Rhizobium etli, una bacteria benéfica de fríjol

1. Resumen
2. Introducción y
   Antecedentes
3. Material y
   Métodos
4. Resultados y
   discusión
6. Literatura
   consultada

Resumen

Rhizobium etli es una rizobacteria
benéfica del fríjol porque fija N2 en
los nódulos de sus raíces, cuando estas plantas se
siembran en el suelo sin
suficiente nitrógeno inorgánico combinado, que
supla la demanda
nutricional del fríjol. Mientras que para evitar que
insectos-plaga anulen este efecto positivo de R. etli en
la leguminosa. En la agricultura
convencional es necesario aplicar pesticidas para
protección de los cultivos vegetales.

Los resultados de este trabajo
indican la factibilidad de
seleccionar R. etli que conserve su capacidad de nodular y
fijar N2, al mismo tiempo que sea
tolerante a pesticidas, lo que asegure su efecto positivo en la
producción sostenible de
fríjol.

Palabra clave: Simbiosis, nódulo, plagas,
eficacia.

Introducción y
Antecedentes

La fijación biológica de
nitrógeno atmosférico (FBN), constituye una fase
clave del ciclo del nitrógeno en la naturaleza, su
forma molecular N2 no es absorbida por los eucariotes
como las plantas excepto por ciertos procariotes, aunque las
leguminosas lo hacen directamente en simbiosis con la bacteria
del género
Rhizobium (Alexander 1971, 1977).

La simbiosis representa un avance evolutivo
trascendental aplicable a la agricultura para el aprovechamiento
racional de recursos
naturales. Sin embargo la producción sostenible y
segura de fríjol requiere pesticidas que eliminen los
insectos-plaga que lo atacan, peor que no afecten la actividad de
beneficios de R. etli.

Al respecto la información sobre R etli es
contradictoria (Claridge y Schimitz 1978; Ferguson y Korte 1977).
Ya que se reporta que R. etli se inhibe con concentracione
bajas de DDT y Folidol, inferiores a las que se recomienda en el
campo para el control de
insectos-palga, en contraste se reporta que otras bacterias del
suelo, los metabolizan al usarlos como fuente de carbono y
energía (Ruplal y Saxena, 1982), como los géneros:
Pseudomonas, Streptomyces, Micromospora, Thermoactinomyces,
Nocardia y Mycobacterium (Das y Murherjee 2000;
Kantachote et. al. 2001).

Acorde con estos reportes la nodulación por
Rhizobium en las leguminosas se anula o reduce por
pesticidas (Alexander, 1971, 1977), porque en principio
éstos afectan la viabilidad de la bacteria además
de la capacidad de R etli para nódular raíces, en
consecuencia la posibilidad de la FBN (Sommerville y Greaves,
1987).

Los objetivos de
este trabajo fueron aislar y seleccionar Rhizobium etli
benéfico para fríjol resistente a
diazinón.

Material y
Métodos

I.- Origen y mantenimiento
de R.etli:

Los aislados de R. etli resistentes a pesticidas,
se obtuvieron de fríjol de acuerdo al criterio de Vincent,
(1975) colectados del campo agrícola experimental del
Río Bravo (CAERIB), del INIFAP, de Río Bravo,
Tamaulipas, México, se
designaron con las claves: C-6, G-2 y R-I,

1. Los aislados se resembraron en Agar Extracto de
   levadura manitol Rojo Congo (AELMRC) g/L:
   K2HPO4 0.5;
   MgSO4 0.2; NaCl 0.1;
   manitol 1.0; extracto de levadura 1.0; rojo congo 10.0 ml/L
   (de una solución 1;500); agar-agar 20.0; agua
   destilada 1000.0 ml; pH
   7.0

   Cuadro No. 1. Características de
   Rhizobium etli silvestre de este trabajo previo a su
   selección natural para tolerar
   pesticidas, infectivos y efectivos.

   Aislados (clave designada)	C-6	C-2	R-1
   No. de nódulo/planta	*27c	23c	40ª
   Altura de planta (cm)	23c	23c	30c
   Color de hojas	verde intenso	verde	Verde intenso

   *letras iguales son estadísticamente
   similares según Tujey (p<0.05). n=10.

2. Activación de aislados de R.
   etli

   En este ensayo
   se utilizaron tres pesticidas de uso común en
   Río Bravo, Tam. México, Diazinón
   (0,0-Dietil, 0-2, isopropil, 4-mentil pirimidil,
   6-fosforotionato) – Kevin (I – Naphyl –N-
   methycarbamato), c/pesticida se agregó al AELMRC en
   concentración de: 250, 300, 500 y 100
   ppm.

   Los aislados de R. etli se sembraron en
   matraz nefelométrico, se incubaron de 24 a 36 h, en
   agitación/200 rpm, paralelamente se observó:
   la forma, el color y
   el tamaño de as colonias en AELMRC al tolerar los
   pesticidas. La adaptación de R. etli a
   c/pesticida se logro por incremento gradual, que es una
   estrategia de selección natural de
   mutantes.

3. Selección de R. etli mutante
   resistente a pesticidas:
4. Prueba de infectividad y efectividad de los
   mutantes de R. etli resistentes a
   diazinón.

Los mutantes de R. etli adaptados al pesticida
que conservaron su capacidad de nodular y de fijar
biológicamente N2, se incubaron en semillas de
fríjol con el pesticida, previa desinfección, se
sembraron en jarras de Leonard (Vicent, 1975). La planta se
alimento con una solución mineral para vegetales.
Está se preparó de la siguiente manera: 1 molar de
K2HPO4, KH2PO4,
CaCl2, MgSO4, H2O,
trazas de FeSO4;1 ml de solución de elementos
menores en 1000 ml de agua destilada; pH 7 y se pasteurizó
(90°C/10min) en inverandero por 45 dias, para ello la planta
se saco completa de la jarra, y se determino el número de
nódulos efectivos en la raíz, así como el
peso fresco y seco de esos nódulos, incluso se
midió la altura de la planta. Estas variables-respuesta se usaron como
indicación de la conservación de la infectividad e
efectividad en el R. etli seleccionado por su
máxima tolerancia a
diazinon.

1.4 Evidencia de que R. etli coometabolizo el
diazinón en el medio de cultivo.

R. etli resistente se inoculó en matraz
con caldo extracto levadura manitol rojo congo (CELMRC) y el
pesticida, el matraz se coloco en agitación constante
300rpm hasta que alcanzar la fase estacionaria a las
30h.

Resultados y
discusión:

I.- Obtención de mutantes R. etli
resistentes a diazinon:

En este trabajo se aislaron mutantes de R. etli
resistentes a diazinón que mantuvieron su infectividad y
efectividad en el fríjol como se muestra en el
cuadro 2, lo que sugiere que la bacteria se adaptado al
pesticida, ya que este no causó perdida de los
plásmidos dependientes con la nodulación y
fijación biológica del N2 (Kantachote et
al., 2003).

Cuadro No. 2. Infectividad y efectividad de
Rhizobium etli tolerante a diazinón.

*Letras iguales sin diferencia estadística significativa (0<0.5)
según Tukey. n=20,

En el cuadro 3 se muestra que los mutantes de R.
etli resistentes a diazinón, produjeron un número
similar de colonias en AELMRC sin el pesticida, en donde no se
registró diferencia entre R. etli silvestre y su
mutante resistente a diazinón, lo cual apoya la
factibilidad de seleccionar Rhizobium a este tipo de
pesticidas (Smith et al., 2000).

Cuadro No. 3 Estabilidad de resistencia de
Rhizobium etli a diazinón

Unidades formadoras de colonias x102/ml
*AELMRC=Agar extracto levadura manitol rojo congo. *Letras
iguales sin diferencia significativa (<0.05) según
Tukey.

En el cuadro No. 4 se muestra que R. etli fue
tolerante a diazinón por su capacidad de adaptación
fisiológica al pesticida, lo que prueba que esta
resistencia de Rhizobium a diazinón, puede ser
usada para registrar su comportamiento
en el campo, en zonas agrícolas donde las leguminosas
tienen problema con los insectos-plagas de raíz y ello
limita su producción (Alexander, 1977; Das y Mukherjee,
2000).

Cuadro No. 4 Utilización de
diazinón como única fuente de carbono por
Rhizobium etli.

UFC (Unidades formadoras de colonias/ml). * Letras
iguales sin diferencia estadística significativa.
(<0.05) Según Tukey. * AELMRC.

Estos resultados muestran que el diazinón no se
usó como fuente de carbono, pero si se coometabolizo, pues
al suprimir el manitol y agregar solo diazinón, el
crecimiento de R. etli se inhibió. Además se
encontró que los mutantes de R. etli fueron
resistentes a diazinón, malathión y servin;
pesticidas aplicados en fríjol, para protegerlos del
ataque de insectos plaga y que no afectan su capacidad infectiva
y efectiva para FBN.

La concentración máxima a la cual la
bacteria fue resistente a los pesticidas, fue mayor a la aplica
en el campo, por lo que el tipo de R. etli mutante es
posible usarlo como inoculante en la producción de
fríjol sin ningún problema (Das y Mukherjee, 2000;
Kantachote, et al 2001).

Conclusión

Los resultados obtenidos indican que es posible
diseñar un medio de cultivo selectivo, con
diazinón, para recuperar R. etli de un suelo
agrícola no esteríl. Esto indica que es factible
resolver el problema de la aplicación de inoculantes a
base de Rhizobium etli con el uso obligado de pesticidas
en sitios, en donde aún no se aplica otra forma
biológica de combatir insectos-plaga.

Agradecimientos

Al Proyecto 2.7
(2005-2006) de la CIC-UMSNH por el apoyo a esta
publicación, a Jeanneth Caicedo Rengifo por la escritura.

Literatura
consultada

1.- Alexander, M. 1971. Biochemical ecology of
microorganisms. Ann. Rev. Microbiol 25:361-392

2.- Alexander, M. 1977. Introducción a la microbiología del suelo. AGT Ed.
pp:463-481.

3.- Claridge, C.A. and Schmitz, H. 1978. Microvial and
chemical transformations of some 12,13-Epoxytrichotec. App.
Environ. Microbiol. 36:63-67

4.- Ferguson, J. and Korte, K. 1977. Epoxidation of
aldrin to exo aldrin by soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol
34:7-13.

5.- Ruplal R. and Saxena, D.M., 1982. Accumulation
metabolism and effects of organochlorine insecticides on
microorganisms. Microbiol. Rev. 46:95-127.

6.- Das A.C. and Mukherjee D. 2000. Soil application of
insecticides influences microorganisms and plant nutrients. Appl
Soil Ecology 14:55-62.

7.-Kantachote D., Naidu, R., Singleton I., McClure N.
and Harch. B. D.. 2001. Resistance of microbial populations in
DDT-contaminated and uncontaminated soils. 16:85-90.

8.- Smith M. D, Hartnett D.C. and Rice C.W. 2000.
Effects of long-term fungicide applications on microbial
properties in tallgras prairie soil. Soil Biol. Biochem.
32:935-946.

9.- Sommerville L., Greaves, M.P., 1987. Pesticide
Effects on the Soil Microflora. Taylor and
Francis, London pp:240.

10.- Vincent, JM. 1975. Manual practico
de Rhizobiología. Ed Hemisferio Sur. Argentina.

De Luna E, Gustavo*.,

Peña-Cabriales, Juan Jose **

Sánchez-Yáñez, Juan Manuel.
***

*Microbiología Industrial y del Suelo. Facultad
de Ciencias
Biológicas. Universidad
Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L.
México. Apdo. Postal 414, San Nicolás de los Garza.
N. L, México, CP 64000. ** Microbiología Ambiental.
CINVESTAV-IPN. Unidad-Irapuato, Irapuato, Gto. México.
***Microbiología Ambiental. Ed. B-1. C.U. Instituto de
Investigaciones Químico Biológicas.
Universidad Michoacana de San Nicolás de
Hidalgo

autor correspondiente,

Morelia, Mich. CP 58030. México.