Elección y concentración de la
enzima
Existen diferentes tipos de ADN polimerasa
que llevan a cabo la replicación del ADN. Estas se pueden
clasificar en: Termolábiles (Temperatura
óptima de 37ºC a 42ºC, se desnaturalizan con el
calor) y
termoestables (Temperatura óptima de 74 ºC, resiste
entre 40 a 50 segundos a 96ºC) (Lozada, 2002).
Una de las más utilizadas ha sido la Taq ADN
polimerasa (Mas y col., 2001). Es una enzima termoestable aislada
de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas
temperaturas. Carecen de actividad 3´-> 5´
exonucleasa, lo que las hace menos seguras a la hora de comparar
las fidelidades. Por ello hay que intentar obtener las mejores
condiciones para garantizar su correcto funcionamiento, para lo
que se recomienda no usar un alto número de ciclos, las
concentraciones de los dNTPs deben ser iguales, disminuir en lo
posible el tiempo de cada
etapa y la concentración de MgCl2 debe oscilar
entre 1.5 mM y 3.0 mM (Binder, 1997g).
Se recomienda utilizar entre 1 y 1.25 U de enzima en
50µl de reacción. Incrementos en la cantidad de
enzima y del tiempo de extensión genera la
aparición de artefactos debido a la actividad exonucleasa
intríseca 5´ -> 3´ de la enzima (Promega
Technical Bulletin, 2005; Promega protocolos, 2005
y Lozada, 2002).
Diseño y concentración de los
cebadores
Los cebadores deben tener un tamaño entre las 18
y 30 pb. Se recomienda que el contenido de G+C oscile entre el 40
y 60%, evitando la presencia de regiones con largas secuencias de
una sola base, así como secuencias que puedan producir
estructuras
secundarias internas. Los extremos 3´ no deben ser
complementarios, para evitar la formación de
dímeros. Se debe evitar además la presencia de tres
G ó C cerca del extremo 3´ (Henegariu, 2000g;
Brinkmann Instruments, 2004).
La temperatura de alineamiento (Ta) de los cebadores
debe ser similar en ambos, la cual generalmente oscila entre los
45 ºC y 60 º C. La secuencia de los cebadores puede
incluir en el extremo 5´ sitios de corte para enzimas de
restricción, lo cual dependerá del propósito
de la investigación (Binder, 1997d; Henegariu,
2000c).
La concentración de cebadores a emplear debe
oscilar entre los 5 y 50 pmoles, para una concentración
final de 0.1 y1µM en 50 µl de reacción
(Promega Technical Bulletin, 2005).
Deoxinucleótidos trifosfato
Los dNTPs deben ser añadidos en la
reacción en iguales concentraciones, puesto que los mismos
pueden captar iones Mg2+. Por lo general la
concentración final más utilizada de dNTPs en un
volumen de
reacción de 50 µl es de 0.2 mM (Brinkmann
Instruments, 2004; Henegariu, 2000e)
Concentración de Cloruro de
magnesio
La concentración de magnesio es un factor crucial
que afecta el funcionamiento de la enzima Taq ADN polimerasa. Los
componentes de la reacción tales como: el ADN molde,
agentes quelantes presentes en la muestra (EDTA o
citrato), dNTPs y proteínas
pueden afectar la cantidad de magnesio libre (Henegariu, 2000d;
Promega Technical Bulletin, 2005). Su carencia puede inactivar la
enzima y su exceso reduce la fidelidad de la enzima y puede
incrementar las uniones inespecíficas (Eckert y Kunkel,
1990). Por tales razones resulta imprescindible determinar la
concentración óptima de esta sal, la cual
generalmente se encuentra en el rango de 1.5 a 3.0 mM.
Composición del buffer de reacción y
aditivos
Por lo general el buffer de reacción 10x
está formado por 100 mM tris-HCl (pH entre 8 y 9
a 25ºC), 500 mM KCl, 0.1% gelatina, 1% de Triton x-100 y
15mM de MgCl2. El buffer tris es el encargado de
regular el pH de la reacción, el cual afecta la actividad
y fidelidad de la enzima. Moderadas concentraciones de KCl pueden
incrementar la actividad de la enzima de un 50 a un 60% por
encima de la activivdad en ausencia de esta sal, cuya
concentración óptima a emplear es de 50mM (Binder,
1997a; Henegariu, 2000f).En ocasiones se hace necesario el uso de
aditivos, los cuales ayudarían en la práctica a
aumentar la especificidad y fidelidad de la PCR. La
adición de betamina, dimetilsulfóxido (DMSO) y
formamida es beneficioso cuando el ADN molde posee regiones ricas
en GC y forma potentes estructuras secundarias del ADN que puede
provocar que la polimerasa se detenga (Rees y col.,
1993). El ADN con regiones ricas en GC puede ocasionar una
ineficiente separación de las dos cadenas del ADN, por lo
tanto la adición de aditivos en estos casos es
beneficiosa, pues la betamina reduce la cantidad de
energía requerida para separar las cadenas del ADN molde y
el DMSO y formamida interfieren en la formación de enlaces
de hidrógeno entre ambas cadenas.
También se pueden usar detergentes como el tween 20,
laureth 12 (0.1%) o Tritón x-100, que ayudan a estabilizar
la enzima. Existen también protocolos que incorporan
polietilenglicol (PEG), glicerol, seroalbúmina bovina
(BSA), etc., aunque no son en ningún caso imprescindibles
(Lozada, 2002; Promega protocolos, 2005).
El volumen de la reacción es variable, aunque en
muchas ocasiones se recomienda emplear volúmenes
pequeños cuando se utilizan pequeñas cantidades de
ADN (Henegariu, 2000h).
Parámetros
del programa de
amplificación
Los dos parámetros que comúnmente se
optimizan son la temperatura y el tiempo de alineamiento. Los
tiempos y temperaturas del resto de las etapas usualmente no
varían significativamente (Henegariu, 2000a; Promega
protocolos, 2005).
Un tiempo de alineamiento de 30 a 45 segundos es
frecuentemente empleado. Se plantea que incrementos de 2 a 3
minutos tienen una influencia negativa en la reacción. Sin
embargo como la Taq polimerasa tiene actividad reducida entre los
45ºC y 65ºC (intervalos a los cuales son elegidas la
mayoría de las temperaturas de alineamiento), tiempos
más largos suelen incrementar la probabilidad de
aparición de productos
inespecíficos (Practical Molecular Biology,
2003).
Las secuencias de los cebadores son una
consideración importante en la determinación de la
temperatura de alineamiento óptima de la PCR. Los
cebadores que poseen una temperatura de fusión
(Tm) alta, se recomienda aumentar la temperatura de alineamiento,
pues de esta forma se reducen al mínimo las uniones
inespecíficas, aumenta la cantidad de producto
amplificado y se reduce la formación de dímeros
(Binder, 1997b). La temperatura de alineamiento óptima
dependerá del cebador con la menor Tm, generalmente
mas/menos 5ºC que la calculada, es la indicada para comenzar
los estudios de optimización. Ambos cebadores deben tener
una Tm similar, planteándose que si las Tm se diferencian
en mas de 5ºC, uno de los cebadores debe ser
rediseñado (Henegariu, 2000i).
El número de ciclos también es un aspecto
importante a considerar. Este número depende de la
cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de
los factores han sido optimizado. Es importante no realizar un
número alto de ciclos (normalmente se emplean de 25-35
ciclos) ya que puede dar lugar a la amplificación de
productos no deseados originados por hibridaciones no
específicas. Hay que tener en cuenta que la
reacción está producida por una enzima que sufre el
efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de
acumulación del producto. Después de un
número determinado de ciclos la amplificación deja
producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria.
Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de
ADN sintetizado es suficiente para su posterior
utilización (Lozada, 2002; Promega Technical Bulletin,
2005).
Precauciones en la PCR
Este es un aspecto muy importante a tener en cuenta
cuando se trabaja con esta técnica, que al ser muy
sensible, es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que
es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una
cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un
resultado que no es real, por lo que una de sus mayores ventajas,
se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una
serie de normas que ayudan
a evitar las contaminaciones y la aparición de falsos
positivos: lugar físico e instrumental exclusivo para la
realización del ensayo,
utilización de reactivos y tubos estériles,
así como puntas resistentes a aerosol, uso de guantes,
colocar controles de agua,
además de colocar muestras negativas conocidas (Binder,
1997f).
Para evitar la aparición de resultados falsos
negativos, producidos generalmente por errores al pipetaer y/o
presencia de inhibidores, se recomienda emplear controles
internos que compiten con la muestra problema (Manual de la OIE,
2004; Farmacopea Europea, 2007).
Estimados preliminares de
repetibilidad
Debe existir concordancia entre los resultados obtenidos
entre réplicas y en diferentes corridas. Esto brinda
importante información sobre el ensayo
antes que se continúe con la estandarización. Si se
encuentra excesiva variabilidad, se debe corregir antes de
continuar (Manual OIE, 2004).
Especificidad y sensibilidad
analíticas
La sensibilidad analítica o límite de
detección es la mínima cantidad de analito que es
capaz de detectar el ensayo y puede ser representado como:
número de copias del genoma, dosis infecciosa, unidades
formadoras de colonias (UFC), etc del agente que puede ser
detectado (Farmacopea Británica, 2004). Para determinar la
sensibilidad analítica se recomienda calcular, para fines
prácticos, el punto final de corte, el cual se define como
el mínimo de secuencias blanco por volumen de muestra que
es capaz de detectar el ensayo en el 95% de las réplicas.
Estos estudios al realizarse en réplicas son útiles
para demostrar la variación entre corridas realizadas en
un mismo y en diferentes días (Manual OIE, 2004;
Farmacopea Europea, 2007).
De acuerdo a lo descrito en la Farmacopea Europea, 2007
el límite de detección se debe calcular para cada
especie en particular, pues se debe a la desigual distribución de cada uno en las diferentes
muestras, por lo tanto el punto final de corte se plantea que
debe ser calculado para cada una y requiere de al menos 3 series
de diluciones de cada especie de hasta 10 diluciones en cada
serie y al final se debe tener 24 réplicas de cada
dilución. Para lograr esto se recomienda por ejemplo
testar las 3 series de diluciones en diferentes días con 8
réplicas por cada dilución.
La especificidad analítica es la habilidad de
un ensayo de
distinguir o detectar el blanco específico de otros
agentes infecciosos. Se determina con el empleo de
patógenos genéticamente similares que se encuentran
comúnmente contaminado las muestras clínicas del
agente a detectar, para el cual fue diseñado el ensayo
(Binder, 1997e; Manual OIE, 2004; Farmacopea Europea,
2007).
La demostración de este parámetro requiere
del empleo de un amplio rango de microorganismos que presenta una
estrecha relación filogenético con en agente a
detectar (Farmacopea Europea, 2007)
Rango
Las técnicas
analíticas se deben optimizar en la fase lineal de la
curva de respuesta. La gama de un análisis se define como el intervalo entre
la concentración superior y más baja de un agente
infeccioso en una muestra en la cual el agente pueda ser
detectado de manera confiable y reproducible (Manual OIE,
2004)
Robustez
La robustez de un procedimiento
analítico es una medida de la capacidad de no afectarse
por pequeñas variaciones en los principales
parámetros del método
(MgCl2, cebadores o dNTPs) y proporciona una medida de
su confiabilidad durante el uso normal. La evaluación
de la robustez debe ser considerada durante la etapa del desarrollo y
estandarización del ensayo pues en esta fase del proceso se
realizan pequeñas variaciones en los principales
parámetros críticos (MgCl2, dNTPs,
cebadores, etc) con el fin de lograr la correcta
optimización y de esta forma se tienen estimados
preliminares de la robustez del ensayo, la cual finalmente se
confirma a través de estudios colaborativos entre
laboratorios (Farmacopea Europea, 2007).
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Aplicada para el Cono Sur (1999): Técnicas
moleculares en la práctica diaria
Autor:
Yenney Hernández, MsC.*
Evelyn Lobo, DrC.,
Belkis Corona, DrC.
Siomara Martínez, DrC.
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), La
Habana, Cuba
*correspondiente autor
Biografía del autor
Graduada de Bioquímica
2005, Master en Ciencias,
premios obtenidos con diversos trabajos presentados sobre el
diagnostico de micoplasmas, asi como la validación de
técnicas de diagnostico para la detección de
micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos
biofarmaceuticos. Trabajo
presentado en evento internacional IOM, 2006. Estudios
realizados: diagnostico de micoplasmas, validación de
técnicas, clonaje y expresión de proteína de
superficie de micoplasmas, epidemiologia
molecular.
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