Brucelosis en leche de búfala (página 2)

En la mayoría de los Municipios del Estado
Portuguesa existen fincas dedicadas a la explotación
bufalina. Según información oficial del Servicio
Autónomo de Sanidad Animal (SASA), la mayor
concentración de estas es en el Municipio Guanarito. Es el
caso que en dicho Municipio existen varias unidades de producción de leche de
búfala dedicadas a la elaboración de quesos
producidos artesanalmente, por lo tanto este método de
producción no garantiza la higiene y una
buena calidad del
alimento en cuanto a su composición. Esto se debe al
desconocimiento del personal que
labora con este producto, en
cuanto a los parámetros que se deben aplicar para obtener
un producto terminado de calidad.

Esta situación puede llevar a que el alimento
pueda causar problemas de
salud al consumidor, al no
contar con las condiciones que favorezcan su conservación,
contenido alimenticio, y por otro lado no se cumplan con las
características organolépticas deseables,
además de existir la posible presencia de brucelosis. De
tal manera que es necesario determinar la presencia de Brucellas
en la leche de búfala producidos en dichas fincas, con la
finalidad de determinar la calidad de la misma y que los
consumidores con esta información formen criterios para la
adquisición de leche de búfala producidos
artesanalmente.

A partir de esta situación se establecen las
siguientes interrogantes:

¿Cuántas fincas en Guanarito son
utilizadas en la explotación del búfalo y a su vez
utilizan la leche para la elaboración de queso?

¿Cual es la producción de leche de
búfala producida en fincas ubicadas en el municipio
Guanarito, Estado Portuguesa?

¿Existe la presencia de Brucellas en la
leche de búfala producida en fincas ubicadas en el
municipio Guanarito, Estado Portuguesa?

Objetivos de la
investigación

Objetivo General

Determinar la presencia de brucelas (Brucellas
abortus) en leche de búfala producida en fincas
ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa.

Objetivos Específicos

Cuantificar la cantidad de fincas que utilizan a las
búfalas para el ordeño y producción de
queso.

Determinar la producción de leche de
búfala en fincas ubicadas en el municipio Guanarito,
Estado Portuguesa.

Determinar la presencia de Brucellas en la leche
de búfala en fincas productoras ubicadas en el municipio
Guanarito, Estado Portuguesa, mediante análisis bioquímicos y
serológicos.

Justificación de la
investigación

Esta investigación proporcionara conocimientos
acerca de los parámetros de calidad con respecto a
brucelosis en leche de búfala producida en fincas de
Guanarito, estado Portuguesa , la cual es obtenida de manera
artesanal, lo cual no garantiza que el productor controle estos
parámetros para que la producción sea de forma
adecuada según las normas de calidad
e higiene (COVENIN).

Los resultados obtenidos en este estudio
permitirán tomar decisiones respecto a las mejoras o
correctivos durante el proceso de
producción de leche, y en los cambios que deben realizar
los productores en sus fincas para aumentar la calidad de dicho
producto.

Esta investigación beneficiará a todos los
consumidores de leche de búfala producida en dichas
fincas, ya que contaran con información sobre el
cumplimiento de los parámetros en la producción de
leche, para la decisión a la hora de su
adquisición.

Este trabajo
igualmente se justifica, ya que se aplicaran teorías
y conceptos de microbiología, bio-química,
características físicas, principios y
normas para la producción de leche, los cuales
serán contrastados con la realidad que se presenta en los
diversos sitios donde se produce dicho producto. Por otro lado,
se aplicarán las técnicas,
procedimientos, y sus resultados podrán
servir de referencia a estudios similares en toda la geografía regional y
nacional, además de incentivar a los ganaderos a realizar
este tipo de análisis (determinación de
Brucellas) para conocer la calidad de la leche producida y
garantizar dicho producto como apto para consumo
directo y/o posterior procesamiento, como por ejemplo el
queso.

Alcance de la
Investigación

En la presente investigación se pretende adquirir
información, en lo que respecta a la determinación
de Brucellas en leche de búfala producida en fincas
del Municipio Guanarito del Estado Portuguesa, para ello, se
deben abordar una serie de recomendaciones tratando de solventar
la problemática existente.

Se realizaran análisis bioquímicos y
serológicos que determinarán la presencia de
Brucellas en leche de búfala, la cual puede deteriorar el
alimento y ocasionar daños a los consumidores y contaminación mediante la
manipulación o consumo del producto elaborado.

Viabilidad de la
investigación

Factibilidad operativa: desde este punto de vista
este proyecto es
factible ya que los realizaran en el laboratorio El
Carrao ubicado en Guanarito, porque cuenta con los equipos
necesarios para efectuar los análisis
requeridos

Factibilidad técnica: si es factible, ya
que se cuenta con el personal capacitado y con experiencia en
este tipo de estudio, para la realización de los
análisis requeridos.

Factibilidad económica:
económicamente es factible, ya que contamos con los
recursos
económicos para cubrir los costos necesarios
para realizar los diferentes análisis.

FASE DE
EJECUCIÓN

CAPÍTULO II:
MARCO REFERENCIAL

Bases Teóricas

En términos generales se puede afirmar que el
búfalo es un animal de gran tamaño, de contextura
maciza, lo cual lo hace un buen productor de carne, además
de que sus características genéticas lo convierten
también en un excelente productor de leche.

Según COVENIN 903(3), la leche es definida como:
"El producto integro normal fresco obtenido del ordeño
higiénico e ininterrumpido de vacas sanas".

En este orden de ideas, Brinez (2000), define la leche
como un líquido complejo segregado por las
glándulas mamarias de las hembras mamíferas para
alimentar a sus crías, que contiene muchos elementos en
diferentes estados de dispersión.

De igual manera, Veisseyre (1983), señala que "La
leche es un líquido blanco opaco, dos veces más
viscoso que el agua, de
sabor ligeramente azucarado y de olor poco acentuado".

Así mismo, D’ Elia (1994), hace referencia
a 4 aspectos muy importantes en la leche de
búfala:

1. Composición físico-química de
la leche de búfala: la leche de búfala presenta
características físico-químicas y
organolépticas muy propias. Su sabor es levemente
endulzado y tiene un color blanco
azulado. Esto se justifica por la ausencia de betacaroteno, el
búfalo es capaz de metabolizar este pigmento en vitamina
A. Por su alto contenido de cationes la leche de búfala
presenta baja elasticidad
al calor y una
alta tensión de la cuajada, además de un alto
contenido de sólidos totales. El coagulado de la leche
es más rápido y la estabilidad a temperaturas
elevadas son menores que la de vaca.

2. pH: debe
estar comprendido entre 6.25 – 7 y 6.30 – 6.85. La
densidad y
glóbulos de grasa son más grandes, además
presentan una temperatura
de fusión
más elevada a pesar de tener mayor contenido de
sólidos grasos. Los contenidos de fosfolípidos y
de colesterol de la leche bufalina son más bajos que los
de la vaca.

3. características microbiológicas: esta
leche tiene la propiedad de
inhibir el crecimiento
bacteriano, hecho atribuido al elevado contenido de
lecitina y la presencia de cantidades variables de
glicoproteína, conocido como lactoferrina (0.320 mg/ml).
La actividad antimicrobiana ha sido demostrada sobre
coniformes, Bacillus thermophillus y Sthaphylococcus aureus,
inhibiendo el desarrollo
de bacterias
que requieren hierro.

4. características nutricionales: por su
composición esta leche es considerada de alto valor
energético, 90 kcal/100 g en comparación a las
60-70kcal/100 g de la leche de vaca, justificado por las
cantidades mayores de las proteínas del suero, la presencia de
ácidos
grasos polinsaturados como el tetraendico, las cantidades de
calcio (hasta 190mg/100g), magnesio soluble y fósforo
inorgánico (hasta 134mg/100g). el valor de colesterol se
ha reportado en 214mg/100g.

Por otra parte, este mismo autor señala que la
leche de búfala puede ser utilizada para la
elaboración de una extensa variedad de alimentos, tales
como: mantequilla, aceite de
manteca, quesos duros y blandos, leche evaporada, condensada,
descremada, helados, crema de leche, yogurt, entre
otros.

Laxminaraya y col. (1968), presenta el siguiente cuadro
representa algunas características físicas de la
leche de búfala.

CUADRO 1: Representación de las
características físico-químicas de la leche
de búfala en comparación con la leche de
vaca.

Fuente: Laxminaraya y col., 1968.

Por otra parte, Dimov (1947) presenta el siguiente
cuadro que muestra las
propiedades y composición de la leche de
búfala.

CUADRO 2: propiedades y composición de la
leche de búfala.

Fuente: Dimov, 1947.

Según Shumen y col. (1960) una valiosa propiedad
de la leche de búfala radica en que durante las estaciones
de invierno y primavera, el contenido mínimo de Vitamina A
es varias veces superior al de la leche de vaca. Dicho autores
determinaron el siguiente contenido promedio de Vitamina A (mg.
/lt) en leche de búfala y de vaca los cuales se presentan
a continuación:

CUADRO 3: Promedio de Vitamina A en leche de
búfala y vaca.

Fuente: Shumen y col., 1960.

En otro sentido, la brucelosis es una enfermedad que ha
venido tomando relevante importancia en Venezuela y
otros países, ya que es un factor que provoca
pérdidas económicas y problemas de salubridad en la
sociedad.
Dicha enfermedad es transmitida por un microorganismo
del género
Brucellas, que suelen transmitirse al hombre
habitualmente a partir de los animales
domésticos.

Este término se adoptó en honor del medico
Ingles David Bruce, quién aisló por primera vez el
microorganismo en 1887.

Los caracteres fisiopatológicos de la Brucelosis
no han sido estudiados completamente, sin embargo los podemos
resumir de la siguiente manera:

• Después de la infección inicial la
  bacteria prolongada puede extenderse por un par de años,
  luego se hace intermitente.
• La bacteria es trasmitida principalmente durante el
  tiempo del
  aborto –
  Tejido placentario abortado y las descargas vaginales pueden
  contener hasta 1010 organismos por mil- La
  diseminación a través de esta ruta puede
  continuar por semanas después del aborto.
• La infección ocurre generalmente por
  vía oral.
• La transmisión también ocurre a
  través del apareamiento sexual entre una vaca infectada
  y un toro sano y viceversa.
• Los machos usualmente almacenan la bacteria en el
  epidídimo y en la próstata. Suelen ocurrir
  evacuaciones intermitentes hasta un período aproximado
  de 15 meses.
• La transmisión coital se ha demostrado
  experimentalmente cuando vacas no infectada han sido servidas
  por un toro infectado.
• La secreción de la glándula mamaria de
  vacas infectadas que han abortado contiene abundantes
  bacterias.
• Lesiones como epididimitis, orquitis e infertilidad
  son aspectos importantes de la enfermedad en los machos. El
  examen del líquido seminal es primordial para establecer
  un diagnóstico de brucelosis en el
  semental.
• Se han reportado alteraciones posteriores a la
  infección en exámenes seminales ( 30 – 80 %
  formas normales) entre ella:

1. Colas dobladas
2. Pieza media edematosa
3. Colas dobles
4. Cabezas sueltas
5. Vacuolas protoplasmáticas.

• En etapas más avanzadas se observan cambios
  más acentuados tales como:

1. Más de 90 % de las células
   espermáticas son anormales.
2. Motilidad reducida.
3. Los neutrofilos y los monocitos son comunes en el
   eyaculado.
4. Las células espermáticas pueden mostrar
   aglutinación cabeza con cabeza y se pueden detectar las
   espermo-aglutininas (1 gG) por largo tiempo (1 año
   aproximadamente).

PATOGÉNESIS

El microorganismo no tiene una entrada definida, sin
embargo, cualquiera que sea la puerta de entrada, los sucesos a
ocurrir después son similares en el bovino. Es factible
que la puerta de entrada sea múltiple
simultáneamente. Una vez que el microorganismo atraviesa
las barreras corporales se ubica en el área por un
período de dos semanas, desde donde pasa a través
de una migración
lenta hacia los capilares linfáticos, donde se establece
el primer contacto con el aparato inmunológico
quién reconoce a la Brucela como antígeno. Una vez que se ha formado el
complejo antígeno-anticuerpo se desencadena el proceso de
atracción de las células fagocitarias
principalmente los polimorfonucleares (Neutrofilos).

Los polimorfonucleares (PMN) van a fagocitar en forma
simple a las bacterias invasoras pero con la particularidad de no
destruirlas, por lo que estos microorganismos permanecen intactos
dentro del neutrofilo donde llegan a reproducirse. De esta forma,
a pesar de que se ha comenzado a desencadenar la reacción
inmunológica el agente invasor no puede ser destruido por
encontrarse intracelularmente. Los PMN infectados pasan a la
circulación sanguínea donde se distribuyen a todos
los órganos de la economía animal. Al
cabo de cuatro semanas se puede localizar y aislar organismos de
Brucela en cualquier parte del cuerpo. Como consecuencia
de la muerte del
PMN las bacterias son liberadas de nuevo en el torrente
sanguíneo donde quedan expuestas a la acción
de un aparato inmunológico ya prevenido quién se
arma de las bacteriolisinas y el complemento del plasma para
destruir parte de las bacterias mientras que otras son
fagocitadas por células leucocitarias y destruidas. Parte
de estas células están representadas por histocitos
y monocitos propios de cada tejido. Ahora bien, esta capacidad de
destruir las bacterias esta en cierta forma supeditada al alto
grado del nivel de sensibilización de estos monocitos
hacia la Brucela. En los casos de animales que sufren de
primoinfección la capacidad de fagocitosis en los
monocitos es menor que en aquellos animales cuyos monocitos han
sido previamente sensibilizados a la Brucella en donde se
ha observado una fagocitosis extraordinariamente eficiente. Este
fenómeno es de gran importancia ya que revela que el
proceso inmunitario más importante en esta enfermedad es
el celular, más que el humoral.

La bacteremia que perdura por largo tiempo, se presenta
con mayor incidencia durante el primer parto y se
asocia con abortos, y partos de becerros pequeños. Esta
demostrado que esta bacteremia es previa al desarrollo de
títulos detectables de anticuerpos sericos o la presencia
de manifestaciones clínicas. Las lesiones más
comunes se observan en el bazo, genitales y glándulas
mamarias. En esta última desarrolla una mastitis
intersticial crónica, la cual no determina cuadros
clínicos pero si aumenta el número de
células somáticas en la leche lo cual representa un
signo de mastitis subclínica.

El microorganismo tiene especial atracción por
los órganos genitales donde se ubica en el espacio
uterocorionico de una hembra bovina condenada al aborto. Muchos
de los microorganismos están incluidos en el protoplasma
de la célula
epitelial. Se ha demostrado que estas células se han
derivado de la envoltura externa fetal (El corion), esta membrana
presenta áreas engrosadas, no translúcidas y
edematosas debido a la multiplicación de este
organismo.

Aparentemente el microorganismo induce una inflamación de la membrana lo cual
interfiere con la circulación del feto lo que
explica él porque el aborto ocurre.
El feto usualmente muestra una condición edematosa lo que
respalda la teoría
de un disturbio circulatorio. La Brucella también
puede ser encontrada en cultivos puros en el tracto
gastrointestinal y los pulmones del feto, lo cual sugiere que la
vía de entrada, es la oral al tragar el líquido
amniótico y no a través de la vía
sanguínea. Después del parto de los tipos
vacúnales que tienden a ser estables después de
cierto tiempo de la inoculación. Las muestras se toman con
veinte días de separación.

El aborto epizoótico bovino es una enfermedad que
se caracteriza por presentar aborto en la última parte de
la gestación. El agente causal es la Chilamydia
psittaci la cual produce una reacción febril en las
vacas susceptibles. Después de un período latente
en el cual este microorganismo se propaga en el feto se produce
el aborto. Las novillas son las más afectadas y la
incidencia de abortos es alrededor de un 60 %. Los infectados
tienen el tamaño de neonato ó termino y pueden
morir durante el parto o poco después; algunos suelen
sobrevivir. El aborto ocurre en forma silenciosa y generalmente
hay retención de placenta. El feto presenta edema
subcutáneo generalizado con hemorragias en la conjuntiva y
base de la lengua. El
abdomen se halla marcadamente distendido a causa del acumulo de
líquido sanguinolento el hígado del feto esta
agrandado y de color pálido o anaranjado con la superficie
granular y friable. Para el diagnóstico se debe aislar e
identificar C. psittaci .

La enfermedad se conoce en el país desde el
año 1930 pero no fue sino hasta el año 1968 cuando
el Ministerio de Agricultura y
Cría (MAC), a través de la Dirección de Ganadería,
publica la Resolución para la campaña
nacional de control de la
brucelosis que aun continúa en vigencia (MAC, 1987). Hoy
en día, el organismo que regula la materia
sanitaria animal es el Servicio Autónomo de Sanidad Animal
(SASA), y está encargado de velar por el
cumplimiento de las normas establecidas en esta
resolución,
así como promover nuevas medidas de control
tendientes a controlar y erradicar la enfermedad.

Debido a la alta producción y calidad de la leche
de búfala en el estado
Portuguesa es necesario determinar la presencia de
Brucellas en dicho producto ya que este es utilizado en su
mayoría para la elaboración de queso, el cual no
cumple con los requisitos mínimos exigidos por los
organismos encargados de velar por la salud
pública (SASA).

En el hombre la
Brucelosis es capaz de afectar seriamente su salud y minar
significativamente su capacidad de trabajo. En los animales
ocasionan pérdidas económicas importantes en
abortos, crías débiles y en la producción de
leche y carne.

DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD EN EL
HOMBRE

Es una enfermedad de principio brusco e insidioso que se
caracteriza por la presencia de fiebre continua,
intermitente o irregular, cefalalgia, sudores, escalofríos
y dolores generalizados. Puede ser de curso agudo o
crónico. Otros síntomas frecuentes son
constipación, anorexia,
astenia y dolores generalizados.

Las adenopatías ocurren muchas veces y se puede
presentar esplenomegalia (inflamación del
bazo). En la brucelosis crónica el paciente
muestra irritación, nerviosismo y depresión.
La enfermedad puede durar días, meses y a veces, varios
años, aunque la recuperación es bastante
frecuente.

MODO DE TRANSMISIÓN.

La transmisión de la brucelosis al humano
está relacionada con el consumo de leche o subproductos
lácteos
sin pasteurizar, así como a través del contacto
directo con animales infectados, sus productos y
secreciones. Algunas décadas atrás, la
transmisión al hombre mediante el consumo de leche cruda
era epidemiológicamente importante, pero actualmente con
la adopción
generalizada de sistemas
pasteurizados, a la brucelosis ha disminuido notoriamente en al
población general y es mayormente una
enfermedad ocupacional de veterinarios, ganaderos, matarifes,
carniceros, obreros de fincas y otras personas que mantienen
contacto con animales o sus productos.

La infección se contrae al manipular fetos y
envolturas fetales o al entrar en contacto con secreciones
vaginales, excrementos y canales de animales infectados. La
entrada del germen por al piel y las
mucosas es importante.

DIAGNÓSTICO.

En el hombre el diagnóstico debe basarse en la
clínica que presenta el paciente, los antecedentes
epidemiológicos y las pruebas de
laboratorio. El aislamiento de la brucela a partir de la sangre o
médula es lo recomendable. Se puede usar también
líquido cefalorraquideo, material de ganglios y de
abscesos.

Las pruebas serológicas son también muy
útiles. Un título de 100 Unidades Internacionales
(U.I.) o más en las pruebas de seroglutinación
rápida o lenta, y títulos crecientes en pruebas
repetidas indican una base para el diagnóstico.

Otras pruebas serológicas en humanos incluye la
fijación del complemento, la prueba de Coombs, y la de
2-mercaptoetanol.

SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA.

Los niños y
las personas jóvenes son menos susceptibles que los
adultos al presentar la enfermedad. También se ha
comprobado que la prevalencia de brucelosis es menor en las
mujeres que en los hombres, aunque esto se podría explicar
por razones de mayor exposición
al riesgo. En
algunos mataderos se ha comprobado que los obreros
serológicamente negativos y con poco tiempo de empleo se
infectan más rápidamente.

TRATAMIENTO

En el hombre se han usado sulfas y varios
antibióticos, tales como la penicilina, el cloramfenicol,
la erictomicina, la novobicina, etc. siendo la asociación
de estreptomicina (vía intramuscular) y la tetraciclina
(vía oral) la que ha proporcionado los mejores
resultados.

CONTROL DE ENFERMEDAD EN EL HOMBRE.

Por ser la brucelosis una enfermedad que raramente se
transmite de persona a persona
y son los animales domésticos sus principales reservorios,
el control debe dirigirse a la eliminación de la misma en
dichos reservorios, con medidas como la vacunación de las
terneras con Cepa 19, la eliminación o segregación
de reaccionantes y la pasteurización de leche y productos
lácteos.

Ha sido demostrado completamente que al disminuir la
infección en los animales, se reduce de la misma forma, la
enfermedad en el hombre.

Prevención y control:

La brucelosis es principalmente una enfermedad de
animales domésticos y salvajes, siendo el hombre solo
accidentalmente infectado con una infección terminal que
no se trasmite a otros. Por lo antes dicho, el control de la
enfermedad humana depende de eliminación del riesgo de que
se extienda la enfermedad desde los animales al
hombre.

El riesgo de la infección a través de la
ingesta de quesos, leche y otros productos lácteos, puede
controlarse mediante la esterilización o
pasteurización de utensilios de la leche.

Antecedentes

Hurtado y col. (2005) publicaron un estudio sobre
Determinación de los parámetros
físico-químicos de la leche bufalina en un sistema de
producción orgánica.

El objetivo de la
investigación fue el de evaluar el efecto del mes y
año sobre los parámetros
físico-químicos de la leche de búfala en un
sistema de producción orgánica del Magdalena medio
colombiano.

Fueron analizados un total de 210 muestras de leche
bufalina, colectadas durante 4 años (2000-2003), con un
promedio de 4 muestras mensuales. Se realizaron análisis
de varianza para las constituyentes de leche bufalina. Los
porcentajes de grasa variaron entre 6.65 a 7.36%, sólidos
no grasos entre 9.57 a 10.75% y sólidos totales entre
16.17 a 17.66%, punto criogénico entre -0.549 a -0.529, y
densidad entre 1.0339 a 1.0351. Todo esto confirmó que los
componentes físico-químicos varían a lo argo
del año.

Méndez y col. (2002) publicaron un estudio sobre
Brote de brucelosis debido al consumo de queso de cabra fresco
sin higienizar en Andalucía (España),
enero a marzo de 2002. El objetivo fue identificar el
vehículo y el origen de la infección, describir las
circunstancias del brote y establecer medidas de
control.

En primer lugar, se estableció una
búsqueda activa de casos mediante entrevista a
todos los médicos generales de los centros de salud de las
zonas afectadas, se estableció un protocolo para
identificar casos asintomáticos en personas expuestas a
casos sospechosos, se llevó a cabo un estudio descriptivo
inicial, se diseñó un estudio de casos y controles
en base a los resultados preliminares.

El aislamiento de brucella del mismo serotipo en
todas las muestras y el hecho de no producirse más casos
tras agotarse el lote implicado de quesos sin higienizar,
evidencia a éste como el origen del brote. Se
identificaron dos puntos diferentes de distribución de los quesos sin higienizar:
La explotación y un vendedor ambulante. La mayoría
de los casos entrevistados señalan a La explotación
como el sitio de adquisición de los quesos
infectados.

Valbuena y col. (2001) publican la Evaluación
de la eficacia de un
método de aislamiento para Brucellas abortus en
quesos no pasteurizados procedentes del Estado Táchira.
Como objetivo general se evaluó la eficiencia de un
método para el aislamiento de Brucella abortus en
quesos artesanales no pasteurizados procedentes de la zona Norte
del estado Táchira.

Para dicho estudio se recolectaron 12 muestras cada 8
días provenientes de 4 fábricas de queso
artesanales en 4 muestreos, para un total de 48 muestras. El
método de aislamiento consistió en moler 250 g de
queso y pesar una submuestra de 25 g y se adicionó a 225
ml de agua peptonada
al 0,1 % con NaCl al 0,85% y Tween 80 al 2%, se
homogeneizó en el Stomacher® y se sembró en el
medio Kusdas y Morse con 25000 U.I. /l de Bacitracina; 600 U.I.
/l de Polimixina y 0,72 g/l de Benomil. La incubación se
realizó en una atmósfera con 10% de
CO2 a 37°C por 48 horas. Para la
identificación de las cepas se utilizaron pruebas
bioquímicas y serológicas.

Se obtuvo el aislamiento de Brucella abortus en 27
muestras de queso equivalente al 57% del total de las muestras
con recuentos de aerobios menores a 50×106 ufc/g y ausencia con
recuentos mayores, indicando la influencia de la carga microbiana
del queso sobre la supervivencia de Brucella. En
conclusión se demostró la eficacia del
método aplicado en esta investigación para el
aislamiento de cepas de Brucella en quesos y el riesgo potencial
de los quesos como fuente de transmisión de enfermedades
zoonóticas para el hombre.

López y col. (1995), en su estudio sobre
Diagnóstico de brucelosis bovina en leche por el Ring
Test y ELISA en
lecherías de la provincia de Ñuble (VIII
Región). Este trabajo tiene como objetivo determinar la
eficiencia de la prueba ELISA en el diagnóstico de la
brucelosis bovina en leche a partir de estanques enfriadores,
comparándola con la prueba del RT y la
determinación de la prevalencia predial en los principales
planteles lecheros de la provincia de Ñuble,
Chile.

El estudio fue realizado con 60 muestras
correspondientes a 60 predios lecheros de la provincia de
Ñuble (VIII Región de Chile). Las muestras fueron
recolectadas durante los meses de noviembre y diciembre de 1995,
meses que corresponden a la mayor recepción de leche por
parte de las plantas lecheras,
representado por el mayor número de animales que se
encuentran en producción. Los predios fueron clasificados,
según el número de animales en lactancia al
momento de la toma de muestra, en tres grupos: estrato A
(menos de 50 vacas) con 17 predios, estrato B (entre 50 y 100
vacas) 27 predios y estrato C (entre 100 y 150 vacas) con 16
predios. Se recolectaron 50 ml de leche en frascos de plástico
estériles, previa agitación en el estanque de
frío durante 10 minutos, y mantenidos en refrigeración a 4° C por 24 horas. Para
la prueba del Ring Test, el antígeno utilizado se obtuvo
desde el Instituto de Microbiología de la Universidad
Austral de Chile. Para la realización de la prueba fueron
extraídos del frío, tanto las muestras como el
antígeno, hasta alcanzar la temperatura ambiental. Se
depositó 1 ml de leche en un tubo Khan y se agregaron 33
µl de antígeno mezclado por inversión varias veces e incubado a 37°
Celsius durante 1 h. Las muestras fueron leídas,
clasificándose como positivas, positivas débiles y
negativas. Para la prueba de ELISA se realizó como lo
descrito por el fabricante del kit Chekit®
Brucellotest de Hoescht que utiliza microplacas previamente
sensibilizadas con el antígeno inactivado,
monofásico de B. abortus. Se depositaron 200
µl de las muestras de leche en cada uno de los pocillos de
la microplaca por duplicado. Como controles positivos y negativos
se utilizaron los proporcionados por el kit, 200 µl y
diluidos 1:2 y fueron incubados por 90 minutos a temperatura
ambiente en
cámara húmeda. Luego de la fase de lavado, se
depositaron 200 µl de conjugado monoclonal Anti-IgG
peroxidasa bovino diluido 1:200 en cada uno de los pocillos e
incubado por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente del
segundo lavado, se agregaron 200 µl del cromógeno
proporcionado por el kit. Los resultados fueron leídos en
un espectrofotómetro a 405 nm (Dynatech®).
Las Densidades Ópticas (DO) de las muestras problemas en
duplicado fueron promediadas y corregidas por sustracción
de la DO del control negativo, estas fueron divididas por las DO
de los controles positivos por 100. Se consideraron muestras
positivas sobre 100%, positivas débiles o dudosas, entre
70% y 100% y negativas, bajo 70%.

Del total de predios en estudio, 28.33% corresponden al
estrato A (menos de 50 vacas en lactancia), 45% al estrato B
(entre 50 y 100 vacas) y 26.67% al estrato C (entre 100 y 150
vacas). Los resultados obtenidos por ambos métodos
fueron similares, 18 muestras positivas y 42 negativas. La
diferencia se estableció en 5 muestras (8.3%) que fueron
clasificadas como positivas débiles al Ring Test y
confirmadas como positivas por ELISA. Se determinó que la
prevalencia predial de brucelosis bovina fue de un 30% en predios
lecheros con estanque enfriador en la provincia de Ñuble.
El método de ELISA resultó ser una prueba confiable
para diagnosticar brucelosis bovina en leches
colectivas.

Ruelas y col. (1999) desarrollaron un estudio denominado
desarrollo y estandarización de una prueba de Elisa
indirecta para brucelosis ovina. El presente trabajo fue
diseñado con el objetivo de desarrollar y estandarizar una
prueba de ELISA indirecta (ELISA-I), utilizando como
antígeno, el extracto salino de una cepa nacional
Brucella ovis, y evaluar su aplicación para la
detección de anticuerpos específicos a B.
ovis.

El antígeno (extracto salino) de Brucella
ovis, fue preparado a partir de una cepa aislada de un
carnero con epididimitis clínica procedente de una empresa
ganadera de la sierra central del Perú. La prueba ELISA-I
fue validada examinando 74 sueros positivos procedentes de
carneros con epididimitis clínica y positivos al
aislamiento bacteria y 75 sueros negativos procedentes de
carneros sin lesiones testiculares.

Las estandarizaciones determinaron los siguientes
parámetros: uso de microplacas de poliestireno de 96
celdas de fondo plano, dilución del conjugado (1:2 000),
dilución del antígeno (1:400), dilución de
los sueros (1:200). Los valores
máximos del coeficiente de variación (CV) intra e
interplaca fueron 16.07% y 15.95%, respectivamente. El
análisis de las características del
operador-receptor (ROC) indicó que el punto de corte se
encuentra en 23.89 % de positividad (PP). Consecuentemente
ELISA-I tuvo una sensibilidad diagnóstica del 97.3% y una
especificidad diagnóstica del 98.6%. Se concluye que la
prueba desarrollada es una buena alternativa diagnóstica
para brucelosis ovina.

Mariño y col. (2001), realizaron un estudio
llamado evaluación de metodologías
diagnósticas para brucelosis en población de
búfalos del Magdalena Medio, Colombia. El
objetivo general de este trabajo fue el determinar el comportamiento
de diferentes pruebas serológicas utilizadas para
diagnosticar la brucelosis en la especie bufalina.

Para dicho estudio se analizaron 1400 sueros de
búfalos mayores de 2 años provenientes del
Magdalena Medio, bajo condiciones de manejo de la región y
con vacunación reglamentaria entre los 3 y 9 meses de edad
con B. abortus cepa 19. Se realizó seguimiento de dinámica de anticuerpos a un grupo de 20
búfalos crías vacunados a la edad reglamentaria. Se
realizaron pruebas serológicas de aglutinación Rosa
de Bengala, fijación de complemento y ELISA Competitiva a
la totalidad de los sueros. En la fase inicial, 822 sueros fueron
trabajados además por las técnicas de ELISA
Competitiva modalidad cadena-O e inmunodifusión
radial.

Los resultados preliminares indicaron correlación
(r = 0.8728) entre las pruebas de ELISA modalidad cadena-O y
sLPS, razón por la cuela los estudios se complementaron
con base en la modalidad sLPS de aplicación común
actualmente. La prueba de inmunodifusión radial
presentó baja sensibilidad desde el inicio y, por
consiguiente, no se mantuvo su utilización. En la
población estudiada, la evaluación comparativa de
las serologías con respecto a la prueba de referencia,
fijación de complemento (para bovinos e igualmente
aceptada para la especie bufalina), confirmó la menor
sensibilidad diagnóstica de la prueba Rosa de Bengala.
Según lo esperado, se evidenciaron las ventajas de la
prueba ELISA Competitiva con sensibilidad del 96.7% y especificad
del 94.28%, además de una confiabilidad mayor al 92%,
características que la sugieren como herramienta a escoger
para apoyo a un programa de
control y erradicación de la brucelosis en la
población estudiada.

Sequera y col. (2002), presentaron un trabajo en el
cuarto congreso de ciencia y
tecnología del Estado Portuguesa denominado
"Prevalencia de la brucelosis en fincas ganaderas del Estado
Portuguesa.

La selección
de las fincas y animales a muestrear se realizó de forma
aleatoria y el tamaño de la muestra se calculó
utilizando la formula Ziggman para población infinita,
ajustando un 10% para obtener una muestra representativa
estadísticamente.

Para ello se visitaron 10 fincas de los diferentes
municipios del Estado y fueron muestreados 2885 bovinos
encontrándose una prevalencia del 5,54% de animales
positivos para el Estado Portuguesa, y 11,16% de animales
sospechosos a las pruebas de diagnóstico
serológicos realizadas. Por municipios, la mayor
prevalencia encontrada está en Esteller con 15,08%,
Guanarito con 10,08%, Sucre con 10%, Ospino con 6,41%. Por tipo
de explotación, se determinó que las fincas doble
propósito fueron las que presentaron una mayor prevalencia
con 7,56%, las de carne con 5,76% y las de leche con 2,71%. El
análisis estadístico realizado mediante la prueba
J2 mostró diferencias significativas (P <
0,05) entre fincas por tipo de explotación. El 38,46% de
las fincas visitadas presentaron animales positivos. Estos
resultados indican una alta proporción de animales
infectados y representan un riesgo alto para la salud animal y
humana. Un alto porcentaje de fincas (31%) no vacunan sus
animales contra esta enfermedad.

Por otro lado Paublini (1978) en su guía sobre
brucelosis señala que esta enfermedad es conocida en
Venezuela desde el año 1898 cuando Mosquera
describió el caso de un paciente procedente de Alemania. El
primer aislamiento de Brucella se realizó en
Caracas en 1939. En 1940 Landaeta y col. identifican el primer
caso autóctono en el país aislando mediante
hemocultivo B. abortus en un paciente de 27 años
procedente de Calabozo Estado Guarico.

En 1941 Briceño realizo una encuesta en
1963 pacientes febriles de Caracas encontrando una positividad
del 0.2% mediante aglutinación. Cuando se investigaron los
grupos a riesgo, los resultados fueron diferentes. Fossaert
(1955), encuentra un 19.5% de positividad en pacientes febriles
que trabajan en haciendas ganaderas del centro del país.
En 1966 Novoa Montero encuentra en trabajadores de haciendas
completamente asintomáticos del Distrito Colon Estado
Zulia una positividad de 7.26%. En este mismo grupo los "caveros"
(trabajadores que cargan carne ya preparada a los camioneros)
dieron una positividad de 20.5%.

Bello (1973) encuentra un 15.2% de positivos en personal
de mataderos de los estados Barinas, Portuguesa y Zulia y un 20%
en pacientes febriles en riesgo de infección. Andrade
(1973) trabajando con personal de mataderos y fincas lecheras del
estado Lara ha encontrado entre un 7 y 10% de positividad,
utilizando métodos de aglutinación en tubos y
fijación del complemento.

Conceptualización de la
Variable

CAPÍTULO
: METODOLOGÍA

TIPO DE ESTUDIO

El tipo de estudio se adapta a la modalidad de un
estudio evaluativo de campo, puesto que su objetivo es
Determinación de Brucella en leche de búfala
producida en fincas ubicadas en el municipio Guanarito del estado
Portuguesa

POBLACIÓN Y MUESTRA

Según la universidad Pedagógica
Experimental Libertador (UPEL) define la población como
"el conjunto de personas, animales o elementos de los cuales
pretendemos indagar y conocer sus características o de una
de ellas y para el cual serán validas las conclusiones
obtenidas en la investigación. (p.122)

Bajo esta consideración, la población en
estudio estuvo conformada por las 14 fincas productoras de leche
de búfala ubicadas en el municipio Guanarito del estado
Portuguesa.

El muestreo
según Arias (1999) lo define como: "el procedimiento en
el cual todos los elementos tienen la misma probabilidad de
ser seleccionado y se basa en la división del universo en
unidades menores, para determinar luego las que serán
objetivos de
investigación o donde se realizara la selección
(p.97)

Según Skins (2004), el tamaño de la
muestra depende de la precisión que se quiera conseguir en
la estimación que se realice a partir. Para su
determinación se requieren técnicas estadísticas superiores, pero tomando en
cuenta siempre las variables y limitaciones que se puedan
presentar para la determinación de dicha muestra, en la
cual se acepta que la muestra esté representada por el 25
o 30% de la población total. Por otra parte resulta
sorprendente como, con muestras notablemente pequeñas, se
pueden conseguir resultados suficientemente precisos, por lo
tanto se seleccionaron 6 fincas (42,86% de la población
total) utilizando para esto un recipiente en el cual se
introdujeron los nombres de las fincas y se seleccionaron
garantizando que todas tuvieran la misma probabilidad de ser
elegidas.

DISEÑO DE LA MUESTRA

El diseño
estadístico a utilizar es una t- student donde se tomara
una población y la variable respuesta es cuantitativa, lo
que supone que la población posee una distribución
normal determinándose el tamaño de la
muestra

El objetivo del proceso de recolección de muestra
es determinar la presencia de Brucellas en leche de
búfala producida en fincas ubicadas en el Municipio
Guanarito del Estado Portuguesa.

TÉCNICA DE RECOLECCIÓN DE
DATOS

Según Rodríguez (2001), las
técnicas de recolección
de datos se definen como "La parte del método que en
un procedimiento o conjunto de procedimientos, regulado y
previsto de una determinada eficacia" (p 107).

La técnica utilizada para la recolección
de datos fue a
través de entrevistas
informales con los médicos veterinarios del departamento
de producción animal del Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (INIA), y con médicos veterinarios del
Municipio Guanarito los cuales tienen experiencia en este tipo de
investigaciones.

Las muestras se tomaron en cada una de las
cántaras o envases obtenidos en el ordeño del
día. Se agitó el contenido de las cántaras
para asegurar que la leche estuviese homogenizada, luego
utilizando una pipeta de 10 ml. se extrajo la muestra y se
depositó en tubos de ensayo
utilizando uno por cántara. (ver anexo 2)

PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS DE
LA MUESTRA

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE EN TITULO FINAL
(*)

1. REACTIVOS NECESARIOS

1. Antígeno para la prueba del anillo en
   leche.
2. Leche total negativa para Brucelosis procedente de 25
   animales o más.

1. EQUIPOS NECESARIOS.

1. Pipetas de 1,0 ml.
2. Jeringas automáticas de 2,0 ml. con
   cánula de 3 ó 4 pulgadas o aguja calibre
   16.
3. Tubos de ensayo de 11,0 x 100 mm.
4. Gradillas para sostener los tubos de
   ensayo.
5. Incubadora (37,5 o C)

1. PROCEDIMIENTO

PRUEBA DE TAMIZ (SCREENING)

1. Colocar tubos de ensayo de 11,0 x 100 mm. en
   gradillas e identificar cada uno de modo que corresponda a las
   muestras de leche. (ver anexo 3)
2. Utilizando una pipeta de 1,0 ml. colocar 1 ml. de las
   muestras de leche a ser examinadas en cada tubo.
3. Con una jeringa automática agregar 1,0 ml. de
   leche entera total negativa para brucelosis.
4. Agregar dos gotas (0,06 ml.) de antígeno para la
   prueba del anillo en leche a cada tubo.

   (*) Holm, G.C.; Eveleth, O.F., and Rheault, P.L.; A
   Dilution Method for the Milk Ring Test in Bovine Brucelosis
   Detection Vet. Med. 45, (1950): 400-404

5. Mezclar bien colocando el dedo mayor sobre la parte
   superior del tubo y agitarlo fuertemente. Entre una y otra
   muestra secarse el dedo con una toalla.
6. Colocar las gradillas con los tubos en una incubadora
   (37,5 º C) durante una hora.
7. Leer las muestras y realizar la dilución
   seriada para la prueba del anillo en leche en las muestras
   positivas.

PROCEDIMIENTO ESTADÍSTICO

El estudio de distribución
estadísticos para muestras pequeñas se denomina
teoría de muestras pequeña menores a 30 muestras.
Sin embargo un nombre mas adecuado seria teoría exacta del
muestreo ya que los resultados que se obtienen son validos tanto
para muestras grandes como para muestra
pequeña.

Por esta razón se realizará en este
estudio una distribución de t- student porque las muestras
en estudios son menores a 30.

Murray (2002), llama a la t-student en honor de su
descubridor W.S.GOSSETT; quien publicó sus trabajos bajo
el pseudonimo student en los inicios del siglo XX. para valores de V o
N (ciertamente N ≤30) se aproximan mucho a la curva normal
estandarizada.

CAPÍTULO
ІV: ANÁLISIS DE
RESULTADOS

Análisis de
resultados

Una vez recopilados los datos, se procede a preparar una
serie de estadísticas que permiten la elaboración
de tablas con su respectivo análisis e interpretación a cada muestra recolecta a
razón de establecer las conclusiones.

El cuadro 4, presenta en promedio de producción
diario de leche de búfala en las fincas muestreadas. Es
importante mencionar que la totalidad de dicha producción
es destinada para la elaboración de queso, ya sea
directamente en las fincas o en las distintas receptorias que se
encuentran en el municipio.

Cuadro 4: Promedio de producción diario de
leche en las fincas muestreadas.

En el cuadro 5, se muestra los resultados de la leche
analizada el cual reflejó que en las fincas muestreadas no
existe presencia del microorganismo en estudio, esto es de gran
relevancia ya que se demuestra que los productores han tomado
conciencia en
cuanto a medidas para prevenir esta enfermedad en sus
rebaños, cumpliendo así con lo establecido por el
Ministerio de agricultura y cría en la resolución
de la campaña contra brucelosis (ver anexo 7).

Cuadro 5: Resultado del
análisis de presencia de Brucillas

Leyenda: 1 Positivo; 2 Negativo

CAPÍTULO V:
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

• La totalidad de las fincas en el Municipio destinan
  su producción de leche a la elaboración de
  queso.
• De las seis fincas seleccionadas para el muestreo,
  solamente dos de ellas elaboran quesos dentro de sus
  instalaciones. Las demás fincas venden la leche a las
  receptorías para su posterior transformación en
  queso.
• La producción total de las fincas muestreadas
  es de 2029 lts/día.
• En todas las fincas analizadas para determinar la
  presencia de Brucellas abortus los resultados fueron
  negativos, lo que quiere decir que en dichas fincas se realiza
  el control preventivo para mantener los rebaños
  protegidos del microorganismo.

RECOMENDACIONES

• Realizar este tipo de análisis cada seis meses
  para mantener un control, lo cual garantiza la calidad de la
  leche en este aspecto.
• Utilizar personal obrero con certificado de salud
  (vigente), para garantizar que la persona que manipula el
  alimento es sana.
• Ofrecer conferencias, charlas y cursos en las
  respectivas asociaciones de ganaderos para demostrar lo
  importante que es mantener los rebaños
  sanos.
• Las receptorias deben recolectar la leche en tanques
  cisternas para llevarlas a sus instalaciones, en lugar de
  hacerlo en tobos plásticos que es como lo hacen
  actualmente, ya que esto es una mala práctica de
  recolección al exponer la leche al polvo y a otros
  agentes contaminantes. (ver anexo 4 y 5)
• Exigir al personal obrero (ordeñadores) que
  utilicen los equipos mínimos requeridos para un
  ordeño higienizado evitando la
  contaminación de la leche. (ver anexo 6
  )

BIBLIOGRAFÍA

• Arias, F. (1999). El proyecto de
  investigación. Guía para su
  elaboración. Episteme, Caracas-Venezuela.

• Bohórquez, N. (2001). Curso sobre
  actualización de brucelosis como problema de salud
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  veterinarias, Maracaibo.

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  internacional sobre brucelosis. Maracay, Venezuela

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  Determinación de parámetros
  físico-químicos de leche

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Disponible: http//
[Consulta: 2005, agosto 25]

• Méndez, C.; Páez, A.; Cortés,
  M.; Salmoral. E.; Mohedano, E.; Plata, C.;

Varo B. (2002). Brote de brucelosis debido al consumo
de queso de cabra fresco sin higienizar en Andalucía
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http://www.google.com.ve/brote/brucelosis.htm
[Consulta: 2003, Julio 12]

• Organización Mundial de la salud (1979).
  Informe de
  comité mixto

FAO/OMS de expertos en brucelosis. Ginebra.

• Paublini H. (1978). Guía sobre brucelosis.
  Caracas.
• Ramos, M. (2001). Pruebas complementarias para el
  diagnostico serológico de la brucelosis. Centro
  Panamericano de Zoonosis.
  Buenos
  Aires.

• Ruelas C. y Raúl Rosadio A. (1999). Desarrollo
  y estandarización de una prueba de ELISA indirecta para
  brucelosis ovina. Revista de
  Investigaciones Veterinarias de Perú;
  10(2):43-55.

• Sequera, W; Pedrique, C; Medina, A; Paz, M; Perdomo,
  G; Colmenarez, M; Mendoza, E. (2000, Octubre). Prevalencia de
  la brucelosis en fincas ganaderas del estado
  Portuguesa.

Ponencia presentada en el IV Congreso de Ciencia y
Tecnología
del Estado Portuguesa.

• Skins, D. (2004) Métodos de muestreo
  [Documento en línea] Disponible:
  http://buscador.rincondelvago.com/métodosdemuestreo.
  [Consulta: 2006, marzo 22]

•  

  Universidad del Zulia (1997). Curso de
  actualización sobre brucelosis bovina.
  Maracaibo.

• Universidad Pedagógica Experimental Libertador
  (1998). Metodología de la investigación.
  Caracas, Venezuela.

Autor:

Herrera Rafael

Hoyos Orlando

Rivas Aarón

TUTOR: Prof. Nicolás Arias

Fecha: Marzo del 2006