Nuevos enfoques en el estudio de la interacción rhizobium-leguminosa. El papel de la trehalosa
- Resumen
- Trehalosa en la
naturaleza - Trehalosa en
Microorganismos - Trehalosa en las
plantas - Trehalosa en sistemas
simbióticos - Mecanismo de acción de la
trehalosa - La trehalosa en la tolerancia
al estrés hídrico en las
plantas - Bibliografía
La relación de Rhizobium y las leguminosas
normalmente se establece en función
del nivel de nitrógeno disponible en suelo el cual
dispara una serie de genes complementarios en ambos asociados
para la fijación del nitrógeno molecular que
satisface la demanda de
este elemento en la planta, sin embargo investigación señala que esta
interacción no solo es dependiente del nivel de
nitrógeno disponible, también que la humedad en el
suelo o ambiente
disponible para la planta regula la producción de un amortiguador
bioquímico que evita la muerte
celular por desecación la trealosa acumulada en los
nódulos y que previene en otros forma de vida la lisis por
falta de agua.
El objetivo de
esta revisión es mostrar un nuevo enfoque de la
interacción Rhizobium y las leguminosas para
entender que la nódulación es más compleja
de lo que se asume hasta hoy que se deriva de un solo modulador
el nitrógeno, e involucrar al agua como otro factor
determinante de la relación entre este género
bacteriano y las leguminosas.
Palabras clave. Fijación biológica de
nitrógeno, agua, leguminosas, trealosa.
Nódulos.
Una de las principales características de la
mayoría de las leguminosas estriba en su capacidad para
asociarse con bacterias del
género Rhizobium, lo cual resulta en la
formación de nódulos en su sistema radical
en cuyo interior se realiza la fijación biológica
de nitrógeno -FBN- (Allen y Allen, 1981). Así las
leguminosas en su asociación con Rhizobium tienen
una gran importancia agrícola y ecológica debido a
que son responsables de una parte sustancial. quizá de la
mayoría, del f1ujo global de nitrógeno
atmosférico a formas "fijadas", tales como el amonio,
nitratos y compuestos
orgánicos (Young y Hauka, 1996).
Por este motivo. por muchos años los estudios de
la simbiosis entre las leguminosas y Rhizobium han girado
alrededor de la FBN (Bergensen et al., 1987; Bordeleau
et al., 1994; Elkan, 1992; Greenland, 1977; Guerin et
al., 1990; Long, 1989; Postgate, 1982; Quispel, 1988; Sprent,
1989). Diferentes factores condujeron a la revalorización
de la FBN hacia 1970: la creciente demanda de nitrógeno en
la agricultura.
el incremento de los precios de los
fertilizantes comerciales durante la crisis del
petróleo y las especulaciones basadas en
las posibilidades de la biología molecular
(Quispel, 1998).
En años recientes, se inició la
investigación sobre otras actividades que ocurren durante
la simbiosis y que pueden incidir en el desarrollo
vegetal, como la disponibilidad de otros nutrientes (Guerinot
et al., 1990), antagonismo contra patógenos
(Fuhrmann y Wollum, 1989; Hynes et al., 2000), síntesis
de reguladores de crecimiento (Azcón en
Farías-Rodríguez, 1998) y la resistencia a
condiciones adversas (Mellor, 1992).
A través de diversos estudios se conoce que
durante la simbiosis, después de la formación del
nódulo, se sintetiza un disacárido conocido como
trehalosa, el cual se acumula en el nódulo en altas
concentraciones. La síntesis de la trehalosa se lleva a
cabo por los bacteroides y la mayor proporción se almacena
en el citoplasma vegetal (Mellor, 1992). La trehalosa no parece
ser una fuente importante de energía para apoyar la FBN,
ya que su concentración aumenta a medida que el
nódulo envejece (Streeter. 1985).
La trehalosa es producida además, por
otros microorganismos fijadores de nitrógeno tales como
cianobacterias y Frankia, pero el posible papel de este
disacárido en los sistemas
simbióticos no ha sido claramente entendido (Streeter,
1999). La ubicua presencia de la trehalosa está
acompañada por una diversidad de funciones: ha
sido relacionada en osmoprotección (E. coli),
tolerancia a la desecación (S. cerevisiae); plantas
de la resurrección, nemátodos (Artemia),
osmotolerancia, termotolerancia (levaduras) y reserva de carbono
(hongos) (Araujo,
1996; Breedveld et al., 1991; Burleigh et al.,
1994; Crowe et al., 1984 a,b,c; Goddijn et al.,
2000; Mellor, 1991; Potts, 1994; Welsh et al.,
1991).
En cuanto a su función en la simbiosis,
recientemente se demostró que la acumulación de
este disacárido en nódulos de frijol está
correlacionada con la tolerancia a la
sequía (Farías-Rodríguez, 1998). Sin embargo
este conocimiento
proviene de plantas y
microorganismos cultivados bajo condiciones de laboratorio, a
través de los cuales han comenzado diversos proyectos
encaminados a generar cultivos resistentes a la sequía
mediante ingeniería
genética.
No obstante, es de vital importancia conocer los
factores que en la naturaleza
determinan la dinámica de acumulación de
trehalosa, para en un futuro esclarecer el papel de la trehalosa
en la simbiosis y su significado ecológico y su posterior
aprovechamiento.
La trehalosa es un azúcar
no reductor con una estructura
única:
α-D-glucopiranosil-( 1-1
)-α
–D-glucopiranósido, el cual se
encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza. Se ha
encontrado en todos los hongos y en muchos animales y
bacterias, pero no se ha reportado en plantas. Sin embargo, se
encuentra en los nódulos de las leguminosas, por lo
general como el carbohidrato principal (Streeter,
1999).
11.2. Trehalosa en
Microorganismos
La trehalosa se ha detectado en todos los grupos
microbianos analizados (Elbein, 1974). En los microorganismos el
papel de la trehalosa se ha relacionado con la resistencia a la
sequía y proviene de una serie de estudios en los
que se ha demostrado que organismos tales como hongos, levaduras,
bacterias y semillas de plantas son capaces de vivir por
largos períodos en condiciones de deshidratación
casi completa (Crowe et al., 1984)
Leslie et al. (1995) demostró que células de
Escherichia coli y Bacillus thuringiensis deshidratadas en
presencia de trehalosa y sacarosa, tienen un alto
porcentaje de sobrevivencia en comparación a aquellas
deshidratadas sin estos azúcares.
La sobrevivencia de E. coli deshidratada en
presencia de trehalosa fue del 70 % y con sacarosa, de 56 %,
mientras que el control la
sobrevivencia fue solo de 8 %. De manera similar, en B.
thuringiensis la sobrevivencia en presencia de trehalosa fue
de 57% y con sacarosa de 44% concluyendo que la
adición de trehalosa o sacarosa incrementa de manera
significativa la sobrevivencia, teniendo la trehalosa un mejor
rendimiento, y esto puede deberse a la capacidad de estos
azúcares para disminuir la fase de transición en
membranas deshidratadas y mantener la estructura de las proteínas
durante la deshidratación.
En S. cerevisiae se demostró que la
sobrevivencia a condiciones de deshidratación se
correlaciona con las concentraciones de trehalosa sintetizadas
por las células (Eleutherio, et al., 1993). Por
ejemplo, las cepas 1412-4 D Y 311 tienen diferente
capacidad de síntesis y acumulación de
trehalosa. siendo de 40 mg.g-1 de
células y 75 mg.g-1 de
células, respectivamente.
La sobrevivencia después de la
deshidratación fue de un 40% para la cepa 1412-4D y
90% para la cepa 311.
Las cepas incapaces de sintetizar trehalosa no
sobrevivieron a la deshidratación, sin embargo al
adicionarles 10% de trehalosa en el medio, la sobrevivencia se
incrementó a un 40%. Las cepas de S. uvarllm var
carlsbergensis acumulan poca trehalosa y son
sensibles a la deshidratación. Sin embargo sometiendo a
éstas a un ligero tratamiento osmótico (20%
sorbitol o dextrina) se favorece la acumulación de
trehalosa. Después del tratamiento osmótico se pudo
reproducir la resistencia a la deshidratación, con una
sobrevivencia de hasta 60% (Eleutherio et al., 1997), es
decir, la presencia de trehalosa se requirió en todos los
casos para poder tolerar
la deshidratación.
Mediante la sobreexpresión del gen tps 1 (el cual
codifica para la trehalosa-6-fosfato sintasa) en S. pombe,
se observaron resultados similares a los de Eleuterio, et
al (1993, 1997; Soto et al., 1999). Las cepas de S.
pombe responden a diferentes tipos de estrés
acumulando trehalosa. Las cepas recombinantes que sobreexpresan
tps 1 acumularon más trehalosa, mostrando una mayor
sobrevivencia (con diferencias de 2 á 3 unidades
logarítmicas). Se demostró que la síntesis
de trehalosa, y no la síntesis de la enzima
trehalosa-6-fosfato sintasa, es el principal mecanismo de
resistencia a diversos tipos de estrés, como el
osmótico, la temperatura
y la deshidratación.
En un estudio realizado en las arqueobacterias
Natronococcus y Natronobacterium (las cuales crecen
en condiciones de alta salinidad y elevado pH), se
encontraron resultados muy interesantes (Desmarais et al.,
1997), Se creía originalmente que este tipo de
arqueobacterias usaban iones inorgánicos, por ejemplo: el
potasio, como solutos para balancear la presión
osmótica externa, pero al estudiar la estrategia de
estas arqueobacterias para sobrevivir al este estrés
osmótico, se encontró que el principal soluto era
un compuesto orgánico, el cual resultó ser la
2-sulfotrehalosa, cuyas concentraciones se incrementan al
aumentar las concentraciones de NaCl externas.
La sultotrehalosa es el primer (quizás el
único) osmolito orgánico detectado en
arqueobacterias halofílicas
alcalifílicas.
La biosíntesis de trehalosaha sido estudiada
en detalle en S. cerevisiae y E. coli.
Comprende la formación de la trehalosa-6-fosfato a partir
de UDP-glucosa y
glucosa-6-fosfato, reacción catalizada por la enzima
trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS), posteriormente este metabolito
es desfosforilado por la enzima trehalosa-6-fosfato fosfatasa
(TPP) para generar trehalosa libre (Figura 1 a) (Elbein, 1974).
Adicionalmente se ha reportado los genes dt, una nueva ruta en
Rhizobium. La cual consiste en la utilización de
maltoheptosa como sustrato (Figura 1 b). La reacción es
catalizada por la maltoologosil y la trehalosa sintasa (MTS) y la
maltoologosil trehalosa hidrolasa (MTH). La MTS cataliza por una
transglucosilación intramolecular la formación de
uniones glicosídicas α-α (
1-1). La MTH hidroliza el producto de la
reacción de la MTSasa en la unión
α(1-4)entre el grupo
maltoologosil y la trehalosa, liberarando así el
disacárido (De Smet et al.,2000; Maruta et
al., 1996).
La hidrólisis de la trehalosa puede ocurrir en
diferentes formas, en Euglena gracilis y Pichia
fermentans es realizada por la enzima trehalosa fosforilasa,
en Escherichia coli por una fosforilación y seguida
de la hidrólisis por acción
de la enzima trehalosa-6-fosfato hidrolasa. En plantas, hongos,
animales y bacterias la hidrólisis se realiza por la
enzima trehalasa
(αα-trehalosa 1-
D-glucohidrolasa) (Figura 1 a).
II.3. TREHALOSA EN LAS
PLANTAS
En plantas la trehalosa fue aislada por primera vez en
Selaginella lepidophylla y subsecuentemente ha sido
encontrada en otras pteridofitas investigadas. S.
lepidophylla entra en dormancia durante períodos de
sequía y revive cuando el agua es
nuevamente disponible. Durante la sequía extrema, los
niveles de trehalosa alcanzan el 20% del peso seco en las hojas,
posiblemente protegiendo las estructuras
celulares y sus componentes de la desnaturalización
(Goddijn y Smeekens, 1998).
Se ha demostrado claramente que el papel de la trehalosa
en estas plantas cryptobióticas es la tolerancia al
estrés, en particular a la sequía (Goddijn et
al., 1999) La ausencia general de trehalosa en las semillas y
polen resistentes a la desecación, ha sugerido que las
plantas superiores han perdido la capacidad para producir
trehalosa (Crowe et al., 1992).
La presencia de trehalosa en angiospermas ha sido
cuestionada, ya que sólo se ha detectado en hojas de
plantas tolerantes a la desecación tales como
Myrothamus flabellifolius y Sporobolus stapjianus.
llamadas plantas de la resurrección (Müller et
al., 1995; Goddijn et al., 1998), en donde, en las
hojas de M. flabellifolius se ha encontrado que
representa hasta el 19% de los azúcares después de
4 días de deshidratación (Bianchi et al.,
1993).
En las espermatofitas la presencia de trehalosa no ha
sido comprobada, pues ha sido atribuida a contaminación de las muestras por
microorganismos (Elbein, 1974). Para excluir la posibilidad de
contaminación, se ha utilizado la biología
molecular para detectarla en las plantas. Recientemente la
presencia de los genes para la síntesis de trehalosa ha
sido reportada en Arabidopsis thaliana (Blázquez
et al., 1988; Goddijn et al., 1998; Vogel et
al., 1998).
El gen para la trehalosa-6-fosfato sintasa fue detectado
por complementación en una cepa mutante de S.
cereviciae TPS l' con una librería de cDNA de
Arabidopsis, sin embargo, en las transformantes, la
síntesis de trehalosa no alcanzó los valores
del tipo silvestre durante la fase estacionaria. El análisis de secuencia del inserto,
reveló que el marco de lectura
abierto más grande codifica para una proteína de
942 aminoácidos, la cual es 45% mayor que cualquier
trehalosa-6- fosfato sintasa de otros organismos. Los primeros
500 aa muestran una similitud entre e1 35% y el 70% con otras
TPS. La posición C terminal de la proteína no tiene
similitud con otra secuencia conocida.
Posteriormente se detectaron en la planta
únicamente poly (A) RNAm de TPS 1 en todos los tejidos de la
planta, siendo baja su expresión, sin embargo no se
observó la acumulación de trehalosa
(Blázquez et al., 1988). El gen de la
trehalosa-6-fosfato fosfatasa en Arabidopsis fue detectado
usando la técnica anterior en una cepa de levadura TPS2',
observándose dos transcritos que complementaron dichas
mutantes, y que a través del análisis de secuencia
se obtuvo una alta homología con otras reportadas para la
TPP en microorganismos. Los polipéptidos codificados por
estos dos cDNA de Arabidopsis tiene en la parte N terminal
una extensión de 100 aa que se asemejan al péptido
señal requerido para la importación al cloroplasto. La
región N terminal en levadura es de 500 aa, la cual tiene
homología con la TPS, pero carece de actividad (Vogel
et al., 1998).
En vista de la presencia de los genes que codifican para
las enzimas de la
biosíntesis de trehalosa en plantas, es probable que esta
se produzca. Sin embargo, aún queda por demostrar si estas
enzimas son funcionalmente activas en la planta. Sobre todo,
donde y cuando las enzimas, así como su producto
están presentes en los tejidos de la planta (Vogel et
al., 1998).
II.4. TREHALOSA EN
SISTEMAS SIMBIOTICOS:
En un dramático contraste, la trehalosa es muy
común en plantas en simbiosis con microorganismos, aunque
la acción de la trehalosa en plantas superiores no ha sido
bien entendida (Mellor, 1992).
II.4.1. Actinorrizas.
Frankia, es un actinomyceto que puede formar
nódulos con 22 géneros de plantas entre las que se
encuentran: Casuarinaceae, Alloeasuarina, Casuarina;
Coriariaceae, Coriartia; Betulaceae, Alnus;
Dastiscaceae, Dastiea; Myricaceae, Myriea,
Comptonia; Rosaceae, Rubus, Dryas, Purshia,
Cereoearpus, etc. Económica y ecológicamente
las especies más importantes son Alnus y
Casuarina (Mellor, 1994). Frankia almacena carbohidratos
en forma de glucógeno y trehalosa. La cantidad de
trehalosa se relaciona inversamente con la fijación de
nitrógeno. Se cree que esto se debe principalmente a una
disminución en la síntesis de trehalosa más
que a su hidrólisis. Los nódulos
actinorrícicos contiene grandes cantidades de sacarosa,
que junto con la fructosa son capaces de mantener la
fijación de nitrógeno.
El conocimiento de la trehalosa y la trehalasa en los
nódulos es escaso (Mellor, 1992). En otros estudios, se
demostró que la concentración intracelular de
trehalosa en Frankia se incrementó de O
ng.μg-1
proteína hasta 612
ng.μg-1
proteína cuando se sometió a esta a
diferentes condiciones osmóticas. Además la
concentración de trehalosa interna se relacionó de
manera directa con la habilidad de sobrevivir a la
desecación, asumiendo que esta puede ser un agente
osmoprotector (Burleigh y Dawson, 1994)
II. 4.2. Micorrizas.
Las micorrizas son las simbiosis más comunes que
se establecen con plantas vasculares. Se ha observado en cortes
de ectomicorrizas que la glucosa y la fructosa pueden ser
convertidas en trehalosa y manitol. La trehalosa puede ser
transportada al citoplasma de la célula
vegetal. Se ha propuesto que la concentración de
trehalosa en raíces es proporcional al grado de
micorrización (Niederer, 1989 en Mellor, 1992). En las
raíces de soya infectadas con Glomus mosseae, una
micorriza vesículo-arbuscular, se incrementaron
significativamente los niveles de trehalosa, así como la
actividad de trehalasa. En estos casos, la trehalosa de origen
fungal puede entrar a los tejidos de la planta debido a la
íntima relación de la endosimbiosis, en donde el
contacto célula-célula es más estrecho
que en las ectomicorrizas, por lo cual las micorrizas
vesículoarbusculares son comparadas regularmente con la
simbiosis de Rhizobium (Mellor, 1992).
En plantas inoculadas (Glycine max cv Maple
arrowy Tagetes tenuigolia) el contenido de trehalosa en
raíces incrementó a partir del día 10,
alcanzando 32 mg g-1 de peso fresco al final del
experimento. Se propuso que la trehalosa fue sintetizada por el
hongo a partir del carbono proveniente de la planta. Por otra
parte, en raíces sin inocular no se detectó
trehalosa (Schubert et al., 1992).
En las micorrizas, el metabolismo de
carbohidratos y su flujo entre el huésped y el hongo han
recibido considerable atención. Aunque el movimiento de
carbono ha sido demostrado, se conoce poco de la naturaleza de
las moléculas que son intercambiadas. El concepto
más simple de transporte
bidireccional involucra Pi y carbohidratos solubles, con la
adición de nitrógeno orgánico del hongo a la
planta. Las moléculas transferidas tienen implicaciones
importantes en el mecanismo de transporte que puede operar y en
el movimiento simultáneo de otros iones.
La distribución de ATPasas en las membranas
plasmáticas de las células de la raíz y los
arbúsculos, apoyan el concepto de un transporte controlado
en ambas direcciones (Schubert et al., 1992). En
esporocarpos la trehalosa fue el principal carbohidrato soluble
que se detectó y su concentración fue de 1.42
mg.g-1 de peso fresco, lo que
representó el 94% del total de los carbohidratos.
Asimismo, en raíces de otras plantas micorrizadas, el
porcentaje de trehalosa fue de 4.4% del total de carbohidratos
(Mellor, 1992).
II .4.3 Rhizobium /Leguminosa.
En los primeros estudios realizados en Bradyrhizobium
japonicum se demostró que la trehalosa es uno de los
principales carbohidratos (Streeter, 1985). Posteriormente se
encontró que todas las especies de Rhizobium
examinadas hasta ahora, acumulan este azúcar (Salminen
et al., 1986; Müller et al., 1994).
La composición del medio de cultivo (diferentes
fuentes de
carbono y nitrógeno, como manitol, arabinosa y urea,
glutamato respectivamente), el estado de
crecimiento de la bacteria y la cepa, tiene influencia en la
concentración de trehalosa en las células,
alcanzando concentraciones mayores al 90% del total de mono y
disacáridos presentes, entre los cuales detectaron
arabitol, arabinosa, manitol, fructosa y glucosa. R.
japonicum no creció en medios que
contenían trehalosa, sin embargo, la marcada
acumulación de este azúcar por la bacteria en otros
medios sugiere que es utilizada para otros fines diferentes a la
reserva de carbono (Streeter, 1985).
En R. leguminosarum sometido al 2% se
observó un incremento significativo en las concentraciones
de trehalosa (Hoelsle et al., 1990). El mecanismo
bioquímico involucrado en la acumulación de
trehalosa bajo condiciones limitantes de 2% no es aún
claro, sin embargo se cree que la acumulación puede ser
atribuida a un incremento en la síntesis o bien a una
disminución en la degradación de
trehalosa.
La trehalosa ha sido detectada en la simbiosis entre
Rhizobium y leguminosas, y su síntesis la realizan
exclusivamente los bacteroides. Sin embargo, la mayor parte de la
trehalosa sintetizada es liberada al espacio peribacteroidal, de
tal forma que puede ser encontrada en el citoplasma de las
células huésped (Streeter, 1985). La
concentración de trehalosa en los nódulos es 10
veces mayor que en cualquier otro órgano.
Se han encontrado cantidades de 2 á 14 mg de
trehalosa . g-1 nódulo fresco
(Streeter, 1980, 1984). Lo mismo sucede en el caso de los
nódulos de Phaseollls vulgaris, Pisum sativum, Arachis
hipogea, Medicago sativa, Trifolium repens, Lotus
corniculatus y Sesbania rostrata (Streeter, 1985). A
través de la familia
Leguminosae, los nódulos de los miembros de Papilionaceae
y Caeslpinaceae tienen trehalosa, no se han analizado miembros de
Mimosoideae (Farías- Rodríguez, 1998a). Trazas de
trehalosa (0.1 mg.g-1 peso seco) fueron
encontrados en tallos y pecíolos (Streeter,
1980).
La velocidad de
crecimiento de leguminosas en cultivo de tejidos a los que se les
agregó trehalosa es pobre, si se compara con el
crecimiento en sacarosa. Lo anterior indicaría que la
trehalosa no es simplemente una reserva de carbono para
cualquiera de los organismos involucrados en la simbiosis
Leguminosa –Rhizobium (Mellor, 1992).
En los nódulos la trehalosa parece no ser una
fuente de energía importante para la fijación de
nitrógeno, ya que hasta el 80% de la trehalosa se recupera
en la fracción citosólica vegetal Además, la
gran variación en la acumulación de trehalosa por
las diferentes cepas parece argumentar en contra del uso de este
disacárido en el metabolismo energético del
nódulo.
En plantas de alfalfa sometidas a estrés salino
se encontró en las condiciones iniciales (0.0 M NaCl) que
la concentración de trehalosa en el citosol de las
células vegetales es de 101 nmol.g-1
peso fresco de nódulo; en el bacteroide de 8
nmol.g-1 peso fresco de nódulo e
interesantemente, también en raíz se detectó
trehalosa en una concentración de 83
nmol.g-1peso fresco.
Mientras que a mayores concentraciones de NaCl (0.15 M)
se observó un incremento en las concentraciones de
trehalosa, alcanzando en el citosol de las células
vegetales 196 nmol.g-1peso fresco de
nódulo; en el bacteroide 35 nmol.
g-1 peso fresco de nódulo y en la raíz
288 nmol.g-1 peso fresco (Fougére
et al., 1991). Es importante señalar que en
condiciones de estrés la mayor acumulación de
trehalosa se registró en la raíz. Así la
trehalosa puede desempeñar un papel insospechado en la
simbiosis.
Aunque el papel de la trehalosa en la simbiosis
Rhizobium/leguminosa aún no es muy claro,
basándose en las evidencias
existentes es posible proponer un papel general de la trehalosa:
como reserva o almacenamiento en
forma de carbono reducido (Elbein, 1974; Inoue y Shimoda, 1981 ),
tolerancia a condiciones adversa como el estrés
hídrico (Burleigh y Dawson, 1994;
Farías-Rodríguez et al., 1998b), la
osmoregulación (Breedveld et al., 1991),
recientemente se ha propuesto que la trehalosa puede estar
involucrada en el proceso de
infección de Rhizobium y el mantenimiento
la integridad de la membrana peribacteroidal (Streeter, comunicación personal).
II.5 MECANISMO DE
ACCION DE LA TREHALOSA.
Entre los diferentes tipos de estrés que pueden
afrontar los organismos, la deshidratación es el
más común y el mejor entendido. Los principios
físicos del mecanismo del daño
por una extrema deshidratación son los mismos, sin
importar que el organismo sea un animal, microbio o planta. Por
lo tanto, los mecanismos por los cuales los organismos sobreviven
en anhidrobiosis (vida sin agua) tienen características
comunes. Una de estas características es la
acumulación de azúcares sobresaliendo la trehalosa
(Araujo, 1996).
La trehalosa en un disacárido encontrado en altas
concentraciones (>20 % del peso seco) en muchos organismos que
naturalmente sobreviven a la deshidratación,
fenómeno conocido como anhidrobiosis. Tales organismos
incluyen, por ejemplo, levaduras, plantas de la
resurrección, quistes de algunos crustáceos, muchas
bacterias, y algunos animales microscópicos (Crowe y
Crowe, 2000). La acumulación de grandes cantidades de
trehalosa por las células anhidrobióticas se ha
relacionado directamente con esta tolerancia.
El mecanismo por el cual la trehalosa media la
tolerancia a la desecación no ha sido completamente
determinado, pero parece involucrar efectos sobre
proteínas y membranas (Guo et al., 2000). La "Hipótesis del reemplazo del agua", es la
más aceptada para explicar el mecanismo de acción
de la trehalosa (Crowe y Crowe, 2000). En general, se cree que la
trehalosa reemplaza la cubierta de agua alrededor de las
macromoléculas, previniendo el daño causado durante
la deshidratación. En las membranas, la trehalosa
reemplaza a las moléculas de agua alrededor de las cabezas
polares de los fosfolípidos en el estado de
desecación.
Los ocho grupos hidroxilo de la trehalosa son capaces de
formar puentes de hidrógeno con los grupos carbonil o fosfato
de los lípidos,
de tal manera, se cree que este azúcar ocupa un espacio
entre las moléculas de lípidos (Crowey y Crowe,
1984a, b; Crowe et al., 1992; Mazzobre et al 1997; Potts, 1994).
La trehalosa puede disminuir la temperatura de la fase de
transición de la membrana, de tal manera que permanece en
un estado cristalino líquido.
Se supone que esto previene el rompimiento de la
membrana durante la rehidratación, por lo tanto
preservando la viabilidad de las células. Adicionalmente,
la trehalosa tiene una alta temperatura de transición
vítrea, lo que provoca al. 2000), el cual se define cuando
la viscosidad del
citosol alcanza un punto en el cual se evita la difusión
del agua, y la solución asume las propiedades
mecánicas de un plástico
sólido.
Los beneficios de la formación de este estado
para un organismo que enfrenta condiciones de
deshidratación son muchos. Dicho estado excluye las
reacciones
químicas que requieren difusión. Lo anterior
asegura la estabilidad de la célula
durante el período de latencia, previene el colapso de las
células, permiten la continuidad de los puentes de
hidrógeno en la interfase entre el citosol vítreo y
la membrana hidrofilica de las células (Koster, 1991
;Mazzobre et al., 1997; Williams y Leopold,
1989).
La sequía incide directamente en la fusión y
en la fase de transición lipídica. Se ha demostrado
que la trehalosa inhibe la fusión entre vesículas,
pero que dicha inhibición aparentemente no es suficiente
para preservarlas. Por esta razón, se ha propuesto que la
estabilización observada puede ser explicada si se
analizan las fases de transición. Cuando las membranas
fosfolipídicas están hidratadas, las
moléculas de agua se intercalan entre los grupos
fosfato.
Posteriormente, cuando el agua es removida se incrementa
el contacto entre las cabezas polares, lo cual ocasiona que
aumenten las interacciones de Van Der Waals, conduciendo a un
incremento de la temperatura de la fase de transición (T
m)'. Bajo estas condiciones, los lípidos se encuentran en
una fase de gel, permitiendo que las membranas se dañen al
momento de la rehidratación, ya que ocurre
separación de ciertos constituyentes de éstas. Se
ha demostrado que la trehalosa previene este rompimiento al
evitar que se incremente la temperatura de la fase de
transición, permitiendo así que los lípidos
se mantengan en un estado cristalino en ausencia de agua (Crowe
et al., 1992; Leslie et al., 1995; Potts,
1994).
Con respecto a las proteínas, se ha demostrado
que la trehalosa inhibe su desnaturalización mediante la
exclusión del agua de la superficie de la proteína
cuando las células están deshidratadas,
probablemente reemplazando las moléculas de agua que
contribuyen al mantenimiento de un plegado adecuado en la
estructura de la proteína, interactuando mediante puentes
de hidrógeno de sus grupos OH y los residuos polares en
las proteínas manteniendo la estructura terciaria de estas
y evitando por lo tanto su desnaturalización.
Así, la trehalosa preserva las membranas y
proteínas en un estado físico similar alas
condiciones cuando están completamente hidratadas,
sugiriendo que los grupos hidroxilos de la trehalosa pueden
interactuar físicamente con los residuos polares de estos
componentes celulares (Crowe y Crowe, 2000)
II. 5 LA
TREHALOSA EN LA TOLERANCIA AL ESTRÉS HIDRICO EN LAS
PLANTAS.
Muchas plantas, durante su desarrollo se enfrentan a
diversos tipos de estrés, dentro de los cuales destaca la
sequía. El tipo de estrés hídrico puede
variar desde pequeñas fluctuaciones en la humedad
atmosférica hasta un déficit extremo de agua en el
suelo. Con excepción de las plantas que toleran una
extrema deshidratación celular, la adaptación al
estrés hídrico involucra la reducción de la
deshidratación celular mediante mecanismos de
prevención o tolerancia.
El estrés hídrico en la planta es el
resultado de la reducción en el potencial hídrico
del suelo, el cual usualmente ocurre progresivamente y la
fluctuación en la velocidad de evaporación, la cual
ocurre con cambios diarios en radiación
neta y humedad. El mantenimiento de la turgencia ha sido
observado como una respuesta a cambios en el potencial
hídrico.
Existe una acumulación de solutos durante la
reducción del potencial hídrico, cuyas
concentraciones varían de acuerdo a la especie y el tejido
de la planta y tienen un papel importante en la
osmoregulación. Los principales constituyentes son los
azúcares y los aminoácidos (Morgan, 1984). Se ha
demostrado que ciertos azúcares tienen un papel central
.en la protección contra las sequías. La
importancia de azúcares solubles en la tolerancia a este
tipo de estrés en las plantas, ha sido sugerida por
estudios en los cuales la presencia de azúcares
particulares se correlacionan con el incremento de la tolerancia
a la desecación (Ingram y Bartels, 1996).
In vitro, la trehalosa es un protector efectivo
contra el estrés y reduce el daño por congelamiento
de células de plantas criopreservadas (Bhandal, 1985 en
MüIler et al., 1995). En vista del bien documentado
potencial de la trehalosa para proteger las proteínas y
membranas (Crowe et al., 1992; Mazzobre et al.,
1996), y el hecho que muchos grupos de organismos incapaces de
mantener un medio interno constante acumulen trehalosa bajo
condiciones de estrés (Breedveld et al., 1991;
Welsh et al., 1991; Potts, 1994), es intrigante que muchas
plantas vasculares carezcan de trehalosa, aún cuando son
sujetas a cambios severos de las condiciones externas o a una
completa desecación (MüIler et al., 1995). La
sacarosa, que se cree reemplaza a la trehalosa en las plantas
superiores, se requiere en cantidades mucho más grandes
para tener un efecto similar. Por lo tanto, probablemente las
plantas con la capacidad de acumular trehalosa puedan tener una
mayor resistencia bajo condiciones de estrés (MüIler
et al., 1995). Por ejemplo, Mirothamus
flabellifolia, una angiosperma tolerante a la sequía
que acumula trehalosa.
En plantas transgénicas de tabaco, a las
cuales se les insertó el gen de la trehalosa-6-fosfato
sintasa, se observó una acumulación de trehalosa
(0.17 mg . g-1) en las hojas, dicha
acumulación se vio relacionada con un cambio
dramático en la resistencia de las plantas a la
sequía. Las bajas concentraciones del azúcar
condujeron a postular que esta actúa dentro de un
mecanismo de transducción de señales
hasta ahora no identificado, pero que interviene con el
metabolismo de los carbohidratos en la planta (Romero et
al., 1997).
Por otra parte, la producción de fríjol en
México se
da principalmente bajo condiciones de temporal, donde se tienen
altas posibilidades de que el cultivo se encuentre bajo
sequía. Adicionalmente, el frijol es una planta C- 3 lo
cual la ubica como altamente sensible a la sequía. Sin
embargo, diferentes estudios en México sugieren que esta
planta posee un mecanismo de tolerancia a la sequía
(Farías-Rodríguez, 1998a). El frijol en
México se cultiva desde hace 6000 á 7000
años y la evolución de esta especie probablemente ha
sido paralela a la de su correspondiente microsimbionte, por lo
cual existe gran diversidad de cepas nativas de Rhizobium.
Además, el fríjol se cultiva prácticamente
en todo el país y la población de cepas nativas es alta en casi
todos los suelos de
México, especialmente en las regiones productoras de
frijol, donde las poblaciones de rizobios nativos ascienden hasta
lOs células por gramo de suelo, con predominio de
cepas inefectivas (Castellanos et al., 1995a).
Adicionalmente, estudios en donde se propuso la selección
de cepas de alta competitividad, indican que solamente en cuatro de
cada diez experimentos la
inoculación tiene éxito,
ya que al introducir al campo cepas de excelente comportamiento
en condiciones controladas, no reproducen su alta competitividad
y muestran un pobre comportamiento (Castellanos et
al., 1995a). Una explicación a lo anterior es que la
cooperación metabólica entre los simbiontes pueda
ir más allá de la fijación biológica
de nitrógeno (Quispel, 1988; Long, 1989).
Así, la indicación de que la
nodulación y la acumulación de trehalosa en
las leguminosas puede tener un papel en la tolerancia a la
sequía, proviene de las observaciones de plantas sin
inocular de varios cultivares de frijol, las cuales exhiben en
comportamiento similar: una pobre tolerancia a la sequía.
Sin embargo, los cultivares Canario y F38, al ser
nodulados con cepas nativas, mostraron altas concentraciones de
trehalosa (0.5 y 3.1 mg.g-1
nódulo respectivamente). Las concentraciones de trehalosa
en los nódulos se incrementaron bajo condiciones de
sequía (3.4 y 10.4 mg.g-1
nódulo) y estos cultivares mostraron una excelente
resistencia a la sequía. Contrariamente, en los
nódulos del cultivar Flor de Mayo Bajío la
acumulación de trehalosa bajo riego fue de 0.9
mg.g-1 nódulo, estos niveles no
aumentaron significativamente en la sequía (1.6
mg.g-1 nódulo) mostrando una alta
sensibilidad al estrés. Esta es la mejor prueba hasta
ahora, que producción simbiótica de trehalosa puede
beneficiar a la planta hospedera incrementando su tolerancia al
estrés (Farías-Rodríguez, 1998
a).
Agradecimientos. A la coordinación de la investigación científica de la UMSNH
por el apoyo con el proyecto 2.7
(2005-2006) por las facilidades para su
publicación.
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R.
Farías-Rodríguez3
1Microbiologia ambiental Centro de Investigaciones y
Estudios Avanzados. IPN, Unidad Irapuato, Irapuato, Guanajuato,
México.
2Instituto de Ecología, Universidad
Nacional Autónoma de México. México,
D.F.
3Ecología microbiana
*autor correspondiente
Instituto de Investigaciones Químico
Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás
de Hidalgo, Morelia, Michoacán, México