Producción de etanol por Zymomonas spp (página 2)

Material y
métodos

Origen de las
Zymomonas spp.

Muestras de jugos
naturales frutos vegetales se colectaron en frasco estéril
de 50 ml, transportadas en hielo al laboratorio
para su procesamiento.

Detección de Zymomonas
spp.

Se realizó
en tubos en CELMG o caldo extracto de levadura g/L: 3g, extracto
de malta 3, peptona de caseina 5, glucosa 20;
100 ppm de cicloheximida y 3% de etanol, a un de pH 5.0
ajustado con ácido láctico, c/tubo con un Durham
invertido. Los tubos se incubaron a 30°C/24 a-48 h, la
presencia de Zymomonas se detectó por producción de gas y la morfología
típica: diplobacilos cortos Gram Negativos. Este etapa se
repitió para su aislamiento en cultivo
axénico.

Aislamiento de
Zymomonas spp.

Los tubos
positivos en la etapa anterior, se sembraron en cajas de Patri
con agar (1.5%) y ELMG incubadas a 30°C/24-48h. Se
seleccionaron aquellas colonias típicas de
Zymomonas y por resiembra en el ELMG sin etanol en placa,
así se obtuvieron los cultivos axénicos
(5,20).

Identificación de los
aislados.

Se uso el Manual de
Bacteriología Determinativa de Bergey’s novena
edición
del 2000 (1). Con base en las pruebas para
la identificación de Zymomonas sp se incluyo la
cepa de colección Z. mobilis ATCC 10988 como
patrón de referencia y comparación (3).

Conservación de los aislados.

Los aislados al
igual que la cepa de colección de Zymomonas, se
resembraron mensualmente en agar ELMG, sin etanol con
cicloheximida y conservaron a 10°C en refrigeración.

Producción de
etanol.

Para comprobar la
capacidad de síntiesis de etanol de los aislados de
Zymomonas, se siguió el siguiente protocolo:
Fermentación. Los aislado se activaron en CELMG sin
etanol y cicloheximida, se incubaron a 30°C/24-48h,
posteriormente se tomó una asada de c/u para sembrar un
matraz de 500 ml con 250 ml de CELMG, el cual se incubo a
30°C, a 100 rpm en agitador rotatorio/24-48h, de esté
se sembró otro matraz con CELMG para la síntesis
de etanol. Producción de etanol. Cada
aislado activado en CELMP, se uso el 5% (v/v) de i para un matraz
de 250ml. con 150ml. de medio de producción de etanol g/L:
KH2PO4 2, extracto de levadura 10 y 10, 30,
50, 100 y 150. de glucosa en agua destilada
a pH 5.0 ajustado con ácido láctico, las sales se
agregaron después de esterilizar la base (17-21), cada
aislado se sembró por triplicado, en condición
estática y en agitación a 100 rpm a
30°C por 120 h se tomaron 5ml cada 24 h. en tubos con
tapón de rosca para medir: Cuantificación de
etanol. La muestra de la
fermentación se congelaron hasta la
medición de etanol, se centrifugaron a 3000
rpm/20 min a baja temperatura,
el sobrenadante transferido a viales, para posteriormente medir
concentración de etanol por cromatografía de gases Beckman
Mod. GC 72-5, con detector de ionización de flama,
nitrógeno como gas acarreador y columna de acero inoxidable
de 6 pies de largo y 1/8 de pulgada de diámetro empacada
con Porapak Q en análisis cromatográficos, se
utilizaron las siguientes condiciones (10,13). Flujo de
Nitrógeno 40 c.c./min., flujo de Hidrógeno 40 c.c./min., flujo de aire 230
c.c./min., temperatura de Columna 180 °C., temperatura de
Inyector 170°C., temperatura de Detector 160°C., detector
de ionización de flama, atenuación de Registro 0.8,
velocidad de
la Carta 0.1
pulg/min., volumen inyectado
1.0 microlitro.

Medición de
crecimiento. Cada aislado se midio la turbidez (D.O.) a 600nm
(2,4,5) en un espectrofotómetro Coleman Junior II, cada 24
h durante la fermentación.

Azúcares
totales. La muestra utilizada para la cuantificación de
etanol, también se emplearon para determinar
azúcares totales en el medio de cultivo, por el método de
la Antrona con una curva de calibración con
estándares de glucosa (3).

Producción de etanol por
Zymomonas

Resultados y
discusión.

A partir de
aguamiel de maguey, de caña de azúcar,
de pulque, y de jugo de uva, se recuperaron 15 aislados de
Zymomonas spp como se muestra en el cuadro 1, en donde se
comprueba que este el género es
cosmopolita y relativamente fácil de encontrar en la
naturaleza,
según se reporta en la literatura (1-4). En
referencia a las pruebas bioquímicas de los aislados
silvestres en comparación con la cepa de colección
Z. mobilis ATCC 10988 de acuerdo con Bergey’s del
2000 (1), tuvieron morfología celular similar a la cepa de
referencia: fueron diplobacilos Gram Negativos, móviles a
excepción el aislado R4, mientras que los aislados
silvestres respondieron negativamente a la síntesis de:
oxidasa, la ureasa, la gelatinasa, el indol y la reducción
nitratos, pero si liberaron catalasa y todos fermentaron la
glucosa.

La cepa ATCC 10988
y el aislado denominado Zymomonas sp U I, fueron positivas
al ácido sulfhídrico y la producción de gas
de glucosa, a la fermentaron de fructosa y sacarosa con
generación etanol, en donde la cepa ATCC 10988
creció mejor que los aislados en el medio de cultivo con
diferente concentración de glucosa (11-14), aunque solo el
aislado U I, genero
etanol.

Los 15 aislados
silvestres de Zymomonas fueron clasificados como Z.
mobilis ya que fermentaron la glucosa a diferente
concentración de 10, 30, 50, 100 y 150g/L, pero con una
mínima liberación de etanol en comparación
con la cepa Z. mobilis ATCC 10988 tanto en
condición estática como en agitación a 100
rpm, mientras que la ATCC10988 con un nivel de glucosa de 10, 30,
50, 150g/L libero etanol hasta 104g/L de manera similar en
agitación y como en condición estática,
debido a lo anterior se selecciono a Z. mobilis U I aunque
sintetiza levano (1) .

El cuadro 3
muestra el análisis comparativo del máximo
rendimiento celular, entre la Z. mobilis silvestre UI de
0.17 en agitación a 0.15 estática en 10g/L de
glucosa, mientras que para la ATCC 10988 fue de 0.36 y 0.69 en
agitación con 10 y 150g/L de glucosa en el medio de
cultivo (19-21).

Por otro lado se
observo que la mayoría de los aislados silvestres producen
levano, actualmente se analiza la capacidad que tienen y el
potencial para su posible explotación.

Conclusiones

Los resultados de
ambos cuadros 1 y 2 demuestran que si bien es posible recuperar
Z.mobilis de jugos naturales la selección
para la producción de etanol es un trabajo de
tiempo, si se
desea que esa capacidad sea natural, dado el contraste entre lo
que libera la cepa de colección de la silvestre, pues con
el avance de la ingeniería genética
es posible seleccionar una Zymomonas spp mejor que la
típica Saccharomyces spp, para la producción
masiva de etanol que ayude a minimizar el impacto de la
disminución combustibles del petróleo.

Cuadro 1.
Origen de los aislados de Zymomonas mobilis productoras de
levanoa etanolb y/o de algunas regiones de
México.

*jugo o mosto en
fermentación, **noreste, ***centro occidente,
nororiente+++, +Costa noreste, ++centro de
México.

Cuadro 2.
Análisis comparativo de la producción de etanol por

Zymomonas mobilis** de
colección y un aislado de jugos de frutos vegetales de
algunas regiones de México.

**Condiciones de
fermentación: Inóculo 5%, agitación 100
rpm

30°C, pH
5.0

Cuadro 3.
Análisis comparativo del rendimiento de producción
celular (Y=p/s) entre Zymomonas mobilis* de
colección y un aislado silvestre de jugos naturales de
vegetales de algunas regiones de México.

*condicione
similares en agitación al cuadro 2.

Agradecimientos a Jeanneth Caicedo
Rengifo por su trabajo secretarial,

al proyecto 2.7 de
la CIC-UMSNH 2005-2006 por las facilidades para su
publicación.

Literatura citada

2. Buchanan R.E. & N.E.
   Gibbons2000. Bergey’s Manual of Determinative
   Bacteriology. Nine edition: The Williams & Wilkins
   Company/Baltimore, USA: 200-205, 289.

3. Chan-Lin Chang, Ceng-Shung Gong,
   Li-Fu Chen & George T.Tsao. 1981. D-Xylulose Fermentation
   to Ethanol by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ.
   Microbiol. 42: 284 – 289.

4. Dimler R.J., W.C. Shasfer, O.S.
   Wise & C.E. Rist. 1952. Method of Antrona. Anal. Chem.
   124 :1411 .

5. Montenecourt, B. S., in
   Biology of Industrial Organisms (eds Demain, A. L. and
   Soloman, N. A.), Benjamin–Cummings Publishing Co.,
   California, 1985, pp. 261–189.

6. Parker, C., Barnell, W. O.,
   Snoep, J. L., Ingram, L. O. and Conway, T., Mol.
   Microbiol., 1995, 15, 795–802.

7. Scopes, R. K. and
   Griffiths-Smith, Biotechnol. Lett., 1986, 8,
   653–656.

8. Barrow, K. D., Collins, J. G.,
   Leigh, D. A., Rogers, P. L. and Warr, R. G., Appl.
   Microbiol. Biotechnol., 1984, 20, 225–232.

9. Dawes, E. A., Ribbons, D. W. and
   Large, P. J., Biochem. J., 1966, 98,
   795–803.

10. Wills, C., Kratofil, P., Londo,
    D. and Martin, T., Arch. Biochem. Biophys., 1981, 210,
    775–785.

11. Algar, E. M. and Scopes, R. K.,
    J. Bacteriol., 1985, 2, 275–287.

12. Buchholz, S. E., Dooley, M. M.
    and Eveleigh, D. E., Trends. Biotechnol., 1987, 5,
    199–204.

13. Pankova, L. M., Shvinka, Y. E.,
    Beker, M. E. and Salva, E. E., Microbiologia, 1985,
    54, 141–145.

14. Viikari, L. and Korhola, M.,
    Appl. Microbiol. Biotechnol., 1986, 24,
    471–476.

15. Wecker, M. S. A. and Zall, R. R.,
    Appl. Microbiol. Biotechnol., 1987, 53,
    2815–2820.

16. Pond, J. L., Eddy, C. K., Mac
    Kenzie, K. F., Conway, T., Borecky, D. J. and Ingram, L. O.,
    J. Bacteriol., 1989, 171, 767–774.

17. Michel, G. P. F. and Baratti, J.,
    J. Gen. Microbiol., 1989, 135, 453–460.

18. Mortatte, M. P. L., Sato, H. H.
    and Park, Y. K., Biotechnol. Lett., 1983, 5,
    518–526.

19. Viikari, L. and Linko, M.,
    Biotechnol. Lett., 1986, 8, 139–144.

20. Lyness, E. W. and Doelle, H. W.,
    Biotechnol. Lett., 1983, 5, 345–350.

21. Liegh, D., Scopes, R. K. and
    Rogers, P. L., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1985, 20,
    413–415.
22. O’Mullen, P.,
    Szakacs-Dobogi, M. and Eveliegh, D. E., Biotech. Lett.,
    1991, 13, 137–142

Gallegos, Morales
Gabriel

Depto de Parasitología.,
Universidad
Autónoma Agraria Antonio Navarro. Buena Vista, Coah,
México.

Murillo Martínez Maria
Elvira

Microbiología Industrial y
del Suelo, Facultad
de Ciencias
Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo
León, San Nicolás de los Garza, N. L.
México.

Sánchez-Yáñez Juan
Manuel.

Microbiología
Ambiental,

(autor correspondiente

Instituto de Investigaciones
Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich,
México