Estandarización de la PCR y generalidades

1. Resumen
2. Selección de las
   concentraciones óptimas de reactivos, parámetros
   del protocolo y equipamiento
3. ADN molde
5. Diseño y
   concentración de los cebadores
6. Composición
   del buffer de reacción y aditivos
7. Parámetros del
   programa de amplificación
8. Precauciones en la
   PCR
9. Estimados
   preliminares de repetibilidad
10. Especificidad y
    sensibilidad analíticas
11. Rango
12. Robustez
13. Bibliografía

Resumen

El presente trabajo aborda
los principales requisitos que se deben tener en cuenta para
lograr una correcta estandarización de la Reacción
en Cadena de la Polimerasa, así como generalidades
importantes de la técnica que son imprescindibles tener en
cuenta siempre que se desee emplear y lo cual es común
para cualquier agente que se desee detectar. Se describen las
consideraciones que se deben tener para la elección del
ADN molde,
enzima, cebadores, dNTPs, cloruro de magnesio, así como
las concentraciones necesarias de cada uno de ellos.
También se describen aspectos relacionados con el buffer
de reacción así como del programa de
amplificación.

La PCR fue desarrollada por Kary B. Mullis en 1983, y ha
revolucionado la aplicación de la genética
molecular, lo que provocó que fuese proclamada por la
revista
Science como el mayor hallazgo científico del
año 1989. La PCR es una técnica in vitro
usada para amplificar enzimáticamente una región
específica del ADN, con el empleo de
cebadores específicos complementarios a dicha secuencia
(López, 1999).

Esta técnica brinda innumerables ventajas, las
cuales han permitido su empleo en diversas investigaciones,
como son su capacidad de multiplicar la porción del ADN
buscada en el orden de 106-9copias lo que le confieren
su altísima sensibilidad; la utilización de
cebadores que reconocen una secuencia única elegida,
propia de cada microorganismo, le confieren su gran
especificidad; su rapidez comparada con algunas técnicas
tradicionales, es otra ventaja para destacar; la
característica de detectar "presencia de ADN" en vez de
"viabilidad de microorganismos" permite su utilización con
una gran variedad de muestras. Al mismo tiempo a pesar
de sus grandes ventajas podemos ver que existe gran probabilidad de
obtener resultados falsos positivos por contaminación con productos de
amplificaciones anteriores (amplicones) lo que hace necesario
realizar una cuidadosa evaluación
de sus resultados y además se debe destacar la falta de
estandarización de las técnicas home made
(Técnicas moleculares en la práctica diaria, 1999),
aunque recientemente la mayoría de los laboratorios que
emplean este procedimiento
realizan su estandarización con el propósito de
obtener resultados confiables.

La PCR está revolucionando el diagnóstico de numerosas enfermedades infecciosas,
particularmente aquellas causadas por organismos difíciles
de cultivar y además se ha convertido en una herramienta
esencial a emplear en diversos procedimientos
comunes como el clonaje de fragmentos específicos de ADN,
para la detección e identificación de genes en el
diagnóstico y la medicina
forense, detección de mutaciones, diagnóstico de
enfermedades hereditarias o determinación del sexo del
feto
previamente a su implantación en procesos de
fecundación in vitro y en
investigaciones relacionadas con marcadores de paternidad (Najar
y Mirdamadi, 2005).

Un ensayo
estandarizado es un método que
brinda constantemente el mismo resultado para una muestra dada
cuando se ha repetido varias veces y realizado por diversos
analistas, en diferentes laboratorios (Practical Molecular
Biology, 2003; Manual OIE,
2004).

Para estandarizar un ensayo
analítico, primeramente es necesario demostrar y comprobar
si el método es útil o no para el fin que fue
diseñado, utilizando para ello material de referencia, que
permita obtener resultados confiables (Binder, 1997c; Manual OIE,
2004).

El desarrollo y
estandarización de un sistema de PCR
incluye optimizar toda una serie de parámetros
críticos de los cuales depende este método y
determinar parámetros imprescindibles que permita plantear
que el sistema diseñado es confiable (Binder, 1997h;
Practical Molecular Biology, 2003).

Selección de las concentraciones
óptimas de reactivos, parámetros del protocolo y
equipamiento

La típica reacción de amplificación
incluye la secuencia blanco, la enzima ADN polimerasa, dos
oligonucleótidos, desoxinucleótidos trifosfatos
(dNTPs), cloruro de magnesio (MgCl2), el buffer de
reacción y aditivos opcionales, que todos son mezclados y
colocados en un termociclador automático que realiza los
ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta
(Henegariu, 2000b; Promega Technical Bulletin, 2005). Todos estos
parámetros son necesarios optimizar para lograr un
correcto funcionamiento del sistema.

ADN
molde

La correcta amplificación de la región de
interés
es dependiente de la cantidad y calidad del ADN
molde. Los reactivos que se emplean normalmente para purificar
los ácidos
nucleicos (sales, guanidinio, proteasas, duodecil sulfato de
sodio (SDS) y solventes orgánicos) son inhibidores
potentes de las ADN polimerasas (Promega Technical Bulletin,
2005).

Existen una serie de reglas sencillas para que el ADN
molde no sea un problema en la reacción: (1) se debe
garantizar su integridad, es decir no puede estar fragmentado en
trozos más pequeños del que se desea amplificar,
(2) la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que
reducen la concentración de iones Mg2+ en la
solución (Barbeyrac y col., 1996) y (3) no debe haber
determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes que
pueden inhibir la actividad de la polimerasa (Practical Molecular
Biology, 2003).

Si se desea amplificar un gen de simple copia se emplean
cantidades entre los 100 y 500 ng. En el caso de la
amplificación de genes repetidos se puede reducir la
cantidad a emplear entre los 10 y 50 ng. El mínimo oscila
entre 10 y 100 ng y el máximo entre 400 y 500 ng (Lozada,
2002).