Patrón Cry insecticida y patogenicidad de cepas nativas de Bacillus thuringiensis hacia larvas de Heliothis virescens y Drosophila melanogaster

1. Resumen
3. Materiales y
   Métodos
4. Resultados y
   Discusión
5. Conclusiones
6. Referencias
   Bibliográficas

Resumen

Bacillus thuringiensis (Bt) es el organismo
entomopatógeno más utilizado para el control de
insectos plaga. A las proteínas
del cristal paraesporal, característica distintiva de esta
especie, se les denomina Cry y se encuentran altamente
relacionadas entre sí.

En este trabajo 16
cepas de Bt fueron caracterizadas por el patrón Cry
insecticida mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida
(SDS-PAGE). La mayoría de las cepas analizadas presentaron
dos bandas proteicas que migraron a la misma altura que las
proteínas Cry1 y Cry2 de la cepa estándar HD-1; dos
cepas tuvieron un patrón idéntico al de Bt var.
israelensis y dos presentaron una proteína de muy
bajo peso molecular.

Los bioensayos contra larvas de Heliothis
virescens evidenciaron un control sobre el insecto pero fue
solamente la cepa LBT-111 quien logró una mayor mortalidad
en el menor tiempo y a la
menor concentración. El análisis Probit de esta cepa dió
como resultado que la CL50 fue de 2.3 x
107esporas / ml al segundo día de montado el
ensayo.

Los resultados obtenidos frente a Drosophila
melanogaster mostraron como la cepa LBT-87 provocó no
solo una mortalidad de las larvas en más de un 50 %, sino
que las que lograron sobrevivir y formar pupas nunca llegaron a
la fase de adulto.

Introducción

Bacillus thuringiensis es una bacteria
ampliamente conocida por su actividad insecticida hacia diversos
grupos de
insectos. Simultáneamente a la esporulación, forma
un cuerpo paraesporal a partir de proteínas denominadas
Cry, las cuales, una vez solubilizadas y activadas
proteolíticamente en el insecto, ejercen su efecto
insecticida. Los productos
bioinsecticidas a base de Bt se formulan para controlar plagas
agrícolas del orden Lepidoptera y algunas pocas especies
de la familia
Chrysomelidae (Coleoptera), además de plagas de
importancia médica del orden Diptera (Glare y O’
Callaghan, 2001; Bullé, 2002).

En el país, esta bacteria se ha utilizado en el
control de Heliothis virescens (Jiménez, 1995)
insecto que causa graves daños en el tabaco, cultivo
que constituye un importante rubro económico de reconocido
prestigio internacional. Una de las características de
esta plaga es que puede crear resistencia hacia
los insecticidas de Bacillus thuringiensis (Granero et
al, 1996), por lo que es conveniente contar con alternativas
de cepas ante problemas de
insecto resistencia.

En 1977 fue descubierta una nueva serovariedad de esta
bacteria que tenía efecto larvicida sobre especies de
mosquitos y moscas negras, a la cual le llamaron subespecie
israelensis (Goldber y Margalit., 1977). De acuerdo a
numerosos estudios y reportes esta variedad ha resultado muy
activa contra larvas de mosquitos (72 especies) y moscas negras
(22 especies) (Maldonado-Blanco, 2005) resultando efectiva contra
dípteros vectores de
enfermedades
humanas (malaria, dengue, fiebre amarilla,
filariasis) (Nester et al., 2002).

Basados en la posibilidad de encontrar microorganismos
mejor adaptados al trópico que los microorganismos
foráneos y con un amplio espectro de acción,
se planteó como objetivo del
presente trabajo, el de evaluar y seleccionar cepas nativas de
Bacillus thuringiensis que presenten actividad insecticida
contra los insectos Heliothis virescens, que es uno de los
más importantes defoliadores del cultivo del tabaco, y la
"mosca de la fruta", Drosophila melanogaster, insecto
extremadamente prolífero y contaminante.

Materiales y Métodos

I. Material Biológico: 16 cepas de
Bacillus thuringiensis pertenecientes a la
colección del laboratorio de
bacterias
entomopatógenas del INISAV.

Cepas estándar de Bacillus thuringiensis:
HD-1 y Bacillus thuringiensis var. israelensis
(Bti).

Tabla 1. Cepas de Bt pertenecientes a la
colección del laboratorio de bacterias
entomopatógenas del INISAV.

II. Determinación del patrón de
proteínas Cry por electroforesis en geles de
poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio
(SDS-PAGE).

Para la reproducción de las cepas se utilizaron
frascos erlenmeyers de 500ml con 50ml de medio LB, (Luria
Bertani), a los que se les añadió un disco de papel
de filtro impregnado de células de
la cepa en estudio. Los cultivos fueron agitados en una zaranda
orbital hasta esporulación total. La presencia del cristal
(proteína Cry) se determinó cualitativamente por
observación al Microscopio
Óptico 1000 X con objetivo de inmersión, mediante
tinción simple con violeta cristal 0.5 %.

Para la determinación de proteínas Cry se
tomó un volumen de 1.5ml
de un cultivo completamente cristalífero y se
centrifugó a 10 000 r.min-1 durante cinco
minutos en centrífuga Eppendorf 5415C, el pellet fue
lavado dos veces con 1mL de NaCL 1M y tres veces con 1ml de
agua destilada
esterilizada (Bravo et al., 1998), y finalmente
resuspendido en 100μl de agua destilada y buffer
de lisis 2X, la muestra fue
calentada durante seis minutos a 100° C, se tomaron
15μl de la muestra para realizar la SDS-PAGE
10%.

La electroforesis analítica de proteínas
se realizó en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes, según el procedimiento
descrito por Laemmli (1970).

III Determinación de la actividad
biológica frente a Heliothis
virescens.

Obtención y cría de larvas de
Heliothis virescens.

Se partió de colectas de larvas en campos
cultivados de tabaco, libres de productos químicos y
biológicos y llevadas al laboratorio de Biología del INISAV
donde se estableció la cría de los insectos
según metodología descrita por Piedra,
1980.