Dos Hongos Antagónicos (Trichoderma harzianum y Trichoderma viride) (página 2)

METODOLOGÍA

El trabajo
comprendió dos fases: la Fase de campo; se realizó
en una parcela del INIEA en el anexo Campo Verde del Km.44
(carretera Pucallpa – Lima). A una altitud de 270 msnm. Y
la Fase de laboratorio; se llevó acabo en el
laboratorio de
Fitopatología de la Universidad
Nacional de Ucayali. El trabajo se
realizó entre los meses de diciembre 2004 a octubre del
2005. Para la evaluación
se seleccionó el clon paund 7 y los tratamientos se
distribuyeron en cuatro bloques y tres Tratamientos por bloque y
cada tratamiento con nueve plantas; los
tratamientos son los siguientes: Tratamiento 0 (T0); Testigo (sin
inoculación de hongos
antagónicos.), Tratamiento 1 (T1): Inoculación con
Trichoderma harzianum. (Tha), Tratamiento 2 (T2):
Inoculación con Trichoderma viride.
(Tvi)

Características
climáticas y edáficas de los sectores
considerados para el estudio.

El lugar donde se ejecutó el trabajo de tesis
pertenece al ecosistema
mayor de Bosque Tropical semi siempre verde estacional (Cochrane,
1 982); La temperatura
máxima promedio anual es de 31°C, la mínima de
19,3°C y la media de 25,2°C; la precipitación
pluvial es de 1 560 mm/año; la humedad relativa es de
83,8%; la radiación
solar oscila entre 4 – 7 horas de sol diaria y los vientos
predominan del Norte a Sur con una velocidad de
1,7 m/s. (promedio de 16 años, de la Estación
Meteorológica de la UNU), que incluye un periodo seco y
otro lluvioso.

El terreno del área experimental está
conformado por una terraza ligeramente ondulado, muestra un
color pardo
rojizo, ácidos
(pH 4.5), altos
en Al cambiables y bajos en NPK y materia
orgánica, son descritos en términos de
taxonómia de suelos como
inseptisol, siendo su principal características la baja
fertilidad natural y es medianamente drenado hasta los 20 cm. de
profundidad.

Variables evaluadas. Al inicio se efectuó
una evaluación de la incidencia y severidad, para
determinar en que condición se encontraba el campo, luego
de esta evaluación se eliminó los frutos enfermos
con M. roreri, esto con la finalidad de comparar entre los
tratamientos el progreso de la enfermedad. La evaluación
del porcentaje de incidencia se realizó a los 60
días después de haber realizado la primera
evaluación, continuándose cada 14 días hasta
completar 10 evaluaciones. La incidencia de M. roreri se
calculó de acuerdo la siguiente fórmula:

La severidad se calificó de acuerdo a la escala dada en
grados de severidad establecido por Cárdenas y Giraldo (1
986). Determinándose posteriormente la severidad de
acuerdo a la siguiente fórmula:

% de daño Grado

0 – Normal (sano) 1

1- 25 Protuberancia 2

26 – 50 Inicio de mancha 3

51 – 75 Mancha 4

76 – 100 Esporulación 5

Después de calcular la incidencia y la severidad
estos datos fueron
transformados a Arc.sen y
respectivamente (Calzada Benza, 1 981).

Los hongos antagónicos, fueron comprados al
Programa
Nacional De Control
Biológico Del Servicio
Nacional De Sanidad Agraria (SENASA) en bolsas de 1 Kg,
desarrollado en un sustrato de arroz, la dosis que se
utilizó fue de 0.5 kg del sustrato en 15 litros de
agua, la
preparación del biopreprado consistió en una
suspensión de esporas agregándole 50 ml de aceite
agrícola de origen vegetal (93% aceite de maíz y 7%
de emulsificante), este se diluyó en 15 litros de agua
para su posterior inoculación en los tratamientos. Antes
de cada inoculación se tomó una muestra para
estimar cuantas unidades formadoras de colonia (UFC) se
están aplicando lo cual se realizó en el
laboratorio con la cámara de Neu bauer. Durante la
investigación se han realizado 10
inoculaciones con intervalos de 14 días.

Tasa de progreso de la enfermedad y área bajo
la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE). Para obtener
una mejor descripción del progreso de la enfermedad,
los datos de intensidad de la enfermedad (incidencia y severidad)
por unidad experimental fueron ajustados a la forma linearizada
de los siguientes modelos
epidémicos: monomolecular, logistico y gompertz. Para
decidir el modelo de
mejor ajuste, se eligió aquel que presento el coeficiente
de determinación más alto (R²) los cuales se
obtuvieron mediante el procedimiento de
regresión
lineal simple. Una vez seleccionado el modelo se
procedió a comparar las tasas de incremento de la
enfermedad en cada uno de los tratamientos.

Para comparar el efecto de los tratamientos, se empleo el
área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE)
aplicando la ecuación propuesta por campell y
madden

donde:

Yi= Proporción de la enfermedad en la
enésima observación.

Xi= tiempo
(días) en la enésima observación.

n = número de observaciones

Metodología De La Fase De
Laboratorio.

Se aisló In vitro M. roreri y los hongos
antagónicos, en placas Petri con medio de cultivo papa
dextrosa agar (PDA), e incubados a 29 °C. La prueba de
cámara húmeda se realizó tres veces en los
tres tratamientos, la primera en la cuarta inoculación, la
segunda en la novena y la tercera a los 45 días
después de la última inoculación.
También se evaluó la velocidad de crecimiento de
los hongos en estudio que consistió en colocar en el
centro de placas petri con PDA una rodaja de agar con el hongo de
diámetro conocido (0.5 cm), luego se midió cada 24
horas hasta que el hongo llene la placa. Para este ensayo se
utilizaron tres repeticiones por hongo. El efecto
antagónico in Vitro consistió en cultivar M.
roreri previamente en 12 placas petri con PDA; cuando este
alcanzó un desarrollo del
60% en la placa (30 días después de la siembra) se
colocaron dos discos en cada placa de agar de 0.5 cm. de
diámetro con micelio de Tha (6 placas) y Tvi (6 placas),
tomado de cultivos de 4 días después de la siembra
e incubándose a 29 ºC. Para evaluar el antagonismo se
consideró dos formas de control; la primera por competencia del
sustrato donde un 100% de crecimiento de M. roreri en la
placa Petri, significaba 0% de inhibición. La segunda por
micoparacitación y producción de antibióticos; cuando
existe parasitación por parte de los hongos
antagónicos se observa micelios muertos y estos esporulan
sobre M. roreri

Análisis
Estadístico.

Los datos obtenidos tanto de incidencia y severidad, se
procesaron utilizando el análisis de variancia bajo el diseño
de bloques completamente al azar con tres tratamientos. Las
diferencias estadísticas se discriminaron haciendo uso
de la prueba de significación estadística de Duncan (p=0.05);
éstos análisis estadísticos se realizaron a
través del software SAS (1
997).

RESULTADOS

De la fase de campo.

Incidencia de moniliasis En el cuadro 01 se observa que
la incidencia al inicio fue mayor del 90 por ciento en los tres
tratamientos. La primera evaluación se realizó 60
días después de la limpieza del campo, donde la
incidencia en el Testigo (T0) fue de 44.15 por ciento, en el T1:
47.04 por ciento y en el T2 47.25 por ciento. Después de
133 días de evaluación la incidencia en el T0 fue
de 51.50 por ciento incrementándose en un 7.35 por ciento,
mientras que en el T1. 25.54 por ciento y T2. 27.89 por ciento,
reduciéndose la incidencia en estos dos últimos
tratamientos en un 21.50 y 19.36 por ciento respectivamente por
el efecto de los hongos antagónicos. Se observa que este
resultado presenta diferencias significativas; el T0 con el T1 y
T2; mientras que entre T1 y T2 no muestran diferencias
significativas. Así mismo el T0 presento 13.9627 ABCPE que
fue mayor en relación al T1 y T2 con 7.5290 y 7.966 ABCPE
respectivamente.

Cuadro 1. Porcentaje de Incidencia de
moniliasis en los tratamientos

I.I.T; Incidencia al inicio del trabajo.

I.I.I.; Incidencia al inicio de la inoculación de
los hongos antagónicos (60 días después de
instalado)

I.F.E; Incidencia al final de las
evaluaciones.

1/ Datos transformados a Arc. Sende los I.F.E.

2 /Promedio seguido por la misma letra en cada columna
no difieren significativamente entre si; por la prueba de Duncan
(P= 0.05)

3/ Estimada utilizando el promedio de Logit. ABCPE:
área bajo la curva del progreso de la
enfermedad.

En el Gráfico 01 y 02 se observa que la
incidencia en el testigo se incrementa en forma lenta y presenta
progreso de la enfermedad positivo por que tiende a
incrementarse, mientras que en el T1 y T2 la incidencia se redujo
y se observa una tendencia a seguir disminuyendo y debido a esto
la curva de progreso de la enfermedad es negativo.

Severidad de moniliasis. En el cuadro 3 se
observa que los tratamientos T0, T1 y T2 antes de realizar la
limpieza del campo fue de, 84.44, 88.53 y 86.49 por ciento
respectivamente; mientras que al inicio de las inoculaciones de
los hongos antagónicos (60 días después de
la limpieza del campo), la severidad en los tratamientos T0, T1 y
T2 fue de 32.60, 32.17 y 32.19 por ciento respectivamente y la
severidad al final de las evaluaciones fue de 37.20, 26.40 y
27.00 por ciento en los tratamientos T0, T1 y T2 respectivamente.
Donde la severidad en el testigo aumentó 4.6 por ciento,
mientras que en el T1, T2 se redujo los porcentajes en un 5.77 y
5.19 por ciento respectivamente. Además se observa que los
tratamientos en estudio, difieren estadísticamente en
cuanto al porcentaje de severidad, donde el T1 y el T2 bajo un
nivel de significación p=0.05, se comportaron
estadísticamente diferentes al testigo. En cuanto ABCPE el
T0 presento 13.8495, mientras en el T1 y T2 presento un ABCPE de
10.2128, 10.4480 respectivamente. En el ABCPE se observa que el
T1 y T2 no difieren estadísticamente, observándose
que ambos presentan diferencias significativas con el
testigo.

Cuadro 03: Porcentaje de Severidad de moniliasis en los
tratamientos. Pucallpa, Perú, 2 005.

S.I.T; Severidad al inicio del trabajo.

S.I.I.; Severidad al inicio de la inoculación de
los hongos antagónicos (60 días después de
instalado).

S.F.E; Severidad al final de las
evaluaciones.

1/ Datos transformados a Arc. Sende los D.F.E

2/ Promedio seguido por la misma letra en cada columna
no difieren significativamente entre si; por la prueba de Duncan
(P= 0.05)

3/ Estimada utilizando el promedio de Logit. ABCPE:
área bajo la curva del progreso de la
enfermedad.

En el gráfico 2;A y B se muestra los valores
del porcentaje de severidad cuantificado semanalmente a partir de
la inoculación de los hongos antagónicos en cada
uno de los tratamientos fueron graficados a través del
tiempo, obteniéndose la curva del comportamiento
de cada tratamiento.. En el gráfico 02.B Se observa que el
T0 presenta un progreso de la enfermedad positivo por que tiende
aumentar la enfermedad en el tiempo, mientras en el T1 y T2 la
curva del progreso de la enfermedad es negativo por que disminuye
el %Severidad.

Fase de laboratorio.

Del conteo de UFC, el producto
comprado presentó un promedio 34.3 x 107 UFC
por gramo y la concentración promedio utilizado en cada
inoculación fue 2.3 x 107 UFC por ml. En la
prueba de cámara húmeda se han observado los
siguientes resultados: primero; frutos con síntomas M.
roreri esporulan normal (ver figura 01. A1), segundo; los
frutos con síntomas de M. roreri, solamente
presentan el estado de
mancha y posteriormente entra a un estado de
descomposición y no esporulan (ver figura 01. A2). Y
tercero; los frutos con síntomas de M. roreri
esporulan normal y luego de dos a tres días se observa a
T. hazianum parasitando (ver Figura 01. A3).

Los resultados observados en las cámaras
húmedas, también se presentaron en el campo, como
frutos que no esporulaban y que solo presentaban el estado de
mancha de M. roreri y también se ha observado
parasitismo (ver figura 02. B). y algunos frutos que presentaban
el estado esporulación de M. roreri, empezaron a
reducir el área de esporulación hasta quedar
completamente sin área de esporulación y
descompuesto (Ver figura 02. B1, B2, B3). En cuanto a la
Velocidad de crecimiento, Tha y Tvi presenta mayor velocidad de
crecimiento, llenando las placas Petri en 4 días de
incubación, mientras M. roreri a los 4 días
de incubación presentó un radio de
crecimiento de 3.7 mm y con esta velocidad de crecimiento
llenó la placa Petri en aproximadamente 50 días de
incubación.

En el efecto Antagónico in vitro se pudo
comprobar la agresividad de Tha, que resultó notablemente
superior pues no solo mostró inhibir el crecimiento al
100% de M. roreri sino además, luego de producirse
el contacto entre ambos hongos, colonizó el micelio del
patógeno creciendo en toda la zona ocupada por él y
esporulando en forma abundante.

En la figura 3, se observa el cultivo dual entre M.
roreri y Tha, donde este crece por encima del micelio de
M. roreri hasta llenar la placa Petri en 72 horas, sin
esporulación alguna sobre él y que a simple vista
no se observa el parasitismo, pero al realizar las observaciones
de las placas en el microscopio
estereoscopico se notó que Tha había colonizado por
completo a M. roreri. Después de 7 días de
haber empezado la colonización de Tha, esté
empezó a esporular sobre él (ver figura 4). Y al
cabo de 28 días de evaluación los micelios M.
roreri estaban completamente secos y muertos.

Con el fin de complementar las observaciones
macroscópicas antes descritas, en este ensayo
también se realizaron observaciones microscópicas
de los cultivos duales, el examen microscópico de las
hifas de Tha en la zona de la interacción reveló que existen
interacciones hifales, lo que estaría demostrando un
comportamiento parasítico de esta cepa de Tha sobre M.
roreri. Se observó que normalmente las hifas de Tha
crecieron en forma paralela a las de M. roreri y que cada
cierto intervalo se conectaban a ellas con pequeñas ramas
semejantes a apresorios (figura 5A, B). También se
visualizó un crecimiento de tipo envolvente de las hifas
de Tha sobre las de M. roreri (figura 5 C), enrollándose
en ellas indistintamente en forma suelta o apretada.

En la figura 06 se observa el cultivo dual de T.
viride y M. roreri Donde Tvi inhibió el
crecimiento de M. roreri en un 99% y se formó una
línea de contacto notorio entre los micelios, rodeando al
hongo en la mitad de la placa Petri, no se observó
parasitismo hacia M. roreri, al final de las
evaluaciones este murió por inanición.

DISCUSIÓN

De Fase de campo.

Incidencia y Severidad de moniliasis

Como se observa en los gráficos 1 y 3 la curva presenta un decline
en los tres tratamientos a los 49 días de haberse iniciado
las evaluaciones (cuarta inoculación de los hongos
antagónicos), esto debido a que se observaron mazorcas con
síntomas de moniliasis pero con ciertas
características peculiares que estos no llegaban a la fase
de esporulación y que no lo registrábamos como
frutos enfermos por que solamente presentaban manchas oscuras
limitadas, ligeramente hundidas que son característicos de
M. roreri las cuales según Hernández y
Ríos (1 991) estas manchas en menos de 15 días y de
acuerdo a las condiciones de humedad y temperatura, se cubren de
micelio y conidias de color blanco, pero sin embargo en este caso
las mazorcas después de quince días no se cubren de
micelio y sigue en el estado de mancha hasta descomponerse. Lo
que posiblemente haya sucedido es que M. roreri se
quedó sin sustrato para colonizar ya que Trichoderma puede
desarrollarse en un amplia gama de sustratos y un rápido
crecimiento y desarrollo, aparte de esto produce una gran
cantidad de enzima inducibles con la presencia de hongos
fitopatógenos (Tronsmo, 1 998).

En el cuadro 1 y 3 se observa que el testigo (To) al
inicio presentó 44.15 y 32.6 por ciento de incidencia y
severidad respectivamente y al final de la evaluación
51.23 y 36.40 por ciento de estos mismos parámetros; lo
que indica un incremento de un 7.08 y 3.8 por ciento
respectivamente en los 133 días de evaluación. Y
según Munive (1 986), el ciclo biológico de M.
roreri, desde que la conidia se posa en la mazorca, germina,
penetra hasta la aparición de la necrosis externa y
esporulación comprende de 45 – 90 días y
considerando que estas plantas de cacao son clones muy
susceptibles al ataque de moniliasis y que la condiciones
climáticas fueron favorables como se observo en los
gráficos 1 y 3, como para que la incidencia y severidad
sea mayor del 80 por ciento en el testigo, y que al final solo
presento una incidencia y severidad de 51.23 y 36.40 por ciento
respectivamente. Este resultado solamente se puede explicar
debido a la distribución de los tratamientos dentro de
las parcelas, que estuvieron muy cerca uno del otro, donde las
UFC fueron dispersadas a las hacia el To, esto quedo demostrado
por que se han encontrado mazorcas con síntomas de control
(antes descritas) y debido a este factor el progreso de la
enfermedad en el To es baja. Esta dispersión de UFC no
solo afectó al testigo sino también a los
demás tratamientos, existiendo incluso una simbiosis
mutualista de T. harzianum y T. viride para
colonizar a M. roreri.

El Testigo presenta un mayor progreso de la enfermedad
en relación al T1 y T2, así como el ABCPE, esto
debido a que la enfermedad aumentó durante la
evaluación, mientras que en el T1 Y T2 el ABCPE es menor
en relación al testigo, este resultado se debe a la
acción
de los hongos antagónicos aplicados.

Fase de laboratorio.

Conteo de unidades formadoras de colonias.
Según Tronsmo (1 998), los productos a
base de este hongo deben aplicarse en un mínimo de 1.x
107 UFC por gramo o mililitro, en este trabajo se ha
usado un producto sólido que supera 34 veces la
concentración mínima que es 34.3 X 107
UFC por gramo. Según el Programa Nacional de Control
Biológico del SENASA 2 004, la dosis para un ataque severo
de una plaga es un 1 kilo de hongo antagónico diluido en
50 Lt de agua (1.38 x 107 UFC por ml). En este trabajo
de investigación se ha utilizado una dosis de 1 kilo hongo
antagónico diluido en 30 Lt de agua, lo que significa un
promedio de 2.3 x 107 UFC por ml, con la finalidad de
inundar las parcelas, para obtener algún efecto
antagónico.

Prueba de cámara húmeda. De la
figura 01 A2, Mont (2 002) menciona que Trichoderma
sp tiene una alta capacidad de competencia por el
sustrato, como consecuencia de ello, el organismo afectado tiende
a entrar en un estado de latencia que podría ser por
deficiencia de nutrientes o la presencia de cierto nivel de
sustancias inhibitorias, lo cual impide que M. roreri
llegue a esporular.

En la figura 01 A3, se observa la
micoparasitación a M. roreri. Y Harman (2 001)
reporta varios mecanismos antagónicos entre ellos menciona
el micoparasitismo que es el fenómeno por el cual un hongo
parásita a otro y cubren una gran cantidad de eventos en este
tipo de interacción, donde Tha produce una gran cantidad
enzimas capaces
de hidrolizar paredes celulares de numerosos hongos,
además Ezziyyani M. 2 004 menciona que presenta una gran
adaptabilidad a diferentes temperaturas de medio ambiente
pudiendo crecer y reproducirse normalmente hasta los 35 ºC.
De la figura 02 B, el área de esporulación de M.
roreri se reduce hasta quedar completamente descompuesto.
Ezziyyani, (2 004); menciona que Tha tiene capacidad de
reducción y destrucción de colonias de
patógenos debido a que produce un tipo de
enzima llamada β-1,3 glucanasa, que es una enzima
hidrolνtico, que al aumento del nivel de
está enzima juegan un importante papel en el
micoparasitismo.

Prueba in Vitro del efecto antagónico En
la figura 03 y 04 se observa la paracitación de Tha a
M. roreri y en este proceso de
destrucción según Harman, G.E. & Kubicek, C.P.
(1 998) intervienen una gran cantidad de enzimas que son capaces
de segregar sustancias antibióticas. Y
Ordóñez, V.H. (2 000) menciona que Tha produce
sustancias como Trichodermina, Dermadina, Sequisterpeno,
Suzukacillina, Alamethicina, richotoxina y Acetaldehido, todas
con propiedades antifungosas y antibacteriales; así como
las enzimas β-1,3 glucanasa, quitinasa y celulasa los cuales
facilitan la habilidad del antagonista para atacar un amplio
rango de patógenos ejerciendo su efecto sobre las paredes
celulares. En este proceso de micoparacitación se ha
observado microscópicamente que existían
interacciones hifales (ver figura 5), donde Tha crece en forma
paralela a M. roreri y que cada cierto tiempo se conecta
mediante ramas semejantes a apresorios, también se han
visualizado un crecimiento tipo envolvente de las hifas de
T. harzianum sobre las de M. roreri. Estas
interacciones hifales observados también son mencionadas
por otros autores como Montealegre (1 990) que hace
mención sobre este tipo de contactos hifales entre T.
harzianum y Sclerotium rolfsii Sacc. Ezziyyani M.
(2004), ha observado hifas de T. harzianum enrollando a
Phytophthora capsici impidiendo su crecimiento.

Trichoderma viride no tiene capacidad para
parasitar a M. roreri como se observa en la figura
06, pero presenta una alta actividad competitiva frente al
patógeno, lo que tiene importancia especialmente en la
fase saprofita de M. roreri, al impedirle su desarrollo en
el mismo sustrato. Mont (2 002) menciona que el éxito
de los antagonistas en la planta puede también ser
gobernada por su capacidad de colonizar y utilizar los sustratos
en la superficie de la planta, permitiendo que compita
efectivamente con los patógenos. Además Lieckfeldt,
& Nirenberg, (1 999) mencionan que Trichoderma viride
produce enzimas como viridin, trichodermin, exo y
endogluconasas celobiasas, y quitinazas y el compuesto
6-pentyl-α – pyrone (6PAP) que es un
antifϊngico, estos y otras enzimas tienen
efecto fúngico y puede parasitar Rizoctonia solani,
Sclerotium rolfsi, Pythium sp, Phytohpthora
parasítica.

CONCLUSIONES

Se concluye que:

• Existe el efecto antagónico de Trichoderma
  harzianum y Trichoderma viride sobre
  Moniliophthora roreri causante de la pudrición
  acuosa de la mazorca del cacao.
• Trichoderma harzianum es una agresivo
  antagonista que tiene la capacidad de inhibir su crecimiento
  así como de micopárasitar a Moniliophthora
  roreri.
• Trichoderma viride presentó una
  alta capacidad de competencia por el sustrato, como
  consecuencia de ello, el organismo afectado tiende a iniciar un
  estado de latencia que podría ser por deficiencia de
  nutrientes o la presencia de cierto nivel de sustancias
  inhibitorias.
• La simbiosis de las cepas de Trichoderma utilizados
  han favorecido en, la reducción de la incidencia de
  moniliasis se reduzcan en el campo, esto debido por las
  características de control antes descritas.
• T. harzianum y T. viride presenta
  adaptabilidad al clima de la
  región.

RECOMENDACIONES

De los resultados de este trabajo se desprenden las
siguientes recomendaciones:

1. Para obtener mejores resultados de control se
   recomienda inocular las mezclas de
   las cepas de Trichoderma utilizado (T. harzianum y T.
   viride), esto por que ambos tiene diferentes formas de
   control.
2. La inoculación de los hongos
   antagónicos en el campo, se debe realizar en las tardes
   para obtener mayor germinación de las UFC en las
   mazorcas con síntomas de M. roreri.
3. Realizar investigaciones
   de diferentes dosis y frecuencias de aplicación
   así como evaluar el control cultural (basado en el
   recojo de frutos enfermos) y los fungicidas frente a los hongos
   antagónicos
4. Que las tratamientos estén mas distanciados
   entre si para no tener problemas de
   que los hongos antagónicos afecten al
   testigo.

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Wagner G. Verde Bedoya

Tesista

Eliel Sanchez Marticorena

Asesor. Profesor
principal de la Fac. Cs. Agropecuarias Universidad Nacional de
Ucayali –Perú