Colonización de la raíces de frijol Phaseolus vulgaris L. por aislados nativos de Rhizobium etli

Colonización of the Root System of Phaseolus
vulgaris L.By Indigenous isolates of Rhizobium
etli.

2. Resumen
3. Introducción y
   antecedentes
4. Materiales y
   métodos
5. Resultados y
   discusión
6. Conclusiones

RESUMEN

La dinámica de la colonización de la
espermosfera- rizosfera de tres variedades de fríjol
(Phaseolus vulgaris L.): Negro Jamada, Canario y Flor de
Mayo, por dos cepas nativas de Rhizobium etli, se
analizó en suelo no
estéril en sistema de jarras
de Leonard.

Los resultados no mostraron diferencias estadísticas en la dinámica de
colonización entre los aislados, ni entre las variedades
de fríjol, lo que sugirió un efecto
espermósfera-rizósfera positivo sobre los aislados
y un intercambio de señales
químicas de reconocimiento entre Rhizobium y la
leguminosa. Lo cual coincidió con el elevado porcentaje de
ocupaciones de los nódulos encontrados en las
variedades.

La ssuperviviencia de las dos aislados de R.etli
en el suelo fue semejante, limitada principalmente por la
ausencia del sistema radical de la planta, lo que sugiere una
dependencia de la bacteria por los exudados de la
espermósfera-rizósfera del fríjol para
supervivir y crecer.

Palabra clave: Colonización, Exudados,
Espermosfera-rizosfera, Fríjol, Nódulos,
Rhizobium, Sobrevivencia.

SUMMARY

The colonization dynamics of spermosphere-rizosphere of
three common bean varieties: Negro Jamapa, Canario, and Flor de
Mayo by two indigenous strains of Rhizobium etli was
analized under non sterile soil condition in the Leonard´s
jar system.

Results suggest that not statistical difference was
observed between the two indigenous isolates of R. etli on
its colonization dynamics on the three common beans varieties or
neither among these, which indicated a positive effect
spermosphere-rizosphere on the isolates, also an exchange
chemicals recognition signals in coincidence with its high
occupancy per cent in the nodules on the varieties.

The R etlis´s survival of the isolates was
similar in soil. Limited mostly by the absence of the root system
of the plant, suggesting that R etli depends on the
spermosphere-rizosphere exudates of common bean its survival and
growth.

Index words: Colonization, Exudates,
Spermosphere-rizosphere, Common bean, Nodules, Rhizobium,
Survival.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

La inoculación de leguminosas con especies de
Rhizobium es una alternativa agrícola para reducir
elevadas dosis de fertilización nitrogenada e incrementar
su rendimiento (Somasegaran y Hoben, 1985; Vincent, 1970). Sin
embargo, en ocasiones la planta no muestra los
beneficios esperados, en parte por la incapacidad de competencia de
las cepas de Rhizobium usadas en su inoculación;
primero en el ambiente del
suelo, luego en la espermósfera o zona de influencia de la
semilla en germinación, la cual produce las primeras
señales químicas de intercambio
planta-Rhizobium (Brewin, 1991; Dazzo y Gardiol, 1984;
Dénarie et al., 1992) para iniciar la
colonización de la raíz, la cual se
continuará y estimulará por los productos
liberados en la interfase suelo-rizosfera o sistema radical
durante la floración cuando la planta alcanza una intensa
actividad biológica.

Este proceso
dinámico no concluirá, sino hasta la muerte de
la planta en la senectud (Araujo et al., 1994, Curl y
Truelove, 1986; Kloepper et al., 1991).

Por lo tanto es comprensible que por razones naturales
el reconocimiento de estas señales químicas para la
población de Rhizobium
autóctona del suelo, le confiera ventajas sobre las que se
introducen (Meade et al., 1985; Singleton y Tavares,
1986).

Una solución que ha sido planteada (Woomer et
al., 1988ª, 1988b), pero no estudiada lo suficiente
(Dughri y Bottomley, 1984; Moawad et al., 1984), es la de
seleccionar cepas autóctonas con alta con alta capacidad
de competencia, en lugar de introducir cepas que, aunque
competitivas, provienen de nódulos o suelos ajenos al
sitio en cuestión, debido a la determinante influencia de
la población de Rhizobium autóctono del
suelo sobre la respuesta de la leguminosa a la inoculación
con cepas introducidas (Thies et al., 1991ª
1991b).

En esta investigación se emplearon dos aislados
autóctonos de R. etli del municipio de Zaragoza,
Coah. Estas cepas se evaluaron en campo y causaron una respuesta
positiva en fríjol, en términos de peso seco y
rendimiento, comparada con diferentes niveles de
fertilización nitrogenada y con un inoculante comercial.
El objetivo de
este trabajo fue
analizar la dinámica de colonización de la
espermósfera-rizósfera de tres variedades de
fríjol (Negro Jamada, Canario y Flor de mayo) por dos
aislados autóctonos de R. etli.

Materiales y métodos

Características fisicoquímicas del
suelo usado.

Se usó un suelo agrícola del municipio de
Apodaca, N.L., México con
propiedades fisicoquímicas muy semejantes a las de suelos
de Zaragoza, Coah.; N total 0.07% (Kjeldahi), materia
orgánica 1.28% (Walkley-Black), textura arcillosa
(hidrómetro de Baouyoucos), pH 70
(potenciómetro) y humedad 30% de acuerdo con SCS-USDA
(1984).

Aislados nativos de R.etli

Los aislados de R. etli (previamente llamado
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli ),
denominadas como G-2 y Z-9, con diferente marca genética:
G-2 resistente a estreptomicina (S) (Lakeside) 1000 µg/mL y
Z-9, resistente a 1000µg/mL diazinón (D) (Diazitox
25-E. 0,0-Dietilo-2
Isopropil-4-Metil-Pirimidil-6-fósforotioato. Química del
Golfo).

Estas sustancias se usaron para su recuperación y
diferenciación adicionada al agar extracto levadura
manitol con rojo congo (AELMRC) g/L: manitol 10.0.,
K2HPO4 0.5., MgSO4.
7H2O 0.2., NaCl 0.1., extracto de levadura 1.0., rojo
congo 10.0 mL (solución 1:400), pH 7.0, agar
18.0.

Preparación de las jarras de Leonard y
variedades de fríjol.

El experimento se realizó en condiciones de
invernadero en jarras de Leonard con 3.5 kg del suelo de Apodaca,
Nuevo León, México Las tres variedades de
fríjol probadas fueron: Negro Jamapa, Canario y Flor de
May. Las plantas se
alimentaron con la solución de White:
KH2PO4 1 M-1 ml., CaCl2
2H2O 1 M-1 mL, FeSO4 trazas;
solución de elementos menores:
H3BO4-2 68 g; ZnSO4
7H2O-0 22 g; KCl-0 09 g, NAMoO4- trazas,
agua destilada
100 ml, pH 7.0), 1 mL agua destilada 100mL, pH 7.0, 1 ml de agua
destilada-1000 ml, con la adición de
NH4NO3 1M, 5 mL/1, para el frijl usado como
control con
N.

Análisis estadístico del diseño
experimental.

Se empleó un diseño estadístico de
bloques al azar, con cuatro repeticiones por intervalo de
muestreo y
seis tratamientos: T-1 = variedad (var.) Canario inoculada (inoc)
con G-2; T-2 = var. Canario inoc. Con Z-9; T-3 = var. Flor de
Mayo inoc. Con Z-9; T-5= var. Negro Jamada inoc con G-2; T-6=6
var. Negro Jamada inoc con Z-9 y los controles con y sin N con un
análisis de varianza (ANOVA): modelo I
trifactorial.

Manejo de los aislados nativos.

Los aislados de Rhizobium se activaron en caldo
extracto levadura manitol (CELM) por 30 h a 28°C, lavadas
tres veces en solución salina 0.85%. Se utilizó 1 x
104 rhizobios/mL con el nefelómetro de Mc
Farland, corroborado por cuenta viable (CV) en el
AELMRC

Dinámica de colonización de los
aislados de R etli en fríjol.

El experimento se inició con la siembra de cinco
semillas por jarra de cada variedad, cada semilla se
inoculó con 1 x 104 R etli/mL, las
jarras se mantuvieron en invernadero durante 50 días. En
cada intervalo de 0, 3, 6, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 días
después de la siembra de los dos tratamientos se
consideró una serie de jarras, y se extrajo según
el caso de 0.5 g a 1 g de/principio de raíz, raíces
antes de la nodulación, raíces-nódulos
durante la floración y al final
raíces-nódulos en lisis, para suspender en matraces
de de 25 mL con 12 mL de solución salina y agitar a 250
rpm por 30 min. De la suspensión se realizaron diluciones
seriadas en solución salina y de la 10-4,
10-5 y 106. Se tomó 0.25 mL para
sembrar por triplicado en cajas con AELMRC con S o D.

Las cajas se incubaron por cinco días a 28°C,
para determinar el promedio del logaritmo del numero de unidades
formadoras de colonias (UFC) de las cuatro repeticiones/f de
espermosfera (considerada así, de la siembra de semilla al
primordio de raíz) y rizosfera (desde el desarrollo
normal del sistema radical a la lísis total de los
nódulos).

Determinación del por ciento de nódulos
formados por los aislados nativos.

Durante la floración aproximadamente 45
días después de la siembra, se determinó el
porcentaje de nódulos formados por los aislados
autóctonos de R.etli en las variedades de
fríjol. Para ellos se trituraron 100 nódulos
obtenidos de las cuatro repeticiones de cada tratamiento en cajas
con AELMRC y (S) o (D). Las cajas se incubaron por cinco
días a 28°C, según descripción de Somasageran et al.,
(1981).

Supervivencia de los aislados en el
suelo.

En este experimento se utilizó un diseño
estadístico de bloques al azar con dos tratamientos: T-1=
suelo inoculado con el aislado de R.etli G-2; T-2= suelo
Z-9, y tres repeticiones, para lo cual porciones de 50 g del
suelo de Apodaca, N.L. se colocaron en recipientes de aluminio y se
mantuvieron a una humedad de 60% de la capacidad de campo, a
temperatura de
28°C. La determinación del logaritmo promedio de las
UFC de los aislados de R.etli de suelo seco, se
realizó como sigue: se tomaron 2 g de suelo en cada
intervalo (0, 6, 9, 12 y 15 días) y sus repeticiones, para
suspender en matraces de 50 mL con 20 mL de solución
salina y se realizaron disoluciones de las cuales se usaron la
10-2 y 10-3, se tomó 0.25 mL de cada una para sembrar en
cajas con AELMRC S o D, por triplicado, se incubaron por 5
días a 20°C.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Dinámica de la colonización de los
aislados nativos de R.etli en el fríjol.

La figura 1 muestra la dinámica de
colonización de las dos aislados autóctonos de
R.etli en la espermósfera-rizosfera de la variedad
de fríjol Negro Jamapa. Se observó un efecto
positivo estimulatorio de la espermosfera sobre ambas poblaciones
de ambos aislados (Dazzo y Gardiol, 1984), desde los primeros
días de la germinación de la semilla hasta el sexto
día, cuando alcanzaron su máxima densidad de
población; después se detecto una drástica
caída en la densidad de la población del aislado de
R.etli G-2, lo cual sugiere que durante el desarrollo del
primordio de raíz a raíces verdaderas se
incrementó la actividad fisiológica de la planta y
se liberaron otra clase de
exudados, que fueron utilizados con mayor eficacia y
rapidez por poblaciones autóctonas del suelo, que por este
aislado nativo de R.etli (Lowndorf, 1981; Moawad et
al., 1994).

Un comportamiento
diferente se observó en la población del aislado de
R.etli Z-9, la cual mostró una mejor capacidad de
competencia y utilización del nuevo tipo de exudados de la
espermosfera-rizosfera del fríjol, esto sugiere una
respuesta fisiológica distinta entre los aislados de R.
etli a exudados radicales liberados durante etapas
especificas del ciclo del biológico de la planta (Bergman
et al., 1988; Brewin, 1991).

Sin embargo, en el día 30 ambas aislados nativos
mostraron la misma densidad poblacional, esta disminución
parece ser su adaptación a las nuevas señales
químicas del sistema radical, las cuales de momento fueron
mejor reconocidas por las poblaciones del suelo antagonista a los
aislados nativos de R.etli (Dénarie et al.,
1992; Halverson y Stacey, 1986), para que luego cambios en el
tipo de señales químicas de reconocimiento entre la
bacteria y la rizósfera de la variedad, les
permitió recuperar el dominio de la
zona (Huntetr y Fahring, 1980; Long, 1989) y, como consecuencia,
alcanzar un alto porcentaje de nódulos examinados, como lo
muestra el Cuadro 2.

Estos resultados sugieren que la selección
de aislados autóctonos de R.etli (individualmente o
en mezcla), mediante el análisis de su dinámica de
colonización puede servir como herramienta para la
selección adecuada de los aislados que respondan a las
expectativas planeadas con una variedad de fríjol
especifica (Aviado et al., 1990; Beattie et al;
1989).

La figura 2 presenta la dinámica de
colonización de los autóctonos de R.etli en
la espermosfera-rizosfera del fríjol var. Canario. En ella
se observa que a diferencia de la var. Negro Jamapa, los exudados
de la espermosfera de la var. Canario estimularon selectivamente
el incremento en la densidad de la población del aislado
de R.etli G-2 (Meade et al., 1985; Yao y Vincent,
1969), pues al tercer día el logaritmo de la UFC de la G-2
fue de casi 6.0, inferior al de la Z-9 (4 8).

Entre el sexto y vigésimo noveno día, los
exudados de la rizosfera favorecieron una densidad de la
población de ambos aislados con pocas fluctuaciones,
aunque con una tendencia de la densidad de ambos poblaciones a
disminuir de la cantidad original inoculada en las semillas de
fríjol. Esto sugiere algún mecanismo
regulazación de la población del microambiente,
controlado por la planta (Schubert, 1986; Van Brussel et
al., 1986).

En el día 30 se detectó la densidad mas
baja de los aislados, lo que, como se señaló, fue
causado por el cambio en el
patrón de exudados radicales (Imsande, 1981, Long, 1989)
que favorecieron mas la actividad antagonista de los
microorganismos autóctonos del suelo, similares y
diferentes de Rhizobium (Hunter y Fahring, 1980; Maede
et al., 1985; Moaward et al., 1884).

Posteriormente, como se mostró antes, los
aislados recuperaron el dominio de la rizosfera, lo que sugiere
que tienen una mayor capacidad de reconocimiento de las
señales químicas de los exudados radicales de la
variedad, que les permite ser más competitivas en la
utilización de los exudados, no solo de otros rhizobios,
sino también de microorganismos totalmente
distintos.

Lo anterior coincidió con el alto porcentaje
(G-2=71% y Z-9=70%) de ocupación en los nódulos de
las raíces de esta variedad (Araujo et al., 1985), lo que
se señala en el Cuadro 2. esto también sugiere una
estrecha relación de especificidad de reconocimiento entre
los aislados nativos de R.etli y la variedad de
fríjol (Carlson, 1982; Carlson et al., 1987; Dazzo
y gardiol, 1984) que puede favorecer una respuesta positiva de la
leguminosa a la inoculación (Dowling y Broughton, 1986;
Ham et al., 1971; Hunter y Fahring, 1980).

En la figura 3 se muestra la dinámica de la
colonización de los aislados nativos de R.etli en
la espermósfera-rizósfera de la var. Flor de Mayo.
La que en principio fue semejante hasta antes de la
floración, esto sugiere que durante este periodo los
aislados fueron altamente competitivas, utilizaron el tipo de
exudados liberados por espermosfera-rizósfera. Mientras
que el cambio de señales químicas de los exudados
radicales afectaron negativamente la capacidad infectiva del
aislado G-2 (Caetano-Anolles, 1988; Halverson y Stacy, 1986,
Imsande, 1981) y estimularon la competencia autóctona del
suelo (Kloepper et al., 1986) contra este aislado, lo cual
se reflejó en el bajo porcentaje (50%) de ocupación
en los nódulos de esta variedad, comparado con las otras
(Cuadro 2).

Cuadro 1. Análisis de varianza de la
colonización de dos aislados nativos de Rhizobium
etli inoculados en tres variedades de
fríjol.

A=variedad de fríjol B= aislados o cepas IAxB=
Interacción variedad-aislado (cepa)
a50 días después de la
siembra

El aislado Z-9 aparentemente no fue afectada, pues
alcanzó un alto porcentaje de ocupación en los
nódulos (71%), lo que sugiere que durante la
floración, a nivel radical, se suceden cambios de
señales químicas de reconocimiento con el aumento
de la actividad biológica vegetal (Schubert, 1986; Van
Brussel et al., 1986) que afectan la dinámica de la
colonización del microsimbiote (Batisti et al., 1992;
Govers et al., 1986; Yao y Vincent, 1969). Lo cual indica
que para alcanzar el máximo porcentaje de
nodulación no solo es suficiente la colonización de
la espermosfera-rizosfera, también es necesario que la
bacteria reconozca las nuevas señales químicas que
la variedad genera en la floración (Brewin, 1991;
Dénarie et al., 1992; Imsande, 1981, Rossen, et
al., 1985) lo que permite al microsimbionte expresar al
máximo su capacidad infectiva con una mayor
ocupación de los nódulos (Long, 1989) y un probable
efecto positivo en el desarrollo de la planta (Singleton y
Tavares, 1986).

Supervivencia de los aislados de R.etli en el
suelo.

La figura 4 presenta la supervivencia (sobrevivencia) de
los aislados nativos de R etli en el suelo húmedo
no estéril. En ella se observa un comportamiento semejante
de los aislados a las condiciones físico-químicas
del suelo, con un incremento inicial en la densidad de ambas
poblaciones, lo cual sugiere que durante los primeros días
R. etli utilizó y agotó sus reservas. El
decremento posterior de las poblaciones de los aislados
probablemente fue causado, en parte, por la humedad que
estimuló efectos antagónicos y /o de depredadores
para Rhizobium como: Bdellovibrio, protozoarios y
bacteriófagos (Lowendirf, 1980; Peña-Cabriales y
Alexander, 1979). Además, el suelo careció de
fuentes de
carbono
sencillas para estimular su crecimiento (Peña-Cabriales y
Alexander, 1981), ya que por lo general estas sustancias solo se
encuentran en concentraciones suficientes para la bacteria en la
espermosfera-rizosfera del fríjol (Curl y Truelove, 1986;
Long, 1989). Por lo que Rhizobium es dependiente de estos
exudados de la espermósfera-rizosfera, únicamente
supervivió en el suelo.

En el cuadro 1 presenta el análisis de varianza
(ANOVA) de la dinámica de colonización de las dos
aislados nativos de R.etli en las tres variedades de
fríjol probadas que apoyan la interpretación de los
resultados.

El cuadro 2 muestra que cuando los aislados nativos de
R etli inoculados en las tres variedades de fríjol,
por lo general se observó que fueron más
competitivos y dominantes. Al excluir el total de nódulos
formados en las plantas control fueron inducidos por otros
Rhizobium spp que mostraron una densidad de
población por NMP que fluctuó de 1x 102
a 1x 105 rhizobios/g de suelo, lo que sugiere que los
dos aislados nativos usados en este experimento de
colonización de la espermosfera-rizosfera, fueron
competitivos, por ello estos resultados sirven de base para el
modelo propuesto por Thies et al. (1991 a. b y 1882), en el
pronostico de la posible respuesta de la leguminosa en el campo,
que en este caso es motivo de otro estudio en
progreso.

Cuadro 2. Por ciento de nódulos formados por
dos aislados nativos de Rhizobium etli inoculados
en tres variedades de fríjol.

S.N.= Sin Nitrógeno C.N.=Con nitrógeno
Promedio de cuatro repeticiones

Conclusiones.

La selección de aislados o cepas nativas de R.
etli es fundamental en el empleo de
inoculantes para variedades especificas de fríjol, como
una medida de asegurar un éxito
en su repuesta en términos de rendimiento y
reducción de la dosis de fertilización nitrogenada,
así como la posibilidad de aplicarlas en suelos con
problemas de
humedad.

Dedicatoria.

A Raul y Mario Sanchez-Yañez por su apoyo y
solidaridad de
siempre, gracias.

Agradecimientos. A la Coordinación de la Investigación Científica de la
UMSNH, Morelia, Mich, México por el proyecto 2.7
(2005-2006) por las facilidades para la publicación de
este trabajo. Al M.C. Pedro Moreno por su invaluable apoyo en la
estadística.

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1Coronado, R.E.,

2Peña-Cabriales J.J

2*Sánchez-Yáñez
J.M3.,. .

1 FCB-UANL, Apartado Postal 414, San Nicolas
de los Garza, N.L.

2 IIQB-UMSNH, Edificio B-1 58030 Morelia
Michoaca, México.

*autor correspondiente

3 CINVESTAV-IPN-Unidad-Irapuato. Apartado
postal 629, 36500 Irapuato Guanajuato, México.