Aspectos microbiológicos de las producciones cerveceras (página 2)

    Microorganismos: se prefiere los que
no sean exigentes en  sus requerimientos nutricionales.
Deben poseer una elevada velocidad de crecimiento y
estabilidad genética en el medio y
condiciones establecidos. Deben biosintetizar (per se, o
tras manipulación genética) el producto deseado en
concentraciones adecuadas y, preferiblemente, excretarlo al
medio. La generalidad de los autores plantean que no deben ser
patógenos aunque, dada la naturaleza del producto de
elección, no se excluye esta posibilidad.

    Producto: se debe obtener en
concentraciones adecuadas y su recuperación, de acuerdo al
nivel de pureza requerido, ha de estar económicamente
justificado.

2-Elementos imprescindibles (no declarados): todo
proceso de fermentación, implica
crecimiento microbiano y biosíntesis celular. Para
que estos eventos tengan lugar se requiere
de energía y de carbono como mínimo.
Ambos elementos pueden estar comprendidos en el medio de cultivo
que incluya el sustrato a transformar en producto; pero no
necesariamente. Para resolver esta situación es necesario
retomar algunos aspectos que, por lo general,  se abordan al
estudiar lo concerniente a metabolismo y fisiología
microbiana.

Como se trata de algo harto conocido, nos limitaremos a
recordar que los microorganismos, acorde a la fuente que les
aporta energía, pueden ser: fotótrofos o
quimiótrofos, según  esa energía provenga de
una reacción fotoquímica o de oxidaciones
biológicas; mientras que la fuente de carbono necesaria para
su supervivencia los  divide en: autótrofos y
heterótrofos, según se trate de carbono inorgánico
u orgánico, respectivamente. Si se asumen, de conjunto, los
elementos fuente de energía y de carbono, obtendremos cuatro
posibles categorías de microorganismos: fotoautótrofos,
fotoheterótrofos, quimioautótrofos y
quimioheterótrofos.

Solo para los comprendidos en el cuarto grupo   la propia
fuente carbonada al oxidarse constituye la fuente de energía
necesaria para los procesos biosintéticos
celulares. En las restantes categorías existe divorcio entre ambas fuentes, aspecto a tener en
cuenta al diseñar el sistema pues, si no se
garantizan, no habrá fermentación,
biotecnológicamente hablando.

Además, tanto para el caso de los que obtienen su
energía por reacciones fotoquímicas, como los que lo
hacen mediante oxidaciones biológicas, es necesario la
existencia de sustancias que intervengan como donadores y
aceptores de electrones. Estos elementos hay que incorporarlos al
medio de cultivo, o crear las condiciones para que estén
presentes en el sistema, como es el caso de la aireación
para garantizar la participación del oxígeno como aceptor de
electrones en las fermentaciones en que participan
microorganismos respiratorios aeróbicos. En las
fermentaciones anaeróbicas es preciso incorporar al medio de
cultivo (fuente de sustrato) los compuestos oxigenados
inorgánicos que actúan como aceptores de electrones (en
bacterias anaerobias estrictas
o facultativas).

    Clasificación de los microorganismos
en relación con sus fuentes de energía y carbono.

Principales donadores y aceptores de electrones asociados a
los microorganismos según su fuente de carbono y
energía.

    En sentido general, los procesos
fermentativos desarrollados a escala industrial utilizan
microorganismos quimioheterótrofos, fundamentalmente
bacterias y hongos (entiéndase mohos y levaduras). Sin
embargo existen ejemplos de verdaderos procesos de
fermentación en los que, partiendo de residuos industriales,
se utilizan microorganismos fotoautótrofos para su
tratamiento y producción de biomasa. Un
ejemplo al respecto lo constituye el tratamiento de residuales,
ricos en nitratos, con microorganismos fotoheterótrofos
(microalgas o bacterias) en estanques acondicionados a tal fin.
De esta forma, además de resolverse los problemas que
engendrarían el vertimiento de estos residuales al entorno,
a la par que se elimina la carga de nitratos,  la 
biomasa microbiana producida puede ser utilizada como suplemento
nutricional animal.

Este tipo de sistema se caracteriza por lo económico del
producto obtenido. La energía la aporta la luz solar, los demás
elementos imprescindibles los aporta el residual y/o están
presentes en el microorganismo. A pesar de
ello, como ya se planteó, lo más común en los
sistemas fermentativos actuales
es el uso de microorganismos quimioheterótrofos; las
producciones cerveceras son un ejemplo típico.

3-Elementos acondicionadores: estos elementos, al igual
que los anteriores, no aparecen implícitos en la 
definición de fermentación. Una posible diferencia con
los mismos es que no se puede plantear que sean imprescindibles.
Sin embargo, poseen una influencia indiscutible en el desarrollo de la
fermentación. Dentro de esta categoría se incluye un
grupo de elementos entre los que destacan: temperatura, pH, viscosidad, presión osmótica,
humedad, por sólo enumerar algunos ejemplos.

    El crecimiento microbiano es un componente
esencial en todo proceso de fermentación. La influencia
particular de estos factores en el crecimiento es más que
evidente en  los cultivos no renovados o batch, donde
la relativa brevedad de la fase exponencial de crecimiento los
tiene entre sus causas. En la medida que nos aproximamos a
los valores óptimos para
cada elemento, y según el tipo de microorganismo, más
rápidamente se alcanzará la fase de crecimiento
exponencial y mayor será la biomasa obtenida, cantidad de
producto, etc. En tanto que mientras que  nos alejamos de
los valores óptimos sucede lo
contrario, e incluso puede inhibirse totalmente el
crecimiento.

     Una variante que permite un mayor
control de estos elementos, por
parte del investigador, es el cultivo continuo, donde el
suministro sucesivo de medio fresco, además de garantizar
nutrientes a las nuevas generaciones celulares, ejerce efecto
dilutivo que reduce la acción adversa de los
metabolitos tóxicos y permite que exista una transferencia
de calor y de oxígeno
más homogénea  en el sistema. Así, al igual
que existen diferentes sistemas de cultivo, también en el
caso de las fermentaciones pueden dividirse fermentaciones
batch o fermentaciones continuas en dependencia de como se
utilice el fermentador. La selección de una u otra
forma está en dependencia del tipo de producto que se
pretende obtener, su cantidad y concentración, su pureza y
los recursos con que se cuenta, entre
otros.

Tipos de
fermentaciones

    Resultan muy diversos los criterios para la
categorización o clasificación de las
fermentaciones.

    Según el tipo respiratorio del
microorganismo(o microorganismos) utilizado se dividen en
fermentaciones aeróbicas o anaeróbicas. Estas
últimas contemplan microorganismos que en el proceso
obtienen su energía por vía fermentativa o por respiración
anaerobia.

    Si se tiene en cuenta al sustrato, las
fermentaciones se clasifican en:

a)     Sumergidas (o en estado liquido) cuando el
sustrato tiene un alto contenido de humedad.

b)    Fermentaciones sólidas: cuando el
contenido acuoso del sustrato es eliminado y el proceso se
desarrolla con un  contenido de humedad comprendido entre el
30% y el 80%.

      Finalmente atendiendo a la
forma en que se utiliza el fermentador o reactor las
fermentaciones se clasificaran en:

a)   fermentaciones batch o discontinuas

b)   fermentaciones continuas

c)   fermentaciones semicontinuas

d)   fermentaciones fed-batch

·        
Fermentaciones batch

    Los procesos batch se
caracterizan por ser sistemas de cultivos cerrados que se
realizan en un volumen finito invariable en el
cual los sustratos se adicionan al inicio del cultivo y se
consumen durante el proceso para favorecer el crecimiento
microbiano como población.  El
producto deseado se recupera al final de la fermentación: a
partir del medio de cultivos, si se trata de un producto
excretado, o del citoplasma celular, como compuestos solubles o
agregados insolubles, cuando
se trata de productos retenidos en el
espacio periplásmico como ocurre en las fermentaciones
desarrolladas con bacterias gramnegativas.  En este
último caso es preciso fraccionar las células microbianas.
 Las cervezas corresponden al primer ejemplo, mediante
filtración se separa de las células (levaduras) y
partes sólidas del medio de cultivo.

Los procesos batch atraviesan por diferentes fases de
crecimiento (Fig. 1) en las que las características
fisiológicas de los microorganismos involucrados
también difieren. Así, al inicio de la fase
estacionaria (lag-de lagtency), la población
microbiana (inóculo) se adapta a las nuevas condiciones y
pone en marcha su mquinaria metabólica (metabolismo
endógeno) antes de crecer activamente. En esta fase se
produce un crecimiento como aumento celular pues, previo a la
división, ha de duplicar todos sus componentes celulares. Su
duración depende de factores como: edad de los cultivos
(mientras más frescos, menor dicha fase); medio de cultivo
(si donde se inocula es igual al de donde proviene, se reduce la
fase); tamaño del inóculo (se debe guardar la siguiente
relación 1:5, como máximo 1:10 al transferir el
inóculo al medio de destino; inferiores o mayores provocan
un incremento de la fase de latencia). La fase exponencial
(también conocida como logarítmica, o simplemente
log) es donde la velocidad de crecimiento (µ) es
máxima. Como durante el crecimiento se agotan nutrientes,
oxígeno (si son microorganismos aeróbicos) y se
acumulan en el medio metabolitos tóxicos de desecho y el pH,
por lo general baja a cifras que inhiben el crecimiento, todo
ello influye en que se transite a una nueva fase. La fase
estacionaria se caracteriza por no existir crecimiento como
población; más bien hay un equilibrio entre los que se
multiplican y los que mueren. Al ser un sistema cerrado, las
condiciones empeoran y dan lugar a la fase de declive o
mortalidad. Durante la misma, el número de microorganismos
vivos decrece de forma exponencial.

Los procesos batch conllevan a la acción no
controlada del medio externo, cambiante en cada estadío del
proceso. Una vez obtenido el producto deseado, es necesario
descargar el reactor o fermentador, lavarlo, esterilizarlo,
cargarlo, inocularlo con el cultivo deseado y esperar para una
nueva producción.

Todo ello implica un gran gasto de tiempo. No obstante, a pesar
de esta limitante,  toda una gama de productos se siguen
obteniendo por esta vía, incluso aquellos en los que se
utilizan microorganismos recombinantes.  Es la vía
más utilizada en la industria farmacéutica,
ya que permiten un adecuado control de la esterilidad al ser
sistemas cerrados. Esta variante se caracteriza por una baja
frecuencia de aparición de mutantes y la simplicidad del
proceso.

·        
Fermentación continua

    En los procesos continuos se
realizan con el objetivo de mantener una
concentración de sustrato constante y, por consiguiente,
mantener la población microbiana en fase de crecimiento
exponencial. Se utiliza en fermentaciones industriales que
requieren actividad metabólica máxima. Se trabajan a
volumen constante ya que hay un equilibrio entre el volumen del
medio añadido y el que fluye transformado por la acción
microbiana. Esta peculiaridad constituye una ventaja con respecto
a los procesos batch, pues a diferencia de estos, el
crecimiento no va a estar limitado por factores adversos como
agotamiento de nutrientes, acumulación de metabolitos
tóxicos, etc., simplemente el crecimiento está en
función de la
concentración de sustratos limitantes (factores
auxéticos), los cuales se suministran de forma continua al
reactor (Fig. 2). Regulando estos, se regula el crecimiento
microbiano (biomasa) y la síntesis del producto
deseado, sin que el medio ambiente ejerza un
efecto negativo.

Debe aclararse que, inicialmente, el reactor se carga y se
inocula con el cultivo, igual que un sistema discontinuo.
Mediante la medición de la densidad óptica se controla el
momento en que la población pasa a fase exponencial, y es a
partir de ese instante que se inicia la adición de medio
fresco acorde a la  velocidad específica de crecimiento
del microorganismo utilizado.

Estos procesos pueden desarrollarse como quimiostatos o como
turbidostatos. En un quimiostato la velocidad de flujo de medio
fresco (D) se mantiene a un valor determinado de manera
que la velocidad de crecimiento se ajuste a ella (µ=D; en
estos casos los microorganismos no se multiplican a su velocidad
máxima). En un turbidostato, el sistema incluye un
dispositivo óptico que regula la turbidez y obliga a la
población a multiplicarse a su velocidad máxima (D=
µ máxima).

Algunas de las ventajas de esta modalidad, con respecto a los
procesos batch son: 1) operan por períodos largos (tiempos
muertos bajos); 2) poseen costos de operación bajos;
3) el cultivo se mantiene con coeficiente de crecimiento
constante; 4) la generación de biomasa es constante y 5) el
volumen del reactor resulta reducido, en comparación a los
utilizados para alcanzar una productividad similar en procesos
batch.

A pesar de la productividad de estos sistemas su uso, como
método de producción,
ha chocado con varios
obstáculos:       1) alto
costo de los equipos y accesorios
(biosensores y   automatización
computarizada); 2) requieren de grandes reservorios para
garantizar el suministro continuado de medio de cultivo; 3)
 en muchos casos implica esterilización continuada,
separación sucesiva del producto para alcanzar los niveles
de purificación deseados; 4) se incrementa el riesgo de contaminación; 5) otro tanto
sucede con la aparición de mutantes y 6) la conversión
total de sustrato exige sistema multiniveles, inmovilización
celular o recirculación celular, todo lo cual encarece el
costo de operación.

A lo antes expuestos se puede añadir que los rangos de
velocidades adecuadas para la síntesis de proteínas heterólogas
(m < 0,15 h-1) obtenidas a partir de dichas
cepas,  constituyen otra limitante para su aplicación.
El no constituir sistemas cerrados dificulta el garantizar las
condiciones óptimas de esterilidad para el producto
terminado. 

En la actualidad se han planteado modificaciones para estos
sistemas que contemplan la "fijación" o "retención
celular"  (cultivos con células inmovilizadas) y la
remoción del medio de cultivo que contenga productos
inhibitorios y tóxicos. Estas  variantes, a pesar de su
éxito a escala de
laboratorio, ofrecen mayores
dificultades para la aplicación a escala industrial.

·        
Fermentaciones semicontinuas

     Constituyen variantes
intermedias entre las fermentaciones anteriormente analizadas. En
un primer momento el fermentador se trabaja como un proceso
batch, hasta que la población microbiana cae en una fase de
crecimiento retardado (final de la fase exponencial e inicio de
la estacionaria). Cuando esto ocurre se extrae un volumen dado
del medio transformado y se sustituye por uno equivalente de
medio fresco estérill (Fig. 3). Esto último, a la par
que sustituye los nutrientes ya agotados (fundamentalmente los
limitantes del crecimiento, o auxéticos) ejerce un efecto
dilutivo de los factores adversos presentes en la fase de
crecimiento retardado como son: metabolitos tóxicos,
condiciones de pH no idóneos, etc. Tras un corto lapso de
tiempo la población microbiana vuelve a transitar por la
fase de crecimiento exponencial.

Las operaciones de extracción de
medio agotado, y adición de volúmenes 
equivalentes de medio fresco, se pueden repetir tantas veces como
se precise. Esta variante, más simple desde el punto de
vista del equipamiento que los procesos continuos, aunque
también menos productivo, resulta en cierta forma más
ventajosa que los sistemas batch en cuanto al ahorro de tiempo (tiempo
muerto) que permite al no ser necesarias etapas como las de
descarga, lavado, esterilizado, carga e inoculación. Pese a
lo antes expuesto, la información sobre su
utilización industrial es muy pobre.

·        
Fermentaciones fed-batch

    Constituyen otra variante entre los
sistemas batch y los continuos. Sus raíces se
remontan a principios del pasado siglo. Los
productores de levadura en Alemania, para incrementar la
producción de biomasa, incorporaban lentamente el medio
utilizado a los cultivos. Esta adición en ocasiones tomaba
horas y se efectuaba en condiciones de aerobiosis, se le conoce
como "procesos Zulauf" y contó con una gran aceptación
en la industria de la levadura cervecera por propiciar un
sensible incremento de la biomasa sin acumulación de
cantidades significativas de etanol. Recientemente, estos
principios han sido retomados para dar lugar a lo que se conoce
como "batch extendido", "batch incrementado", o
procesos fed-batch. Como en los casos anteriores se parte
de una variante  batch, hasta que la población
microbiana entra en crecimiento exponencial. A partir de ese
momento  la fermentación se prolonga mediante la
adición constante, lineal o exponencial del medio
fresco.

Se diferencia de los procesos continuos y semicontinuos por el
hecho de que el fermentador no se carga con el volumen final de
trabajo. Se parte de un
volumen inicial de medio de cultivo al que se incorpora el
inóculo seleccionado. En estas condiciones tiene lugar la
fase de latencia y de crecimiento acelerado (fase previa a la
exponencial). Al culminar esta última y pasar la
población a fase exponencial, se inicia la adición de
medio fresco (Fig. 4). Los sustratos en el medio de cultivo
(fundamentalmente los factores de crecimiento) están en
exceso (teniendo en cuenta que sus concentraciones no sean
tóxicas) para garantizar: 1) la concentración del
sustrato limitante; 2) la velocidad específica de
crecimiento; la concentración de catabilitos. Otro tanto
sucede con el oxígeno. En esta variante no se extrae
ningún componente del fermentador. En estas condiciones se
logra alargar la fase exponencial de crecimiento, y cultivos de
alta densidad a través de tres estrategias en la adición
del medio de cultivo: 1) flujo constante; 2) flujo lineal y 3)
flujo exponencial. En todos los casos, si existe una buena
agitación, se asume que la velocidad específica de
crecimiento solo estará limitada por la concentración
del sustrato limitante del crecimiento. Los resultados
óptimos se obtienen cuando la velocidad de adición del
sustrato limitante resulta exponencial (opción 3).
 

Las técnicas fed-batch en
fermentación se han utilizado para la producción de
penicilina, vitaminas, aminoácidos y
enzimas. Para ello, los cultivos
a escala industrial han sido realizados en sistemas
fed-batch en los que la adición de sustrato ha estado
computarizada. La biomasa obtenida en estos procesos es superior
a la obtenida por fermentaciones batch, continuas o
semicontínuas. Sin embargo, entre las desventajas para la
utilización de esta variante a escala industrial se
encuentran el elevado costo del instrumental requerido para el
control del suministro adecuado de nutrientes y la
preparación del personal en general para
llevarlos a feliz término a ese nivel. Por ello, pese
a  los excelentes logros obtenidos con su aplicación en
S. cerevisiae, su generalización industrial
constituye un sueño no realizado.

Microorganismos que afectan las
producciones cerveceras

    Entre los microorganismos presentes en el
aire, agua y materias primas,
algunos se adaptan perfectamente a las condiciones existentes en
las cervecerías. Su crecimiento en la cebada y la malta,
antes y durante la fermentación, libera metabolitos que
afectan la estabilidad y cualidades organolépticas del
producto final, algunos incluso, se desarrollan en
éste.  No todos los microorganismos pueden establecerse
y convertirse en contaminantes, para ello es preciso vencer toda
una serie de obstáculos como:

1)     El mosto se hierve aproximadamente
2,5 horas

2)     El proceso de fermentación se
realiza a baja temperatura

3)     Los valores de pH en el mosto y la
cerveza son bajos

4)     El lúpulo posee componentes
con acción antiséptica, fundamentalmente sobre
grampositivos

5)     Durante la fermentación
prevalecen condiciones de anaerobiosis

6)     Hay presencia de etanol tanto en la
masa en fermentación como en la cerveza

7)     La cerveza por lo general se
pasteuriza

    Diversas especies de los géneros
Bacillus y Clostridium, por ser
endosporógenos, soportan tiempos de ebullición entre
2-2,5 horas, sin embargo, como en su mayoría son
grampositivos, resultan sensibles a los antisépticos del
lúpulo. Pese a las barreras que impone el proceso de
producción cervecero, diversos géneros bacterianos,
algunos mohos y levaduras salvajes, son capaces de vencerlas y
establecerse como contaminantes, afectando la calidad del producto final y/o
constituyendo un riesgo a la salud del consumidor. A continuación
se expondrán algunos géneros y especies bacterianos,
frecuentes contaminantes en estos procesos, y se detallarán
sus principales cualidades morfológicas, tintoriales y
fisiológicas.

       Género Lactobacillus:
Bastones largos grampositivos, microaerófilos,
asporógenos, catalasa negativa. Crecen entre 11 y 45
oC. Son tolerantes a los antisépticos
del  lúpulo. Por oxidación del etanol producen
ácido láctico y ácido fórmico. Provocan
agriado y turbidez sedosa de la cerveza.

    Género Achromobacter: Bastones
grampositivos, anaerobios facultativos, asporógenos,
catalasa positivos. Toleran los pH ácidos y los
antisépticos del lúpulo. Se destruyen a temperaturas de
60 0C en 5 minutos. Además de turbidez
provocan olor y sabor repugnantes.

    Género Pediococcus: Cocos
grampositivos, anaerobios, asporógenos, catalasa negativos.
Son tolerantes a los ácidos pero su pH óptimo oscila
entre 5 y 6. Producen ácido láctico y diacetilo.
Ocasionan agriado, turbidez  y viscosidad.  A las
contaminaciones por este género se les denomina "mal de la
sarcina".

    Género Acetobacter:
Bastones gramnegativos, aerobios, asporógenos, catalasa
positivos (excepto A. peroxidans). Crecen entre 5-40
oC. Son tolerantes a los antisépticos
del  lúpulo. La mayoría de las especies provocan
el agriado de la cerveza excepto A. capsulatum y A.
viscosum que ocasionan viscosidad y A. turbidans,
responsable de agriado y turbidez. Las especies responsables del
agriado oxidan el etanol a ácido acético y finalmente
a  dióxido de carbono y agua.

    Género Gluconobacter: Bastones
gramnegativos, aerobios, asporógenos, catalasa positivos. La
especie G. oxidans produce ácido acético a
partir de etanol. Algunas cepas son capaces de crecer en la
cerveza embotellada gracias al escaso contenido de aire del
cuello de las mismas y su crecimiento da la apariencia de sogas o
cuerdas.

     Género Zimomonas:
Bastones gramnegativos, anaerobios, asporógenos, catalasa
negativos. Tolerantes al alcohol (lo producen).
Provocan turbidez y sabores de fondo.

    Familia
Enterobacteriaceae: Todos sus géneros y especies se
presentan como bastones cortos gramnegativos, anaerobios
facultativos, asporógenos, catalasa positivos. Son sensibles
a pH iguales o menores a 4,2 y al etanol. Por lo general se
presentan como contaminantes del mosto y en las primeras etapas
de la fermentación. Las especies más reportadas son:
Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella
sp., Enterobacter  sp. y Obsobacterium
proteus. Este último es el más reportado. 
Provocan infección de la levadura y desarrollan olores y
sabores desagradables.

Levaduras salvajes

    Según Rainbow, se considera levaduras
salvajes "aquellas que no son deliberadamente utilizadas ó
no están bajo control" De esta forma se incluyen tanto las
perjudiciales como las inocuas sin efectos detectables.
Constituyen la parte más complicada del control
microbiológico, ya que se dificulta su diferenciación
de las  levaduras seleccionadas para el proceso como son:
Saccharomyces cerevisiae y S. carlsbergensis. Para
la diferenciación se han sugerido numerosas formulaciones de
medio de cultivo. Dentro del género de Saccharomyces,
la diferenciación de estirpes es prácticamente
imposible mediante técnicas de cultivo y solo los métodos inmunológicos
resultan precisos. En ocasiones el test de
esporulación resulta muy útil ya que las estirpes
cerveceras no son capaces de esporular a diferencia del resto
de  Saccharomyces.

      Algunas levaduras que han sido
identificadas como contaminantes cerveceros en diferentes
publicaciones incluyen los géneros: Brettanomyces,
Hnasenula, Candida, Kloeckera, Pichia
y Saccharomyces. De ellos Pichia, Hansenula
y la mayoría de las cepas de Candida son
aeróbicas lo que limita su capacidad contaminante a cervezas
almacenadas en presencia de aire. En estas condiciones crecen
rápido, formando películas superficiales y originando
sabores de fondo. Las especies de Brettanomyces, aunque
aeróbicas, producen grandes cantidades de ácido que
afectan el sabor de las cervezas. Dentro de las levaduras
salvajes,  las más importantes son algunas especies de
Saccharomyces como S. uvarum
 (también conocida como S.
carlsbergensis; por supuesto, en fábricas que utilicen
S. cerevisiae), S. diastaticus y S.
pastorianus.  Las mismas son responsables de exceso de
gas y turbidez; S. diastaticustambién provoca
atenuación. Las levaduras salvajes son capaces de crecer
durante la fermentación y en la cerveza acabada,
representando un problema especial en la alteración de la
cerveza acondicionada para barril.

Mohos

    Los mohos no constituyen contaminantes
directos de la cerveza, sí de la cebada, cereales aditivos y
la malta. Los metabolitos que se producen durante su crecimiento,
más adelante pueden ser fuentes de sabores desagradables de
fondo  y provocar la rápida evolución de dióxido
de carbono al disminuir la presión (gushing). 
La flora normal de la cebada incluye géneros como
Fusarium, Helminthosporium y Alternaria.
Durante el almacenaje, cuando la humedad es superior a 13,2%,
germinan las esporas y  se desarrollan Aspergillus y
Penicillium; todos, por lo ya explicado, constituyen
hongos imperfectos fáciles de identificar.

Principales puntos de
contaminación

1)     Materias primas

    Agua

    El agua utilizada en las
cervecerías debe ser microbiológicamente pura. Este
criterio se sustenta en dos resultados: determinación de
coliformes; conteo total de microorganismos. El primero acredita
que el agua está exenta de
contaminación fecal; el segundo que la carga microbiana
está dentro de los parámetros (inferior a
105 u.f.c/mL). Es común la presencia de
Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. y
Alcaligenes  sp. y coliformes de vida libre
(saprófitos) como Klebsiella, Enterobacter y
Hafnia. Estos saprófitos se diferencias de los
procedentes de la flora intestinal mediante siembra en caldo
MacConkey e incubación a 440 C; solo los
entéricos crecen y  producen gas. Estas bacterias constituyen
una fuente de contaminación en las cervecerías y pueden
desarrollarse rápidamente en el mosto (muy raras veces en la
cerveza ya que el pH es muy bajo y el contenido de etanol atentan
contra su multiplicación) y producir derivados
fenólicos y sulfurados que afectan el sabor final de la
cerveza.

    Cebada y malta

    Como ya se ha expresado, los mohos
constituyen flora normal de los cereales. Tras el almacenaje, si
no hay el debido control de la humedad (inferior al 13%) van a
ser contaminados por diversas especies de
Aspergillus y Penicillium.  Los
granos pierden su color característico. Estos
mohos producen diversas toxinas (micotoxinas) que, en otras
condiciones constituyen un riesgo a la salud sin embargo, los
estudios realizados demuestran que las mismas, al parecer, son
degradadas durante el proceso de producción y no constituyen
un riesgo a la salud aunque si pueden afectar la calidad del
producto final.

    Lúpulo

    El lúpulo posee componentes que
ejercen acción bacteriostática sobre bacterias
grampositivas. Sin embargo, cuando se almacena en lugares
húmedos se promueve el crecimiento de hongos y estos afectan
su acción antibacteriana ulterior.

    2) Mosto

    El mosto constituye un medio ideal para la
mayoría de las bacterias gramnegativas y algunas
grampositivas tolerantes a los antisépticos del lúpulo
por ello, nunca debe almacenarse a temperaturas por debajo de 55
0C por breve que sea el tiempo antes de
añadirle el inóculo de cultivo. Bacterias como
Lactobacillus delbrueckii, y otras
formadoras de endosporas, como son termófilas, pueden
contaminar el mosto, multiplicarse rápidamente a
temperaturas entre 50-650C y provocar acidez.
Otras bacterias, como las mencionadas dentro de la familia
Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen
derivados sulfurados  y  fenólicos que afectan el
sabor final de la cerveza.

    3) Fermentación

Con la inoculación, si  no se utiliza un cultivo
puro, se incorporan al mosto toda una gama de levaduras salvajes
y bacterias. Entre estas últimas merece especial atención
Obesumbacterium proteus. Se introduce al ámbito
cervecero a través del agua y, con gran rapidez se adapta a
las condiciones de la fábrica aspecto que le permite
presentarse junto a las levaduras que se utilizan por segunda o
tercera vez. Crece en los primeros estadíos de la
fermentación hasta que los descensos de pH y la
elevación en la concentración de etanol le resultan
adversos ya a las 24-36 horas de realizado el inóculo. Al
incrementarse su concentración retarda el proceso de
fermentación al elevar el pH de la cerveza. Afecta
además su sabor al producir compuestos sulfurados. Otra
especie, Enterococcus agglomerans, tiene un comportamiento similar. Las
enterobacterias y otras gramnegativas, se inhiben
rápidamente durante la fermentación. A no ser que ya
existiera un crecimiento abundante antes de la inoculación,
su efecto es pequeño en la cerveza. En los procesos en los
que se recupera  la levadura de la superficie O.
proteus constituye un problema al unirse a éstas, no
sucede igual con las otras gramnegativas.

    Acetobacter  y
Gluconobacter, aunque pueden aislarse en esta etapa, su
crecimiento se ve afectado por las condiciones de anaerobiosis.
Lactobacillus y Pediococcus, también asiladas
durante esta etapa, han de competir con la levadura, ésta,
en mayor concentración. El diacetilo que producen (0,1
g/L)  es reducido por las levaduras a butano-2-3-diol que,
para que afecte el sabor debe aparecer en concentraciones de 500
mg/L.

    La levadura cervecera, para
que cumpla su rol, ha de estar pura. Este estado ideal no siempre
se pierde por contaminación con levaduras salvajes, la
propia levadura cervecera puede perder sus cualidades debido a la
aparición de mutantes. Esto constituye un problema pues las
mismas pueden estar mejor  adaptadas (crecer mejor) pero
perder sus cualidades fermentativas. Estas mutaciones pueden
aparecer de forma espontanea o ser inducidas.  La
parición de cepas salvajes pueden tener su origen en ls
materias primas, el aire, la propia planta cervecera. Como el
sustrato es el mismo, compiten con la levadura cervecera y
superarla. Algunas son muy pequeñas y dificultan la
filtración, otras pueden secretar exoenzimas que afectan la
atenuación, o producen ésteres y compuestos
fenólicos que alteran el sabor.

    4) Almacenaje

    Previo al embotellamiento, o cuando
ya éste se ha efectuado pero existieron errores de
filtración o pasteurización, puede producirse
contaminación. El número de bacterias que pueden
constituir problema a este nivel es reducido debido a: el bajo
pH; la presencia de etanol; la ausencia de carbohidratos fermentables y
las condiciones de anaerobiosis. Sin embargo, las bacterias
ácidolácticas como L. Brevis y P.
damnosus pueden lograrlo. Su mayor afectación es al
sabor ya que la producción de diacetilo, al no haber
levaduras en suspensión, no puede ser reducida y confiere un
sabor a mantequilla. Las bacterias acéticas, debido a la
anaerobiosis, no causan por lo general problemas en esta etapa,
sin embargo, G. oxidans, con el escaso aire presente en el
cuello de las botellas, crece, produce ácido acético y
altera el aspecto del producto  (crecimiento con apariencia
de cuerdas).

Otros contaminantes a este nivel pueden ser las levaduras
salvajes que forman películas superficiales, provocan
turbidez y producen ésteres que afectan el sabor.

5) Otras

Aunque lo referido abarca los principales puntos de
contaminación, el producto terminado está expuesto a
otros agentes ya fuera de la fábrica. Por supuesto, no
pretendemos analizar el caso de los populares "termos" ya que
cada  uno sería fuente suficiente para un extenso
cepario, sin embargo, en los países donde se expende la
cerveza en barriles o en toneles, se ha podido constatar la
presencia de levaduras salvajes, no coincidentes con las
detectadas en la fábrica de origen, bacterias acéticas
y otras. Aunque su nivel, por lo general, no es lo
suficientemente alto para afectar el producto, este daño tampoco tiene lugar
debido al rápido consumo que se hace de estas
cervezas, cualquier retardo conllevaría a las afectaciones
ya descritas. Esta contaminaciones hablan en detrimento de la
limpieza de los contenedores utilizados, en los que, poco a poco,
se van estableciendo estos contaminantes.

Aislamiento e
identificación

El secreto de cualquier aislamiento radica en: 1) una adecuada
toma de muestra y 2) saber qué se
desea aislar. Sin estos precedentes la cosa se convierte en la
famosa aguja del pajar. Los procedimientos generales de
aislamiento se realizan a partir de: a) muestras líquidas,
b) muestras sólidas.  A partir de ellas se buscan, por
lo general, dos cosas: microorganismos totales; microorganismos
muy particulares, en este caso los que afectan al producto o al
consumidor. Tanto una elevada carga microbiana como los segundos
constituyen razones de decomiso del producto, aspectos que
están debidamente
normados[2],[3],[4],[5],[6].

Para el aislamiento a partir de muestras líquidas se
toman asépticamente volúmenes de estos (generalmente 1
mL) y se le hacen diluciones decimales en solución salina
estéril a partir de las que se hacen las siembras (0.1 mL)
en placas Petri con medio para conteo de microorganismos totales
y en particular (posteriormente se sugerirán algunos de los
más utilizados). Si las muestras involucran productos ya
pasteurizados, se deben filtrar por membranas que retienen
células y estas membranas se presionan sobre la placa para
depositar las posibles células microbianas.

Si se trata de muestras sólidas (cebada, por ejemplo) se
toman 10 g y se agitan en 90 mL de solución salina, luego
ésta se trata igual que las muestras líquidas. En el
caso de las superficies (paredes de tanques, locales, etc.) se
utilizan hisopos de algodón que se frotan
sobre una superficie de 0,5 m2. Estos hisopos se
pueden descargar en solución salina estéril para
procesar como se ha mencionado, o simplemente hacer siembras
directas con ellos sobre placas con medios selectivos.

En todos los casos, las incubaciones de los medios se hacen
entre 25-300C, la segunda para bacterias y la
primera para levaduras y mohos. Aunque en el resto de los
laboratorios que donde se trabajan alimentos, los aislamientos de
bacterias se incuban a 350C, en el caso particular
de las cervezas, dadas las características de su
producción, se aplican temperaturas más bajas con la
finalidad de garantizar la temperatura óptima a los posible
contaminantes.

Con respecto a los medios de cultivo utilizados es necesario,
como ya se aclaró, tener en cuenta cual es el objetivo
perseguido. Para bacterias, si lo que se desea es conteo total,
el Agar Nutriente suplementado con actidione (20-100 µg/mL)
para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos, resulta
adecuado. Las determinaciones de enterobacterias, incluyendo
O. proteus, se realizan mediante Agar MacConkey; las
bacterias acéticas se aíslan bien en Agar Extracto de
Malta suplementado con Extracto de Levadura y con el pH ajustado
a 4. Como la acidez inhibe la solidificación del agar, es
preciso incrementar el porciento de éste en dichos medios
(2% o más, según el tipo de agar). Para Z.
movilis es preciso incubar en anaerobiosis. Para las
bacterias ácido lácticas los medios más efectivos
son el Agar M.R.S. (Man, Rogosa y Sharpe) y el Agar WLN
(Wallenstein Laboratories Nutrient) que contemplan dos fuentes
carbonadas (glucosa y maltosa) para esta
bacterias tan exigentes, cuando de aislamiento se trata. Las
placas se deben de incubar entre 25-300C. Para la
precisión de algunos géneros de interés, a partir de los
aislamientos se efectúan tinciones de Gram, de endosporas y
algunas pruebas bioquímicas como
las sugeridas en el cuadro (Contaminantes bacterianos frecuentes
en las producciones cerveceras).

Para levaduras se utiliza el Agar Extracto de Malta
suplementado con actidione (20 µg/mL) que inhibe el
crecimiento de la levadura cervecera y posibilita el de las
levaduras salvajes. Otra variante más exacta consiste en
utilizar dos medios en paralelo: uno con L-lisina como única
fuente de nitrógeno y otro con cristal violeta. En el
primero crecen todas las levaduras salvajes excepto las del
género Saccharomyces, que si son aisladas en el
segundo. Todas las placas se incuban a 250C. Por
lo general, la presencia de levaduras salvajes, su número,
resulta suficiente. Si se desea precisar géneros o especies
es necesario realizar estudios más complejos sobre su
morfología y
fisiología; en algunos casos, solo el empleo de inmunosueros para
determinados antígenos superficiales
posibilitan tal clasificación.

Los mohos se aíslan Agar Sabouraud Dextrosa o Agar
Extracto de Malta suplementados con penicilina o estreptomicina
para inhibir el crecimiento bacteriano. Los
cultivos se incuban a 250C.

Contaminantes bacterianos frecuentes en las producciones
cerveceras

Leyenda: += > 90% de las cepas son positivas al ensayo; -= < del 10% de las
cepas son positivas

              
+/-= 11-89% de las cepas son
positivas          

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Autor:

Dr.Sc. Guillermo Barreto Argilagos

Centro de Estudio para el Desarrollo de la Producción
Animal (CEDEPA)

Universidad de Camagüey

[1] Este problema, que afectaba la calidad
de los prestigiosos vinos franceses,  fue lo que dio pie
a las investigaciones realizadas
por Pasteur.

[2]  Instituto Panamericano de
Protección de Alimentos y Zoonosis (INPPAZ). 
Contaminación microbiana de los alimentos vendidos en la
vía publica en ciudades de América Latina y las
características socioeconómicas de sus vendedores y
consumidores. ISBN  3220. 92 75. 1996 15-19.

[3] NC ISO 9000:2000

[4] Harding Albert, Xiomara M: Seminario sobre normalización y
calidad a la dirección de la
Unión Agropecuaria Militar. DNMCC. Modulo de Calidad.
Diplomado de Gerencia
Empresarial.  2003-04.

[5] Normas cubanas aprobadas en
las Resolución 30-2000, dada en Ciudad de La Habana a
los 19 días del mes de abril del 2000.

[6] NC 38-02-08:87 Sistema de Normas
sanitarias de Alimentos. Contaminantes
microbiológicos