

RESUMEN

Las heladas afectan la producción agrícola nacional que
ocasiona pérdidas económicas. Se le consideraba un
problema de origen climatológico; investigación de los últimos 20
años determinó que existen agentes
biológicos en la superficie de las hojas de plantas que las
sensibilizan a la baja temperatura y
que les causan daño
por congelamiento, dado el impacto económico de las
heladas en la zona cítrica del estado de Nuevo
León.

El objetivo de
ésta investigación fue determinar la densidad de la
población bacteriana activadora de núcleo de hielo
(BANH) en hojas sanas de cítricos, así como su
identificación bioquímica. Para ello se colectaron hojas
sanas de cítricos de los municipios de Monterrey: El
Cercado, Villa de Santiago y Gral. Terán, N.L. A las
bacterias
aisladas de las hojas se les realizó la prueba
activación de núcleos de hielo (ANH), de las cuales
el 84% fueron positivas, en un tiempo
promedio de 20 – 30 minutos.

Las poblaciones fluctuaron desde 5.0X102
hasta 6.1X106UFC/g de hoja fresca. Con respecto a su
identificación bioquímica se detectaron
géneros bacterianos diferentes a los reportados como BANH:
Citrobacter sp., Alcaligenes sp y Xanthomonas sp. Se
concluye que existen poblaciones de BANH, epifitas en las hojas
de cítricos de N.L. Además de que la densidad de
las BANH está influenciada por la localización
geográfica de los huertos, el clima y el estado
fisiológico de los árboles
de los cuales se colectaron las hojas. Por ello es posible
suponer que estuvieron involucradas en las heladas de la zona de
1993 y 1994.

Palabras claves: Biocongelamiento, filoplano,
heladas tempranas.

DETECTION AND DISTRIBUTION OF TO NUCLEATION ACTIVE
BACTERIA ON CITRIC OF NUEVO LEÓN,
MÉXICO.

ABSTRACT

Freeze season cause damage and economical on the
national agriculture production. Freeazing was regard as
climatological problem research during las 20 years, found out
that biological agents are involved on the pylosphere of leaf of
plants. Those bacteria sensiblizing vegetables to freeze. Since
in Nuevo Leon State caused negative impact in citric production
are the aim of this reaserch were to determine the density of ice
nucleation active bacteria (BANH) on healthy citric leaves as
well as its identification biochemical there for were collected
healthy leaves from counties: Monterrey, El cercados Villa de
Santiago and Gral Teran N. L. Bacteria isolated from healthy
leaves fuere testing for ice nucleation activity 83% fuere
positive in around 20-30 min Variation of INA population
indicated 5.0 X102 – to 1X106 CUF/g fresh
leaf. Biochemical identification showed different bacterial genus
Citrobacter sp, Alcaligenes sp as those reported m
literature it conclude that INA bacteria dependent on
climatologically regain as well as geogrical.

Therefor is believed that this type of bacteria were in
volved in freeze problem in this are between 1993 and
1994.

Key word
biological zea freeze phylloplane, early freesze.

INTRODUCCIÓN

Las pérdidas en los árboles de la zona
cítricola del estado de Nuevo León, México;
fue grave en los años (1993-1994), por la incidencia de
heladas tempranas y tardías, pues los inviernos en
ésta región son variables,
además del fruto otras partes del árbol sufren
daño: follaje, yemas, brotes florales e incluso la
madera en
función
de la intensidad y duración de la helada. En
consideración a reportes publicados por diferentes
investigadores relacionados con el efecto de las bajas
temperaturas en cultivos regionales, se sabe que existe un factor
biológico que acentúa el daño por heladas
(Beattie y Lindow 1994; Donegan et al., 1991, );
éste factor se refiere a la sensibilización de las
hojas cultivos agrícolas por BANH/saprofitas y que se
reproducen en ciertas épocas del año como la
temporada de lluvia y al inicio de la estación de
invierno, el pronostico de heladas temprana y tardía
depende de la densidad de la población de BANH (Gross
et al., 1984; Hirano et al., 1996: Lopez et
al., 2005). Los objetivos de
este trabajo
fueron: i) Determinar la densidad de bacterias activadoras de
núcleo de hielo de esos cítricos y ii) Identificar
bioquímicamente los principales grupos
bacterianos con esta capacidad en las hojas de cítricos de
esa región.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Origen de las muestras

Se colectaron hojas sanas de cítricos colectadas
en las localidades de Monterrey, El Cercado, Villa de Santiago y
General Terán, municipios del sur del estado de Nuevo
León, Mèxico en los meses de Marzo, Abril y Mayo de
1994 y 1995. Las hojas se almacenaron en bolsas de plástico
en refrigeración (5°C) hasta su
procesamiento (Lindow, 1983).

3.2 Detección y enumeración de la
población BANH.

Se colocaron 2.5 g de hojas sanas y frescas en 47.5 ml
de amortiguador de fosfato 2.0 M pH 7.0
esterilizado y que se dejaron en agitación rotatoria a 250
rpm durante 1-2h, la suspensión se diluyó hasta
10-4 y se inocularon 0.2 ml por cuadruplicado en agar
D-3 y en D-4, ambos se incubaron a
28+°C/48h (Lindow et al., 1982),
para determinar la densidad BANH y se seleccionaron colonias
características de Pseudomonas syringae por
el pigmento verde extracelular y de Erwinia herbicola por
el pigmento naranja intracelular. A los aislados se les asignaron
las claves: S-5, Q-5, S-567, X-5M, X-10A, X-9A, X-3, X-a, C-13N,
C-8, X-7, C-4c1, T-13VL, C-4B, R-2b; para su posterior
identificación se resembraron en tubos de 18×150 con agar
nutritivo-glicerol y guardaron en refrigeración para su
preservación (15°C).

3.3 Medios de
cultivo para el aislamiento de BANH.

a) Agar D-4 para Pseudomonas
syringae.

Agar D-4 (g/L): peptona de gelatina 6.0; extracto de
levadura 3.0; extracto de carne de res 1.5; agar-agar 15.0; pH
7.2, 30 mg de SDS (Dodecil sulfato de Sodio) y 1000 ml de
agua destilada
(Wilson y Lindow, 1993).

b) Agar D-3 para Erwinia herbicola.

Agar D-3(g/L); NaCl 5.0;
(MgSO4.H2O) 0.3; NH4Cl 5.0; azul
de bromotimol 0.06 fuschina ácida 0.1; sacarosa 20.0
agar-agar 20.0. 1000 ml de agua destilada.

3.4 Prueba para determinar la actividad de
formación de núcleos de hielo (ANH).

Los aislados de Pseudomona y Erwinia se activaron
en agar nutritivo por 48h/30°C, posteriormente se tomo una
asada de éstos y se suspendió en tubos de 13X100
con 5 ml de solución salina sobresaturada esterilizada
(usada como control negativo)
y otro tubo sólo con agua destilada (usada como control
positivo) se colocaron en un recipiente, que se mantuvo en
congelador a temperatura de -7 y -8°C. Se registro el
tiempo hasta que el tubo control negativo congeló, los
tubos con aislados bacterianos que no se congelaron durante
éste período, se consideraron negativos para la
formación de núcleos de hielo (Hirano et
al., 1996).

3.5 Descripción morfológica colonial,
microscópica y bioquímica de las
BANH.

Los aislados BANH se identificaron en base al esquema
del manual de Bergey
(2000) y Lindow, 1982; Wilson y Lindow, 1993).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Densidad de la población bacteriana
activadora de núcleo de hielo (BANH).

El cuadro 1 muestra la
densidad de la población BANH detectadas en la
filósfera de hojas sanas de cítricos, colectadas en
los municipios de Monterrey, El Cercado, Villa de Santiago y
Gral. Terán, N.L. al noreste de la republica mexicana o
México; la que fluctuó desde 5.0X102
hasta 6.1X106 UFC/g de hoja fresca, como lo reportan
Hirano et al., (1996).

4.2. Prueba para determinar la actividad de
formación de núcleos de hielo en las bacterias
recuperadas.

En ésta prueba se observó que un alto
porcentaje de las bacterias aisladas (84%) fueron positivas a la
actividad de formación de núcleos de hielo, en un
tiempo promedio de 20 a 30 minutos. El mayor porcentaje de
aislados positivos a la prueba, se recuperaron en el Agar D-4,
como se reporta en cultivos agrícolas similares en los
Estados Unidos
(Hirano et al., 1996; Lindow, 1983), como se presenta en
el cuadro 1.

Cuadro 1. Población de las bacterias
activadoras de núcleos de hielo (BANH) en las hojas de
cítricos del estado de Nuevo León.
México.

ND: No determinada; V de Stgo. = Villa de Santiago, (-):
Sin crecimiento. Todos los valores
son el promedio de 4 repeticiones.

En particular en las hojas de los cítricos de los
huertos de General Terán, se detectó una densidad
de población de BANH desde 4.4X104 hasta
6.1X106 UFC/g de hoja fresca; en hojas de los
cítricos del Cercado y Villa de Santiago desde
5.0X102 hasta 3.5X104 UFC/g de hoja fresca
y la menor densidad poblacional se detectó en las hojas de
la vegetación de los huertos del municipio de
Monterrey, la que fluctuó desde 5.0X102 hasta
7.0X103 UFC/g de hoja fresca.

Estos resultados sobre la densidad de la
población BANH indican su variabilidad en la zona
cítricola del estado de Nuevo León, al noreste de
la republica mexicana o México, probablemente porque las
hojas analizadas se colectaron en cuatro áreas
geográficas distintas. Lo anterior concuerda con lo
reportado por Lindow (1982) y Gross et al., (1984), y
Lopez et al (2005) al investigar BANH en hojas de plantas
de distribución geográfica contrastante.

En general la densidad de las BANH epifitas en plantas,
se reporta evidentemente influenciada por la condición
ambiental que prevalece en el hábitat, al que parece la vegetación
esta específicamente adaptada (Donegan et al.,
1991; Hirano et al., 1985).

4.3 Identificación de las BANH.

En el cuadro 2 se presenta la división de los
aislados en cuatro grupos morfológicos coloniales:
amarillas, naranjas, blancas y verdes (verde translúcido y
limón). Las características microscópicas de
los aislados fueron: bacilos cortos y rectos Gram Negativos, con
excepción de un aislado que dio Positivo a la
reacción al Gram, forma cocos arreglados en
tétradas.

Estas características morfológicas
microscópicas y coloniales corresponden a BANH de las
reportadas en la literatura (Blakeman, 1993;
Buchanan y Gibson, 2000). Las colonias sospechosas de BANH fueron
positivas en un 84% para la prueba de formación de
núcleos de hielo, aunque ello también fue variable,
lo que indica que existen diferentes ecotipos de géneros y
especies bacterianas implicadas (Hirano et al., 1985), ya
que cada área geográfica es distinta, al igual que
las variedad de cítricos (Andersen et al., 1991;
Blakeman, 1993: Lopez et al ., 2005).

Se observó que la selectividad de los medio de
cultivo empleados no fue una limitante para la detección
de otros géneros y especies de BANH (Lindow et al.,
1982; Wilson y Lindow 1992), tales como: Citrobacter sp. y
Alcaligenes sp, en Agar D-3 y Xanthomonas sp, en D-4,
además de cuatro aislados que no se identificaron como se
reporta en otros cultivos vegetales (Stromberg, et al.,
1999). En está investigación se esperaba encontrar
sólo BANH ampliamente conocidas: P. syringae y E.
herbicola, según los numerosos reportes son las
principales responsables de la sensibilización de hojas de
plantas a heladas tempranas y tardías (Hirano et
al., 1996; Wilson et al., 1999). Puesto que son
epifitas comunes de hojas de plantas incluso en ornamentales
(Hirano et al., 1996; Londow, 1983) y de valor
comercial (Beattie y Lindow, 1994; Buchanan y Gibson, 2000). La
detección de BANH diferentes a las reportadas se explica
en base a la temperatura del ambiente, el
clima de la región (Blakeman, 1993; Lopez et al.,
2005), por su capacidad de supervivencia (Donegan et al.,
1991) así como por su compleja interacción con las hojas de sus plantas
hospederas (Hirano et al., 1985; Wilson et al.,
1999).

Aunque la actividad de nuclear hielo de origen
biológico se conoce en los Estados Unidos desde 1974 en
daño a cultivos agrícolas (Lindow, 1982; Lindow
et al., 1982), los resultados de ésta
investigación representan uno de los pocos reportes sobre
la distribución y densidad de BANH en la zona
citrícola del noroeste de México y su posible
correlación con el daño por heladas en cultivos
citrícolas.

En el cuadro 3, se presentan las características
de BANH aisladas en D-4, de los cuales tres liberaron un pigmento
extracelular fluorescente verde; el aislado Q-5, fue oxidasa
positiva, móvil, redujo nitratos, fue catalasa positiva,
utilizó el citrato como fuente de carbono y
fermentó la glucosa con
formación de ácido. El aislado S-567 fue oxidasa
positiva, formó levano, hidrolizó la gelatina,
produjo ácido sulfhídrico, fue catalasa positiva,
utilizó el citrato como fuente de carbono y redujo
nitratos. Se recuperó un aislado que mostró
respuesta bioquímica semejante al aislado S-567 (con
excepción de la oxidasa débil) sólo que su
morfología
colonial fue diferente, lo que sugiere se trata de bacterias
relacionadas y reportadas con BANH (Buchanan y Gibson, 1994;
Gross et al., 1984).

Cuadro 2. Características
morfológicas microscópicas y coloniales de las
bacterias activadoras de núcleos de hielo (BANH) en la
filósfera de hojas de cítricos del estado de Nuevo
León.

NI: No identificada.

Cuadro 3. Características
bioquímicas de las BANH de hojas de cítricos del
estado de Nuevo León, México, relacionadas con
Pseudomonas syringae.

Simbología:(+) = Positiva, (-) = Negativa,
(+a) = positiva débil, a todos los
resultados son promedio de 4 replicas. x Cepa de
referencia.

En el cuadro 4 se muestran las BANH detectadas en el
Agar D-3; mostraron características semejantes al género
Erwinia herbicola (Beattie y Lindow, 1994), éstos
fueron los aislados designado como: X-10A, X-9A, X-3 y X-8A
negativas a la prueba de oxidasa; cuatro formaron levano y
pigmento amarillo a 30°C; crecieron en anaerobiosis,
utilizaron el malonato como fuente de carbono, algunas
hidrolizaron la gelatina, pero no la caseína, ni el
almidón, fueron variables en la reducción de
nitratos, así como a la reacción de MR-VP, a la
utilización de citratos, ninguna creció en KCN y la
mayoría fermentó glucosa, lo que representa un
grupo
diferente al conocido de BANH del tipo P. syringae (Hirano et
al., 1985; Lopez et al., 2005).

Cuadro 4. Características
bioquímicas de ecotipo de Erwinia herbicola de BANH
aisladas de hojas de cítricos del estado de Nuevo
León, México.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, (+/-)
= Ligeramente positivo, a todos los valores son el
promedio de 4 repeticiones, x Cepa de
referencia.

En cuadro 5 se muestran las características
bioquímicas de los aislados C-13N, C-8 y X-7 de los cuales
C-13N y X-7, mostraron respuesta bioquímica semejante: no
crecieron en anaerobiosis, no redujeron nitratos, utilizaron el
citrato y el malonato como fuente de carbono, fueron oxidasa
negativa y no formaron acetimetilcarbinol (VP); el aislado C-8 no
liberó levano, fue positivo al indol, creció en
anaerobiosis y fermentó la glucosa en TSI (Beattie y
Lindow, 1994; Buchanan y Gibson, 1994, Lopez et al., 2005)
lo que indica que ninguno pertenece a E
herbicola.

Cuadro 5 Características
bioquímicas de las BANH diferentes de P. syringae y E
herbicola de hojas de la zona citrícola del estado de
Nuevo León, México.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, ND =
No determinada, a todos los valores son el promedio de
4 repeticiones.

El cuadro 5 muestra otros aislados de BANH recuperados
en D-3 fueron: C-4cl, fue móvil C-4B y R-2b diferentes a
P. syringae y E. herbicola. El aislado C-4cl formó
levano, hidrolizó la gelatina, catalasa y citrato positivo
y el resto de las pruebas
bioquímicas negativas. El aislado C-4B fue móvil
formó pigmento amarillo a 30 °C, creció en
anaerobiosis, redujo los nitratos, fue catalasa positiva y
utilizó el malonato, el resto fueron negativas. El aislado
R-2b fue semejante en algunas respuestas al aislado C-4B, como en
la formación de pigmento a 30°C, el crecimiento en
anaerobiosis y la reducción de nitratos, pero diferente en
la prueba MR donde fue positiva y la VP negativa, fermentó
los azúcares en el TSI, las restantes pruebas fueron
negativas.

Cuadro 6. Características
bioquímicas de las BANH diferentes de Peudomonas
syringae y Erwinia herbicola y no identificadas
aisladas de hojas de cítricos del estado de Nuevo
León.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, (+/-)
= Ligeramente positivo, ND = No determinada, a todos
los valores son el promedio de 4 repeticiones.

El aislado T-13VL, en D-4, tuvieron una
morfología microscópica de cocos arreglados
tétradas Gram Positivos y con las siguientes
características bioquímicas: catalasa positiva,
oxidasa negativa, el malonato ligeramente positivo y
fermentó los tres azúcares del TSI, no
creció en anaerobiosis no redujo nitratos, no
utilizó los citratos, inmóvil, ni produjo levano
esto apoya que este patrón no corresponde a E.
syringae ni E. herbicola y sugiere que la
población de BANH es mas diversa de lo que se
reporta.

CONCLUSIÓN

La densidad de las poblaciones BANH fue aparentemente
influenciada por la localización geográfica de los
huertos, las condiciones ambientales y el período de
crecimiento de los árboles. Se detecto una densidad
variable de las bacterias activadoras de núcleo de hielo
epifitas en la superficie de las hojas de cítricos del
estado de Nuevo León. Se identificaron P. syringae y E.
herbicola y otros géneros bacterianos no reportados
comúnmente con capacidad activadora de formación de
núcleos de hielo tales como: Citrobacter sp.,
Alcaligenes sp. y Xanthomonas sp, lo que
sugiere que probablemente en las heladas tempranas y
tardías se involucra un grupo más complejo que lo
reportado.

AGRADECIMIENTOS

A la dirección general de Investigación Científica y Tecnología de la SEP
a través de la FCB-UANL, por el apoyo económico. A
la CIC UMSNH, proyecto 2.7
(2005-2006) por las facilidades para su publicación. A
Yasmín Lilian García Espinosa por su paciencia en
su escritura.

LITERATURA
CITADA

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* A.M Banda.,

** S.L.N González.,

+S Fernandez P

*** J.M Sánchez-Yánez.*

+Microbiología Industrial y Suelo.,

** Fitopatología., Facultad de Ciencias
Biológicas. Universidad
Autónoma de Nuevo León, Apdo. Postal 414, San
Nicolás de los Garzas N.L, Mèxico.

+Fitopatologia Instituto de Investigaciones
Agropecuarias y Forestales.

*** Microbiología ambiental,

*+autor correspondiente,

Ed. B-1. Instituto de Investigaciones Químico
Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás
de Hidalgo, Morelia, Mich. cp 58030. México.