Azotobacter vinelandii en suelos tratados con estiércol de bovino y el herbicida 2, 4-D

1. Resumen
2. Introducción y
   antecedentes
3. Material y
   métodos
4. Resultados y
   discusión
5. Literatura
   citada

RESUMEN

La bacteria Gram negativa aerobia Azotobacter
vinelandii es considerada fundamental en el ciclo de N por su
propiedad de
fijar N2 (FBN), sin embargo por su capacidad de
utilizar ácidos
húmicos del suelo hoy se le
asocia al ciclo del C cuando no se observa actividad de
reducción de acetileno (FBN) en un suelo enriquecido con
ácido p-hidrobenzenico (APB) uno de los principales
ácidos húmicos (AU) del suelo con un herbicida y
nitrógeno orgánico.

Por lo anterior el propósito de este trabajo fue
analizar el efecto del enriquecimiento de dos tipos de suelos
estériles sobre el crecimiento y producción de CO2 por el aislado
OLD-R de Azotobacter vinelandii. Para lo cual los suelos
se ajustaron a un 60% de humedad y enriquecieron con
estiércol de bovino al 1% (p/p), y 1.0 ppm del herbicida
2,4-D.

Los resultados indican que en un suelo el 2,4-D, primero
inhibió y luego estimuló el crecimiento y la
producción CO2 por A. vinelandii. Estos resultado
sugieren que el estiércol de bovino estimuló la
actividad de la bacteria para mineralizar algunos de los AU
contenidos en la materia
orgánica de los suelos analizados, con lo que se apoyo el
argumento de que A. vinelandii también participa en
el ciclo del C y que en el nitrógeno su posición es
de menor importancia.

Palabras clave. ácidos húmicos,
ciclo del carbono.
Mineralización.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

La bacteria Gram negativa aerobia heterotrófica
Azotobacter vinelandii se distribuye en suelo, el agua y la
rizósfera de plantas (Garcia
et al 2005; Sánchez-Yáñez, 1992;
Tchan, 1984), fija N2 en ausencia de formas combinadas
de ese elemento (Moreno, 1986). A pesar de que se considera
autóctona del suelo, mínimos reportes existen sobre
su comportamiento, en ese ambiente (Wu
et al., 1987). Algunos de estos trabajos (Moreno, 1986; Wu
et al.,1987), señalan que crece en el suelo debido
a su capacidad para oxidar ácidos húmicos (AU)
derivados de la mineralización de la materia
orgánica en ese ambiente, lo que sugiere una posible
estrategia de la
bacteria para supervivir y eventualmente crecer en suelos pobres
en materia orgánica, que a la vez la asocia con el ciclo
de carbono, ya que está probado que en la naturaleza
especialmente el suelo los niveles de N combinado no se reducen
lo suficiente para inducir la síntesis
de la nitrogenasa, enzima que solo se sintetiza por las bacterias
diazotroficas en respuesta a la ausencia de compuestos de N
inorgánicos u orgánicos.

En consecuencia es difícil demostrar que
naturalmente A. vinelandii y bacterias similares fijen
N2. A este respecto se demostró que en un suelo
dializado, en ausencia de fuentes
sencillas de carbono, pero que contiene AU del tipo
p-hidroxibenzoico o m-hidroxibenzoico (Hardisson et al.,
1969) la FBN no se detectó (Moreno, 1986). Estos reportes
apoyan el argumento de su participación en procesos de la
transformación de compuestos del ciclo del C y sugiere que
en este ciclo donde probablemente la bacteria realiza su
verdadera actividad en el suelo, y no necesariamente en el ciclo
de N.

No obstante su capacidad de fijar N2 es una
indicación de su potencial en un ambiente artificial como
los medios de
cultivo sintéticos sin N (Wu et al., 1987) pero no
en la naturaleza (Vela, 1998; comunicación personal), lo
anterior también se apoya en las observaciones de
González–López et al., (1984), Moreno
(1986), Wu et al., (1987) y Vela (datos sin
publicar, 1998).

Lo anterior se apoya en que la adición de
nitrógeno orgánico al suelo estimula la
utilización de los AU con estructura
química
similar a los pesticidas Belajee y Mahadevan, (1989, 1990) y
Groseclose y Ribbons (1981). Por tanto los propósitos de
este trabajo fueron analizar : el crecimiento y producción
de CO2 por Azotobacter vinelandii en suelo
agrícola enriquecido con estiércol de bovino y
tratado con el herbicida 2,4 D.

MATERIAL Y METODOS

I) Origen de Azotobacter
vinelandii.

El aislado Old-R de A. vinelandii fue
donado por el Dr. R. G. Vela, del Departamento de Ciencias
Biológicas de la Universidad del
Norte de Texas, E.U.A. El liofilizado de la bacteria se
activó en caldo Winogradsky (g/L: KH2
PO4 0.25, MgSO4.7H2O
0.125, Na Cl 0.125, Na2
MaO4.5H2O 0.005,
MnSO4.4H2O 0.005,
CaCO3 0.1, glucosa 10.0,
pH 7.0). El
cultivo se agitó a 250 rpm, a temperatura de
28°C por 48 h. Después las células se
lavaron por centrifugación en amortiguador de fosfatos 2M,
pH 7.2 a 10,000 rpm por 40 minutos y luego se resuspendieron en
el amortiguador y se ajustaron a una concentración final
de 1X103 células/mL, para inocular los
suelos.

II) Preparación de los suelos.

Suelos de los municipios de Marín y General
Terán, N. L., México
fueron secados y tamizados en una criba de 2 mm de
diámetro, se esterilizaron a 15 lb/1 h durante tres
días consecutivos y después se sometieron a los
siguientes análisis fisicoquímicos: textura,
porcentaje de humedad, capacidad de retención de agua,
contenido de materia orgánica, pH y porcentaje de
nitrógeno, según Palmer & Troeh (1976) y Brady
(1974).

III) Crecimiento de A. vinelandii en suelo
estéril.

Para realizar el experimento se usaron viales de 25 mL
con 10g de cada suelo, inoculados con 1 mL de la
suspensión de 1X103 células/mL del
aislado Old-R, se incubaron á 28° C una semana. A
intervalos de 24 h, un gramo del suelo inoculado se
suspendió y diluyó en un amortiguador de fosfato
para estimar el número de A. vinelandii bacterias/g
de suelo seco en agar Winogradsky, incubadas á 30°C
por 48 h.

a) Producción de CO2 por A.
vinelandii en los suelos.

Para determinar el efecto del enriquecimiento del
herbicida en el suelo sobre la producción de
CO2 por A. vinelandii, se uso el método de
Stotzky y Norman (l961) para capturar del CO2 en el
álcali y titular con HCl. Se colocaron 100 g de cada suelo
en matraces tipo Bartha (Bartha y Pramer, 1965), los suelos se
enriquecieron con 1% (p/p) estiércol de bovino
(esterilizado por separado a 15 lb/30 min) y 1.0 ppm (v/v) del
herbicida 2, 4-D (CIBA-GEIGY). Los suelos se inocularon con la
misma concentración celular de A. vinelandii usada
en el experimento II. Los viales se incubaron durante una semana
á 30°C. La producción de CO2 se
determinó cada 24 h.

IV) Análisis
estadístico.

Se empleó un análisis de varianza con
cuatro tratamientos y siete repeticiones, para evaluar el
comportamiento de los aislados OLD-R en los suelos
estériles. Se incluyó un análisis de
correlación para determinar el efecto del tipo de suelo
sobre el comportamiento de la bacteria (Torrie, 1995).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I) Características fisicoquímicas de
los suelos.

Los dos suelos mostraron una textura de tipo arenoso, el
suelo de Marín, N.L., fue rico en nitrógeno
(0.279%), extremadamente rico en materia orgánica (5.14%)
con una humedad de 73.3%, El suelo de General Terán N.L.,
fue mediano en el contenido de nitrógeno (0.185%), rico en
materia orgánica (3.70%), con una humedad de 53.3%,
(Brady; 1974., Palmer y Troeh, 1976).

II) Crecimiento del aislado OLD-R en los suelos
enriquecidos.

En el cuadro 1 muestra que no
hubo diferencia en el crecimiento y producción de A.
vinelandii en el suelo húmedo o seco de
Marín N.L. Tampoco con la adición del
estiércol de bovino, posiblemente el contenido de N en el
suelo nitrógeno.

El herbicida 2,4-D redujo el número
células de la bacteria aunque en poco tiempo
después recuperó su número original, lo que
apoya que A. vinelandii tiene capacidad genética
(Maia et al., 1988) para tolerar la acción
del herbicida, como lo han señalado Groseclose y Ribbons
(1981), Balajee y Mahadevan (1989,1990), puesto que está
demostrado que tiene la capacidad de utilizar AH como fuente de C
y energía como una estrategia de sobrevivencia en el
ambiente (Maia et al., 1988;
Sánchez-Yáñez, 1992).

En el cuadro 2 muestra que el crecimiento de A.
vinelandii Old-R en el suelo de General Terán,
N.L., no fue diferente al observado en el suelo seco y/o en el
húmedo. A pesar de la adición del 1% (p/v) del
estiércol de bovino, probablemente por la falta de
disponibilidad de este nitrógeno orgánico agregado,
en relación con el N presente en el suelo. Se
observó un efecto estimulatorio del 2,4-D, sobre el
aislado OLD-R en el suelo de Marín, lo que confirma que
este herbicida no es específico contra malezas como ha
sido reportado por Brow (1973), Beteson et al. (1986). En
consecuencia A. vinelandii disminuyó su velocidad de
crecimiento.

En el cuadro 3 se muestra que la producción de
CO2 en el suelo de Marín por A.
vinelandii fue menor que al agregar el estiércol de
bovino, en comparación con la cantidad de CO2
producida en el suelo sin adicionarlo, lo cual indica que al
saturar el suelo de nitrógeno, se inhibió su
actividad metabólica, como se ha reportado en otros
microorganismos del suelo (Beteson et al., 1986). La
concentración de 1.0 ppm del 2,4 D, disminuyó la
producción inicial de CO2, por A.
vinelandii, lo que sugiere una relativa toxicidad del
herbicida y posteriormente su probable utilización como
fuente de carbono y energía, como lo han descrito Belajee
y Mahadevan (1989,1990) en otros pesticidas de uso común
en agricultura
por especies de Azotobacter.

En lo que respecta al la producción de C02 se
observo que el estiércol de bovino aplicado en el suelo de
General Terán estimuló la cantidad de
CO2 producido por A. vinelandii, posiblemente
porque las características fisicoquímicas del suelo
de probreza de carbona asimilable y nitrógeno, facilitaron
la disponibilidad de los compuestos de nitrógeno
orgánico agregados. El incremento en la producción
de CO2 por la OLD-R al adicionar el 2,4-D, indica que
Azotobacter contiene en su genoma vías de
asimilación de compuestos naturales similares al herbicida
como reportan (Belajee y Mahadevan, (1989) y Robson et
al., (1984) lo cual les confiere una ventaja ecológica
de mejor capacidad competitiva en el suelo y que apoya su
relación con el ciclo del carbono.

CUADRO 1. CRECIMIENTO DE
Azotobacter vinelandii OLD-R

EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO DE
MARIN, NUEVO LEON, MEXICO.

NC= Crecimiento incontable. Experimento realizado por
triplicado en agar Winogradsky. Inóculo inicial
1×104 células/mL (Log.
No.cel/mL=4.0).

CUADRO2. CRECIMIENTO DE
Azotobacter vinelandii OLD-R EN SUELO ESTERIL DEL
MUNICIPIO DE GENERAL TERAN, N.L. MEXICO.

NC=Crecimiento incontable. Experimento realizado por
triplicado en agar Winogradasky. Inóculo inicial
1×104 célula/mL
(Log.No.cel/mL=4.00).

CUADRO 3. PRODUCCION DE CO2
POR Azotobacter vinelandii OLD-R

EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO
MARÍN, N.L., MÉXICO

Los datos son el promedio de 3
repeticiones. Inoculo de 5-7 mL de 1×104
cel/mL.

CUADRO 4. PRODUCCION DE CO2 POR
Azotobacter vinelandii OLD-R EN SUELO ESTERIL
DEL MUNICIPIO DE GENERAL TERÁN, N.L.
MÉXICO

Los datos son el promedio de 2 repeticiones.
Inóculo de 5-7 mL de 1×104 cel/mL.

III) Análisis
estadístico.

En el Cuadro 5 se muestra, el análisis de
varianza el cual no detectó diferencia significativa
(P>0.05) entre tratamientos, en términos de crecimiento
y producción de CO2, lo que indica que A.
vinelandii utilizó tanto el nitrógeno y los
compuestos carbonados presente en ambos suelos, como lo agregado
para enriquecerlo como el estiércol, o el
2,4-D.

Cuadro 5. Análisis de varianza del crecimiento
y producción de CO2 por Azotobacter
vinelandii en suelos de los municipios de Marín y
General Terán, N.L. México.

Sum=suma de cuadrado o suma de medio, N.S. No
significativo, **estadísticamente
significativo.

Cuadro 6. Análisis de correlación para
el crecimiento y producción de CO2 por
Azotobacter vinelandii en suelos de los municipios de
Marín y General Terán, N.L.
México.

Torrie, 1995

El Cuadro 6 muestra la correlación del
crecimiento del aislado OLD-R en el suelo de Marín versus
el suelo de General Terán, el estadístico arrojado,
r = 0.228 fue no significativo, pero diferente para la
producción de CO2, con una r = 0.717, lo que
sugiere que en base a la naturaleza química de los suelos,
a su mayor concentración, variedad de carbono y
nitrógeno, en el suelo de Marín, el aislado OLD-R
liberó la mayor cantidad de CO2.

Estos resultados apoyan la teoría
de una reconsideración del papel del género
Azotobacter exclusivamente como miembro del ciclo del N.
Investigación en progreso intenta reforzar
este argumento.

Dedicatoria

Este trabajo es dedicado con mucho respecto y
cariño a la memoria de
la Sra. Hilaria Aguilar de Tavitas, por ser un ejemplo de fe,
esperanza y amor.

AGRADECIMIENTOS

A la CIC de la UMSNH, por el apoyo a la
publicación de este trabajo por medio del proyecto 2.7
(2005-2006). "Análisis de la Microflora Fijadora de
N2 asociada a Teocintle" y maiz". al M.C
PEDRO MORENO del CINVESTAV, Irapuato, Gto, MEXICO, por el apoyo
en el análisis estadístico.

LITERATURA
CITADA

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*Ma Isabel Tavitas Aguilar,

Roland G. Vela**

Juan Manuel
Sánchez-Yáñez***

*Microbiología Industrial y del suelo. Facultade
de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de
Nuevo León, Monterrey, Nuevo Léon, México.
**Department of Biological Since, University of North Texas,
Denton, Tx USA. ***Microbiología Ambiental

autor correspondiente

Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas, Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Edificio B-1, CU; C.P. 58000 Morelia,
Michoacán, México.