Aislamiento, caracterización y actividad biológica de polisacáridos microbianos (página 2)

Estos métodos
son muy efectivos para eliminar proteínas,
ácidos
nucleicos, otros polisacáridos (quitina, manano,
glucógeno) y lípidos.
  Sin embargo se reportan la presencia de ácidos
grasos derivados de levaduras en el  b(1,3)  D-glucano,
como   ácidos grasos no saturados y saturados de
16 a 18 carbono, que
se encuentran en pequeñas proporciones en los b – glucanos
aislados de levadura, particularmente de S.
cerevisiae  y pueden ser eliminados mediante
extracciones sucesivas calientes de
etanol.         

Los glucanos se caracterizan por su particular actividad
inmunoestimulante y por su notable seguridad por la
ausencia de impurezas las cuales son frecuentemente asociadas a
este polisacárido.   

Se reportan b- glucanos con actividad biológica de
S. cerevisiae  y Candida albicans
  con las características de tener un contenido
de b  glucano de 95-97 % , de quitina de 3,5 % y no se
reportan manano; el contenido de proteínas es menor que
0,3% : La relación entre los enlaces b (1,3) y b (1,6) es
igual o cercano de 1.1.

3. Características Físico- Química de los
glucanos particulados aislado de S. cerevisiae
  

—Análisis elemental.

El glucano aislado de S. cerevisiae revela una
composición (mol %) de 40.03% de carbono, 6.72% de
hidrógeno, 49.9% de oxígeno
y menor del 0.5 % de nitrógeno y azufre.  

— Solubilidad  

Parcialmente soluble en 1M NaOH (0.66%).

Soluble en Dimetilsulfóxido.

Insoluble en agua, metanol,
etanol, acetona, cloroformo.

–Reacción de color  

Reacción antrona- ácido sulfúrico:
Positivo. 

Reacción  fenol- ácido sulfúrico:
Positivo . 

Reacción carbazol: Negativa.

Reacción ninhidrina; Negativa

–Apariencia:

Después de liofilizado se observa un polvo
blanco. 

— Componentes en azúcar.  
    

Es completamente hidrolizado por la acción
de ácidos inorgánicos y orgánicos. El
resultado es analizado por cromatografía en papel, gaseosa y por el
método
glucosa–
oxidasa y se comprobó que es un monosacárido del
tipo D- glucosa  

 Otras características Físico-
Química son referidas en la tabla 1 con el empleo de
cromatografía de exclusión de alta
resolución (HPSEC)  en línea con su
fotómero de ángulo múltiple con luz láser (
Malls) y un viscosimetro
diferencial.     

TABLA  N° 1. Promedio de los
pesos moleculares, y otras características
físico-químicas del  b (1, 3) glucano
insoluble deSaccharomyces cerevisiae  

4. Análisis conformacional  de los b
-glucanos. 

Entre las técnicas  físicas que
más ampliamente han contribuido al estudio de las
conformaciones de los polisacáridos, cuatro son
singularmente importantes. Se trata de la difracción 
de los rayos X, la
resonancia magnética nuclear,  la
espectrometría  de masa y la espectrometría
infrarroja  

4.1. Difracción de rayos X

Los sólidos ordenados ocasionan una difracción
tridimensional de los rayos X, si la longitud de onda de la
radiación
es el mismo orden de magnitud que las distancias
interatómicas, tal método ha dado excelentes
resultados en los que conciernes de las estructuras
glucosidicas, tanto para las osas como para los
polisacáridos.
           

Se pueden obtener estructuras polisacáridos fibrosas en
capas orientadas por desecación sobre cristal de soluciones
concentradas de estos productos.
Estas fibras se presentan entonces localmente como alteraciones
de zonas cristalinas y amorfas. Las zonas cristalinas tiene un
eje principal paralelo al eje de la fibra, los otros eje de la
fibra están orientados perpendicularmente al eje
principal.         

Si un has monocromático de rayos X atraviesa tal
estructura,
sufre difracciones análogas a los que
impondría  un cristal único que girase
alrededor del eje de la fibra, creando así interferencias.
Se obtiene entonces sobre una pantalla diversos impactos de haces
que corresponden a difracciones meridionales o ecuatoriales. Las
distancias entre los primeros permiten calcular las dimensiones
de las unidades glucosidicas elementales, mientras que los
segundos dan una idea vasta exacta de las difracciones
repetitivas alrededor del eje (hélice, por ejemplo) Los
xilanos estudiados por difracciones de rayos X están a
favor de una organización de triple hélice. Los
glucanos aislados de levadura de S. pombe y S.
cerevisiae  fueron estudiados mediante esta
técnica determinando una estructura estable de triple
hélice. 

4.2    Resonancia magnético-
nuclear.

La resonancia magnético nuclear (RMN) juega un papel
importante en la elucidación estructural de cualquier
compuesto, conjuntamente con la espectroscopia infrarroja (IR).
Esta se fundamenta en las propiedades magnéticas de los
núcleos atómicos. La frecuencia de resonancia de un
conjunto de protones (H+) que forman parte de un sistema molecular
depende del entorno electrónico de los mismos. Se estudian
los espectros RMN según tres parámetros,
desplazamientos químicos, acoplamiento
espín-espín y movilidades de
estructuras.       

Los más utilizados son los espectros de protón
1H  y del C13 .Un gran
número de conformaciones de los polisacáridos se
conocen gracias al espectro RMN, como por ejemplo, las
clasificaciones de las levaduras en función de
la conformación de sus polímeros de manosa. La RMN
de C13  ha dado, desde 1969, excelentes
resultados para diversos glucósidos en los que algunos de
los átomos de carbono había sido objeto de un
enriquecimiento isotópico
           

El b-glucano aislado de S. cerevisiae,
polisacáridos insolubles fue estudiado mediante RMN
  y se reportó su caracterización
espectral y la determinación estructural. La
espectroscopia C13  RMN fue utilizada para
determinación de los grados de ramificación en los
b- glucanos de esta levadura. Se pudo constatar que no existen
ramificaciones y que están conformadas por enlaces tipo
b(1,3); en otros casos de b- glucanos de otros orígenes
reportados, se detecta generalmente hasta 4% de ramificaciones.
En el espectro se observaron seis señales
de carbono (tabla 2) que coinciden con los reportes de otros
polímeros  de b- glucano.   

TABLA N° 2. Señales
químicas del espectro de RNM C13  de
glucanos insolubles en Me2  S06
 deuterado

 expresados en ppm.

4.3    Espectrometría 
infrarroja.

La espectrometría  infrarroja ha encontrado 
interesantes aplicaciones en los estudios de conformación
de los polisacáridos. Entre los numerosos ejemplos 
de esta posibilidad se puede citar determinaciones de las
configuraciones anoméricas, las configuraciones axiales o
ecuatoriales de los sustituyentes, etc. El espectro
también es sensible a las interacciones entre grupos.     

El análisis estructural de los b- glucanos se ha
basado, en parte, en sus espectros infrarrojos. Aunque este es
característico de la molécula entera, las
estructura anoméricas (a y b)  y tipos de enlaces
b(1,3) ,(1,6) ,(1,4) dan lugar siempre a bandas en
determinados  intervalo de frecuencia, independiente de la
naturaleza del
resto de la molécula .    

La permanencia  de estas bandas características
permite una amplia utilización de la
espectrometría  IR en la observación  de información estructural por simple
inspección del espectro y el uso de tablas de frecuencias
de grupos
característicos.     

La absorción máxima de 890 cm.
-1   indica la existencia de enlaces
glucosidicos, que  significan que los residuos de la glucosa
están unidos de forma b(1,3), pueden aparecer  bandas
a los 920cm-1 que identifican  a los enlaces
b(1,6), bandas a los 850 cm. -1   que
representan la presencia de enlaces a anoméricas y bandas
a 1645 cm. -1    de b(1,4) 
identificados como quitina.  

4.4     Espectrometría de
masa.

La espectrometría de masa permite identificar una
muestra,
inferir la estructura de un compuesto desconocido, estudiar la
pureza de una muestra y analizar cualitativa y cuantitativa una
mezcla. Este procedimiento  puede ser de ionización
química positiva o ionización química
negativa y es específico para cada
compuesto.    

Se expresa, sobre un diagrama de
fragmentación especifico del compuesto, el 
número de iones obtenidos en función de su peso
molecular. Acoplada  a la cromatografía en fase
gaseosa, la espectrometría de masa viene dando resultados
desde hace más de  20
años.     

   El b(1,3) glucano , Aureobasillan, aislado
de Aureobasidium pullulam mediante esta técnica se
caracterizó  y se determinó su peso molecular
y la posición de las unidades de D-glucosa y sus radios
moleculares. La cromatografía  gaseosa y la
espectrometría de masa se emplean para detectar en
el  b(1,3)  glucano  insoluble contenido de
lípidos, impureza con mayor frecuencia y se han encontrado
hasta un 45% de lípidos con relación al
glucano.     

5.  Solubilización  de los
b -glucano particulados.

Los b(1,3)  glucano con actividad biológica pueden
ser solubles e insolubles en agua   El aislado de S.
cerevisiae  se caracteriza por ser soluble en agua y en
muchos solventes orgánicos por lo que los estudios se han
dirigido a su solubilización del mismo para sur empleo en
medicina
humana. Preparaciones solubles no fosforiladas obtenidas mediante
hidrólisis  con ácido fórmico
demostraron  que se obtienen un  bajo rendimiento
además de la diversidad de las fracciones alcanzadas por
este método hacen que estas preparaciones no sean
aplicadas  con fines profilácticos y
terapéuticos     

Otro método  empleado  para  la
solubilización  de glucano particulado fue realizado
 con dimetilsulfóxido (DMSO), relajante molecular que
actúa sobre las configuraciones tipo hélice de las
moléculas. Estas preparaciones resultaron tóxicas
al ser inoculadas en animales de
laboratorio.    

 Posteriormente, se realizó una
precipitación del glucano en la soluciones de DMSO, 
añadiendo etanol al 100%, la precipitación se
colectó y liofilizó. Cuando este glucano
liofilizado fue añadido al agua, el glucano particulado se
reformó.    

Sin embargo, todo intento de convertir las preparaciones de
glucano neutral en preparaciones polares mediante la
adicción de grupos fosfatos y sulfatos, así como la
acetilación han resultados infructuosos.  

  Se han estudiado modificaciones en el método de
solubilización con DMSO en presencia de urea para la
ruptura estructural, seguido de una fosforilización de
cada una de sus simples cadenas, obteniendo un   b
-glucano  soluble en agua no tóxico, no
inmunógeno, apirogénico y capaz de realizar
profundos cambios en la respuesta inmunológica cuando es
administrado  in vivo en animales y en  humanos.
 

6. Actividad inmunológica del
b(1,3)  glucano.

El glucano es descrito por varios autores como potente
inductor de los mecanismos no específicos de defensa del
hospedero, modulador de la inmunidad celular, humoral y del
sistema reticuloendotelial

Diversos b(1,3) D- glucano estimulan varias facetas de la
respuesta inmunológica en animales y en humanos. Se
describen la actividad antitumoral de preparaciones insolubles de
b(1,3)  glucano en modelos de
animales de laboratorio y demuestran que la administración intravenosa en ratas
modifica el curso de enfermedades
neoplásticas experimentalmente inducidas, evidenciando por
un aumento y proliferación de monocitos y
macrófagos.  Al estudiar la actividad
biológica de glucanos solubles sobre células
tumorales, en las que se observa un incremento en la actividad
citotóxica. Debido a sus características
inmunomoduladoras, el b(1,3)  glucano se incluye dentro de
los medicamentos modificadores de la respuesta biológica
MBR).            

 Su uso en humanos a partir de resultados
preclínicos y clínicos, indicaron efectos positivos
en la aceleración de cicatrización de las heridas y
úlceras, además decrecieron las incidencias y
secuelas sépticas en pacientes operados y con traumas
tratados con esas
poliglucosas.  

Su actividad como inmunoestimulante en animales es reconocida
en carneros y se observó la estimulación de
mácrofagos, polimorfonucleares neutrófilos y
linfocitos T.   Al evaluar su efecto en
comparación con levamisol en terneros se observó
una reducción de la incidencia de los procesos
respiratorios y diarreicos de los animales tratados con los 
dos inmunoestimulantes, así como la reducción del
tiempo del
cuadro clínico, mejorando los indicadores de
crecimiento, no se señalaron diferencias significativas en
las dos variantes evaluadas.  Se evaluó en terneros
la influencia de este biopreparado  sobre la actividad
reductora del nitro blue tetrazolium (NBT), elemento que
justifica el incremento de la resistencia a
enfermedades infecciosas de los terneros tratados con el
b(1,3)  glucano. Se evidencio, además, cómo
esta poliglucosa aplicada por  la vía intraperitonial
puede estimular la actividad de los PNM
neutrófilos. 

La administración de las preparaciones
solubles e insolubles de b(1,3)  glucano en animales
irradiados demostró un aumento de la actividad
hematopoyética, como fue la granulopoyesis,
monocitopoyesis y eritropoyesis .El efecto hematopoyético
del b(1,3)  glucano se correlaciona con el incremento de los
conteos de leucocitos en sangre
periférica, médula ósea, celularidad del
bazo, que refleja un aumento numérico granulocitos y
macrófagos.     

Un gran número de estudios revelaron que el
b(1,3)  glucano, particulado o insoluble, modifica
significativamente el curso de una gran variedad de enfermedades
infecciosas desarrolladas por bacterias,
virus,
hongos y
parásitos.

  Se ha  podido  obtener un aumento de la
sobrevivencia en modelos de animales infectados con
Escherichia.coli (que produce peritonitis y sepsis),
Candida albicans, Staphylococus aureus etc. Estos
resultados están relacionados con un aumento en la
actividad de fagocitosis por los macrófagos, así
como por el incremento en la actividad del suero lizosomal en
animales tratados.

Se describe que el b(1,3)  glucano  es un potente
adyuvante de vacunas
vírales, bacterianas, parasitarias  El  desarrollo de
una vacuna contra Trypanosoma cruzi utilizándolo
como adyuvante en ratones dio lugar a una protección
contra  esta infección. La inmunización de
glucano más T. Cruzi  incremento
significativamente la sobrevivencia y decreció los niveles
de parasitemia en sangre periférica de ratones, los cuales
fueron comparados con controles
apropiados.       

Se  han encontraron resultados similares en vacunas
parasitarias tales como Babesia microti y Schistosama
mansani, en vacuna viral de Newcastle y vacunas contra la
furunculosis en Salmón Atlántico.  El
mecanismo de acción esta relacionado con la actividad de
estimular la respuesta inespecífica, donde los
macrófagos y otras células inmunes están
involucrados.   

Los b  glucanos  tienen una potente actividad
antitumoral. Por ejemplo, se reporta que el b(1,3) 
glucano  particulado inhibe el crecimiento de tumores y
prolonga la sobrevivencia  en ratones lo que fue estudiado
en cuatro modelos de tumores murinos como adecarcinoma BW 10232,
carcinoma anaplasmático 15091A, melanoma
B16 y leucemia espontánea linfocitica BW 5147.  

Se ha estudiado la base celular de la actividad antitumoral
del b- glucano, la actividad antitumoral citotóxica de
macrófagos peritoneales de ratones controles e inoculados
con este glucano. Los resultados arrojaron que los
macrófagos peritoneales de ratones tratados produjeron una
respuesta citotóxica significativamente mayor en
comparación con los macrófagos normales

Además experimentos
in vitro  utilizando tumores y células
normales incubadas con b- glucano insoluble demostraron que
ejerce un efecto citotóxico directo  sobre las
células de Sarcoma y Melanoma y un efecto
proliferativo  sobre células del bazo y médula
ósea.  Estos estudios indicaron que el glucano,
cuando es administrado terapéuticamente podría
inhibir significativamente las metástasis
hepáticas, el crecimiento de tumores primarios, aumentar
la sobrevivencia, posiblemente por un incremento de las
células K, así como el efecto citostático
directo de este sobre las células del
sarcoma.         

Los mecanismos celulares y moleculares de estas modificaciones
de la respuesta inmune no están completamente
esclarecidos. Existen numerosos reportes acerca de los efectos de
la activación del b (1,3) glucano basados en
inmunomodulación de monocitos- macrófagos,
neutrófilos. Se ha reportado la unión de receptores
específicos en  monocitos- macrófagos,
neutrófilos, células NK y células
microgliales   También se notifica que activan
la señal de patrones de   y modula la
liberación de ciertas citoquinas  

7.  Correlación de la actividad
biológica del bD glucopiranosa de origen
microbiano con su estructura.

Por más de  30 años se han realizado
estudios de varios tipos de polisacáridos de diferentes
fuentes
microbiológicas como inmunomoduladores y se 
elucidó la relación existente entre las estructuras
de estos y la actividad biológicas. Según algunos
estudios realizados con  los polisacáridos
microbianos, los b (1,3) glucano de levadura especialmente los
que tienen cadenas con enlaces b-D glucosil, tienen fuerte
acción como antitumoral debido a la estimulación
del sistema inmune  

Las conformaciones de estos polisacáridos confirman que
sus actividades antitumorales están estrechamente
relacionadas con la estructura de triple  hélice
del   b (1,3) glucano. En varios estudios se
demostró la diversidad estructural de b-D glucanos de
origen fúngico  respecto a la distribución de las ramificaciones y sus
diferentes actividades antitumorales.  La conversión
de los grupos glucosil residuo  de un átomo 0-6
del enlace (1,3) D-glucosa por el correspondiente grupo
polihidroxil desarrolló un aumento de sus actividades
biológicas y a su vez la sustitución de los grupos
polihidroxil mediante un tratamiento medio con ácido
redujo su actividad
antitumoral.     

El mecanismo de acción de estos b-D(1,3) glucanos con
ramificaciones glucosil no  se ha esclarecido, pero si se
conoce que la estimulación de inmunopotenciación
relacionada a  la actividad de macrófagos, promueve
la diferenciación de las células T y aumenta la
actividad NK (Chihara, 1992).    

Se  esclarecieron mediante la resonancia magnética
nuclear del  C13 la
dependencia conformacional que produce cambios en la actividad
biológica de los  b (1,3) glucanos. Se observaron
tres conformaciones, simple cadena, simples hélices 
y triples hélices las cuales fueron distinguibles entre si
por  la alta resolución de los métodos
empleados, relacionando las actividades biológicas, que
fueron diferentes unas de otras, y se destacó que los
b(1,3) glucanos de triple hélices fueron más
fuertes sus actividades antitumorales.  

En este sentido,  la actividad de un b-D(1,3) glucano
triple y simple hélice (Schizophllan) en ratones confirman
que la actividad biológica e inmunofarmacológica
depende de la estructura de los glucanos, de su peso molecular,
de los grados de ramificación, de la conformación y
su uso clínico. La transformación de este glucano
triple hélice a simple hélice mediante tratamiento
alcalino demostró que algunas actividades como el efecto
antitumoral in vivo, la respuesta hematopoyética
sobre la ciclofosfamida inductora de leucemia, el efecto
antagonista zimozan mediador de la síntesis
del peróxido de hidrógeno sobre los
macrófagos peritoneales, fueron diferentes entre
ambos.        

Figrura 1. Obtención de los polisacáridos de la
pared celular de Saccharomyces cerevisiae,.

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Autora:

Ing. Lilian Sanchez

Grupo Desarrollo

Dirección de Producciones Biofarmacéuticas

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

Cuba.