En los últimos años hemos presenciado la
escasez de alimentos en el mundo, no solo por la
sobrepoblación mundial sino porque ciertos alimentos
básicos se están utilizando para la
elaboración de biocombustibles. Lo anterior ha generado un
alza de precios, principalmente en el trigo, el maíz y el
arroz, lo cual ha provocado que aumente la cifra de gente
desnutrida y la muerte por inanición en los países
más pobres como Haití y países del
continente Africano.
En el caso de México, la población ha
tenido que buscar nuevas opciones para complementar su
alimentación, reduciendo el consumo de trigo, maíz
y arroz, aumentando el consumo de otros de fácil
elaboración y que provoquen sensación de saciedad
rápidamente, aunque no sea lo más nutritivo para la
población. En general, la comida rápida se
caracteriza por tener un gran porcentaje de carbohidratos y grasa
y un mínimo de proteínas, vitaminas y minerales, lo
cual favorece la obesidad y otras enfermedades del tipo
crónico degenerativas.
Sin embargo, dentro de la alimentación mexicana
existe un tesoro que actualmente puede encontrarse en todo el
mundo, es de fácil cultivo, tiene un delicioso sabor, es
muy nutritivo y cuenta con un precio accesible, dicho alimento es
el frijol.
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.)
en nuestro país es un alimento característico
dentro de nuestra gastronomía y se consume desde tiempos
prehispánicos. Actualmente en México el frijol es
la segunda fuente de proteína y además proporciona
otros nutrimentos como minerales, vitaminas del complejo B,
ácidos grasos poliinsaturados, carbohidratos y fibra
dietaria. Una de las principales características del
frijol es que se complementa perfectamente con el maíz, de
esta manera los aminoácidos que no se encuentran en el
frijol se encuentran en el maíz y viceversa, brindando una
alimentación balanceada a quien lo consume.
Actualmente, además de los nutrimentos antes
mencionados, se ha encontrado en el frijol común
compuestos que ayudan a prevenir o reducir enfermedades de tipo
crónico degenerativas.
El carácter nutracéutico que presenta esta
leguminosa ha llamado mucho la atención de países
desarrollados y en vías de desarrollo. Aunque su consumo
ha disminuído debido a que se le considera un alimento de
pobres no debe faltar en nuestra mesa y se debe luchar para que
retome su lugar dentro de todos los estratos sociales.
Tomando en cuenta lo anterior, nuestro trabajo se enfoca
en llevar a cabo el análisis de los efectos producidos al
inocular con biofertilizantes (hongo micorrícico,
Glomus mosseae y bacteria benéfica del suelo,
Bacillus subtilis) el suelo donde se sembraron
diferentes variedades genéticas de frijol comercial. Esto
con la finalidad de identificar cual tratamiento produce mejores
resultados, tanto agronómicos como nutricionales, en los
diferentes materiales de frijol y así ofrecer a la
población una nueva opción que fortalezca y mejore
sus cultivos, sin dañar al medio ambiente.
OBJETIVOS
General
Evaluar la calidad nutricional y nutracéutica
de diferentes materiales genéticos de frijol que se
consumen en México, crecidos bajo el efecto de
microorganismos benéficos (PGPR´s y los hongos
micorrícicos arbusculares).
Específicos
Realizar mediciones agronómicas a las plantas
de frijol crecidas en condiciones normales e inoculadas con
Bacillus subtilis (PGPR) y Glomus mosseae
(hongo micorrícico arbuscular).Cuantificar el rendimiento de las semillas de cada
variedad de frijol en cada tratamiento y analizar las
características del grano cosechado.Cuantificar en las semillas de cada variedad de
frijol y en cada tratamiento, los compuestos fenólicos
totales, taninos condensados, antocianinas y
concentración de proteína por métodos
fotométricos.Cuantificar la concentración de
antocianidinas por HPLC.
A. LEGUMINOSAS
Las leguminosas provienen de la familia Leguminosae,
probablemente la segunda fuente de alimento más importante
a nivel mundial. (Oboh, 2006). En comparación con los
cereales, (quienes se encuentran en primer lugar) son ricas en
proteínas de alta calidad, brindando al hombre una gran
fuente de nutrición y una dieta balanceada que puede
prevenirle de muchas enfermedades (Duranti, 2006).
Miles de especies de leguminosas existen pero los
frijoles comunes (Phaseolus vulgaris L.) son los
más consumidos en comparación con los demás.
En varios países como México y Brasil los frijoles
son la principal fuente de proteínas en la dieta humana
(Broughton, 2003).
En cuanto a la concentración de proteína
en las leguminosas, el frijol y el chícharo presentan
alrededor del 20% en peso seco y la soya contiene por encima del
38 – 40%. Es por esto que las leguminosas se encuentran
entre las fuentes más ricas de proteínas y
aminoácidos para la nutrición humana y animal;
además son de menor costo que los productos animales
(carnes, pescado y huevo), por lo cual son consumidas en todo el
mundo como la principal fuente de proteína, especialmente
en los países pobres o en vías de desarrollo donde
el consumo de proteínas animales puede ser limitado como
resultado de la economía, la sociedad, la cultura o los
factores religiosos (Oboh, 2006).
Desde un punto de vista nutricional, la proteína
de leguminosas es relativamente baja en aminoácidos
azufrados como la metionina y cisteina, por lo que la calidad de
la proteína en la semilla de leguminosa es
sub-óptima. (Broughton, 2003) pero la cantidad de otros
aminoácidos esenciales como la lisina y triptófano
es mucho mayor que en los cereales. (Duranti, 2006). Ante lo
anterior, estudios recientes han señalado que la dieta con
leguminosas debe ser complementada con carbohidratos complejos,
fibras solubles, vitaminas esenciales y metales (Beninger y col,
1998; Mazur y col, 1998; Romani, 2004; Oboh, 2006).
Dentro de las leguminosas también existen
compuestos antinutricionales (ANC), producto de la
adaptación evolutiva, y que le permiten a la planta
sobrevivir y completar su ciclo de vida bajo condiciones
naturales. Estos componentes con propiedades antinutricionales y
tóxicas son los que juegan un papel protector contra
insectos, hongos, predadores y un gran número de
condiciones de estrés.
El efecto antinutricional de las leguminosas consiste en
la acción de varias enzimas digestivas como la tripsina,
quimiotripsina y la amilasa. Sin embargo, esto se manifiesta
sólo si la semilla o la harina son consumidas sin cocinar.
Una vez cocinadas estas proteínas se inactivan
desnaturalización y pueden jugar un papel nutricional
positivo debido a su alto contenido en aminoácidos
azufrados (Duranti, 2006).
Además, las leguminosas son fuente importante de
macro y micronutrientes y juegan un papel destacado en las dietas
tradicionales de muchas regiones del mundo. Las leguminosas han
sido reconocidas como alimento funcional debido a que promueven
una buena salud y tienen propiedades
terapéuticas.
Los compuestos que brindan características de
alimento funcional al frijol son los fenoles simples, los
fenilpropaniodes, derivados del ácido benzóico,
flavonoides, estilbenos, taninos, lignanos, y ligninas (Xu y
Chang, 2007).
Además de lo anterior, la familia Leguminosae es
una hortaliza importante, ya que los granos y el alimento pueden
ser obtenidos con una mínima inversión en
fertilizantes nitrogenados (Oboh, 2006). Esto se debe la
asociación que existe entre las leguminosas y las
bacterias que fijan nitrógeno del aire. Esta
fertilización interna es la principal razón por la
que las leguminosas son más ricas en proteínas que
todas las otras plantas (Broughton, 2003). Actualmente el valor
anual total del cultivo de leguminosas en el mundo es de dos
billones de dólares americanos (Duranti, 2006).
Género Phaseolus
El género Phaseolus pertenece a la
subtribu Phaseolinae, que forma parte de la tribu
Phaseolae, clasificada dentro de la subfamilia
Papilionoideae y familia Leguminosae. (Debouck,
1991). Este género pertenece al grupo de las leguminosas
de gran importancia económica y alimentaria. Posee
características botánicas distintivas: follaje con
tricomas anclados, nodos de inflorescencia que perdieron los
nectarios extraflorales, de bractéolas florales aún
concluida la floración y estilo no extendido por debajo
del estigma, pétalos que están equilibrados, tanto
en la parte lateral como en los extremos y fuertemente enrollados
y nodos de la inflorescencia que pierden los nectarios
extraflorales (Debouck, 1998).
Estudios basados en datos morfológicos,
clasificación taxonómica tradicional,
análisis genéticos y sitios de restricción
de DNA de cloroplasto sugirieron que el género
Phaseolus es originario de América y que posee
alrededor de 55 especies silvestres que han sido encontradas
desde el Suroeste de Estados Unidos hasta el norte de Argentina
(Delgado-Salinas et al., 1988). Se considera que la
especiación o formación de las diferentes especies
del género se efectuó en los neotrópicos y
fue favorecida por el conjunto de características
geográficas, climáticas y ecológicas,
así como del área de transición entre climas
templados y de alta elevación, desiertos y trópicos
secos. Sin embargo, sólo cinco de ellas han sido
domesticadas (Debouck, 1987). El género Phaseolus
es monofilético y originario de América; posee
nueve especies: P. vulgaris, P. filiformis, P. lunatus, P.
polystachius, P. leptostachyus, P. pauciflorus, P. tuerckheimii y
P. peicellatus y P. microcarpus (Delgado-Salinas et
al., 1999), formadas a su vez por subgrupos, de tal forma
que las cinco especies domesticadas en el género provienen
de los grupos P. vulgaris y P. lunatus
(Delgado-Salinas et al., 1999).
Como resultado de la domesticación, el frijol
silvestre experimentó importantes cambios, los más
notables fueron la aparición de diferentes tipos de
crecimiento (determinado e indeterminado), insensibilidad al
fotoperiodo, gigantismo de la hoja, vaina y semilla,
pérdida de la dormancia y supresión de la
dehiscencia de las vainas, así como la aparición de
variedad de tamaños, formas y colores de las semillas. La
aparición de estas últimas características
en la semilla de frijol fue influenciada por un segundo proceso
de selección hecho por el hombre que inicia con el
comienzo de la agricultura hasta nuestros días, lo que
provocó la reducción de la posibilidad de
éxito y mantenimiento de una gran variedad de genotipos,
dando oportunidad sólo a aquellas que poseen
características valiosas para el agricultor, como color,
tamaño, rendimiento, etc. (Sonnante et al., 1994;
Gepts y Debouck, 1991; Gepts et al., 1998).
Frijol cultivado (criollo y mejorado)
Dentro del grupo de frijol cultivado se encuentra el
frijol criollo y mejorado, los cuales son utilizados para el
consumo humano. El frijol criollo surge de manera natural como
resultado del proceso evolutivo de domesticación, de
manera que también se aprecia una disminución de la
diversidad genética en comparación con sus
progenitores silvestres. El frijol criollo no ha sido manipulado
genéticamente e históricamente ha sido sembrado por
los campesinos en forma local en casi todos los estados de la
República, representando una amplia variedad en la
morfología y color de las semillas.
Por otro lado, el frijol mejorado ha sido producto del
mejoramiento genético a través de selecciones
dirigidas por el hombre para obtener las características
de su interés, ya sea conferir resistencia a ciertos
patógenos, tales como virus, hongos y bacterias, o
incrementar rendimiento, tamaño de la semilla,
permeabilidad, etc. Las variedades mejoradas han sido generadas
por programas de mejoramiento genético mediante la cruza
de materiales criollos relacionados genéticamente, los
cuales con el tiempo van excluyendo la base genética en la
que está basado el mejoramiento, amenazando la base
genética de sus antecesores, de tal manera que la
diversidad genética de estos materiales es menor (Harlan,
1987). Dentro de las características más
importantes del frijol cultivado podemos mencionar que son
plantas arbustivas, de estatura corta, semillas de rápida
maduración, la vaina es ideal para abrir, es una planta de
vida corta, anual y de tallos frágiles, posee
pedúnculos cortos y grandes vainas suculentas con
dehiscencia no violenta, de grandes semillas y más
permeables al agua, además poseen una gran variedad de
colores y adaptaciones fisiológicas, aunque estas
últimas son debidas a la selección hecha por el
hombre (Guzmán-Maldonado y Paredes-López,
1999).
Producción
Los frijoles son las semillas de leguminosa más
importantes para el consumo humano en el mundo. La
producción total excede los 23 millones de toneladas (MT)
de los cuales 7 MT son producidos en Latinoamérica y
África. Solo en México, el área destinada a
la siembra de frijol gira alrededor de 2259 ha×10-3 y la
producción es de 1300 MT×10-3.
El consumo promedio anual per capita de frijol en
México es de aproximadamente 16 Kg por año, el
estado de Durango sobresale con un promedio de 18 kg por
año, el rango según el estrato social varía
entre 10 y 26 Kg (Broughton, 2003). Según este, hay una
disminución en el consumo del frijol en México con
respecto a los datos presentados en 1997 por Castellanos, donde
se estimaba que el consumo per capita anual por la
población mexicana era de 22 Kg.
Existen hábitos preferenciales en el consumo del
frijol en México, las principales características
que utilizan los consumidores para definir sus preferencias se
basan en el tiempo de cocción y sabor, además del
color, tamaño y brillantez. Se estima que en el Noroeste
de México el 90% de los encuestados consume frijol
azufrado, en el Noreste el 70% consumen frijol pinto o bayo, en
el Sur el 90% consume frijol negro y en el Centro se consumen
todas las clases comerciales, sobresaliendo Flor de Mayo y Flor
de Junio (Castellanos et al., 1997).
El frijol es una importante fuente de alimento,
principalmente en forma de semilla madura y en menor
proporción como vaina verde o ejote; además, en
algunos países de América Latina, así como
en el este y centro de África, las hojas o flores tiernas
de las plantas de frijol son cosechadas y consumidas como
vegetales frescos. Su uso no sólo es exclusivo del hombre,
también el ganado es alimentado con hojas, tallos,
cáscara de las vainas y rastrojo seco, que finalmente es
incorporado al suelo para incrementar la materia orgánica
(Singh, 1999). Además de ser fuente directa de alimento,
el cultivo trae otras ventajas como el suministro y
biodisponibilidad de nitrógeno a otros cultivos por la
asociación simbiótica con microorganismos del
suelo. También como alternativa en la rotación de
cultivos, adiciona fertilidad al suelo y reduce costos de
producción, evitando la contaminación de aguas
subterráneas y aumentando la producción de
proteína de las leguminosas. En comparación con
otras leguminosas, el frijol se ha considerado una planta pobre
en la fijación de nitrógeno, posiblemente por la
baja eficiencia de su simbiosis; sin embargo, la principal
razón por la que se cultiva en cantidades importantes en
México es para la alimentación.
Situación del frijol en
México
En México, la industria del frijol no está
muy desarrollada, no obstante que ocupa el segundo lugar en
importancia en la dieta alimentaria en la mayoría de la
población mexicana. En la década de los noventa, el
procesamiento del frijol comenzó a tomar fuerza, lo cual
ha obedecido a cambios en los hábitos alimenticios
principalmente en las zonas urbanas, donde la mujer participa con
mayor frecuencia en el sustento de la economía familiar,
lo que acorta los tiempos para la elaboración de los
alimentos (FIRA, 2001).
Considerando el excesivo aumento de la población
y que se estima para el año 2030 un incremento de 50%,
será un gran reto abastecer de alimento a toda la
población mundial. Por otro lado, considerando que las
tierras de cultivo disminuirán, así como los
recursos naturales (agua, fertilidad del suelo, etc.), es urgente
adoptar sistemas de producción y agricultura más
eficientes y sustentables.
Por ejemplo, en la actualidad el hombre ha satisfecho la
demanda de alimento mediante el incremento de producción a
través del uso de mejoramiento genético,
fertilizantes, pesticidas, agua y el empleo de una mayor
extensión de tierras de cultivo; sin embargo, los recursos
escasean día con día rápidamente. Las
costumbres en el consumo del frijol son muy arraigadas, por lo
que se debe tener en consideración las preferencias del
consumidor antes de establecer alguna estrategia de mejoramiento
genético para que éste no sólo resulte
satisfactorio genética y fisiológicamente, sino
también en la aprobación y demanda de la
población.
Importancia del frijol en la dieta
En muchos países de América Latina, como
en México, el maíz y el frijol son la principal
fuente de proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales
para la población (Guzmán-Maldonado et al. 2000).
Por otro lado, se ha demostrado que el frijol además
contiene gran cantidad de compuestos nutracéuticos que
varían dependiendo de la especie y color, tales como la
fibra, inhibidores de proteasa, acido fítico, polifenoles
y taninos (Espinosa-Alonso y col, 2006).
El frijol común (Phaseolus vulgaris) es
por mucho uno de los más importantes cultivos (leguminosa
comestible cultivada y cosechada como semilla seca) en el mundo
(Singh, 1999), es el tercero en importancia después del
frijol de soya (Glycine max (L.)
Merr.) y el cacahuate (Arachis hypogea L.)
(Lin, 2008).
El frijol en América Latina y África
constituye la segunda fuente de proteína vegetal. En el
caso de México, el frijol ha formado parte importante de
la cultura gastronómica, llegando a constituir hasta el
15% de la dieta en las zonas más marginadas (el
maíz aporta hasta el 65%). La combinación
frijol-maíz logra el aporte de hasta el 70% de las
calorías requeridas y el 50% del requerimiento de
proteínas (Castellanos y col, 1997). Además, la
combinación potencializa el valor nutritivo de la
proteína ingerida ya que el frijol aporta la lisina y
triptófano deficientes en maíz y éste a su
vez aporta los aminoácidos azufrados (metionina y
cisteina) deficientes en frijol (Reyes-Moreno y
Paredes-López, 1993).
Características nutricionales del
frijol
Dentro de las características más
importantes que destacan el valor nutritivo de las leguminosas en
la nutrición humana es que presentan de 2 a 3 veces
más proteína que los cereales. Además de un
alto contenido de minerales, especialmente Fe, Ca y Zn
(Deshpande, 1992). En particular, se considera que el frijol es
un alimento rico en macronutrientes como las proteínas (16
– 33%), carbohidratos (60 – 70%), aunque escaso en
grasa (1 – 3%), además contiene vitaminas y
micronutrientes que elevan aún más su valor
nutricional.
Las proteínas presentes en el frijol, juegan un
papel esencial en la nutrición humana por
complementación con otros alimentos como el maíz en
América Latina y el este de África y el arroz en
Brasil. Por otro lado, las proteínas de origen animal como
la caseína de la leche y la albúmina de huevo
presentan perfiles de aminoácidos más completos y
en años recientes se ha considerado que es más
saludable sustituir en una buena proporción por
proteínas de origen vegetal debido a que el consumo
excesivo de proteínas de origen animal puede ser
calciurético y con el tiempo se puede provocar mayor
riesgo de fracturas. Debemos considerar además que en
muchas ocasiones la proteína de origen vegetal es la
única opción de consumo debido principalmente a la
economía de gran parte de la población, por lo que
el frijol representa la segunda fuente de proteína en
México, cubriendo las necesidades básicas para el
buen desarrollo y funcionamiento del organismo
(Guzmán-Maldonado y Paredes-López,
1999).
Dentro de las proteínas del frijol común
(Phaseolus vulgaris L.), las globulinas representan
entre el 50 y 75% del total (Muller y Gottschalk 1983; Alli y
col, 1994). Hay dos tipos de proteínas en este grupo, las
faseolinas y las lectinas (Staswick y col, 1986). Las de mayor
importancia son las faseolinas (glicoproteína trimerica)
porque son las mejores proteínas de las leguminosas para
la nutrición humana y por ser las más abundantes,
ya que conforman el 40 % de la proteína total en la
semilla (Ma y Bliss, 1978), (Gepts 1988, 1990), (Aswathi, 1993),
(Sharma, 2006) Estas proteínas pueden ser observadas
mediante la técnica SDS-PAGE, donde las bandas
correspondientes a las subunidades de la faseolina (43-53 kDa)
aparecen como las mas intensas y de mayor tamaño en
comparación con las demás (Carbonaro, 2006).
También se observan fitohemaglutininas (55-65 kDa),
argelinas (31-40 kDa) e inhibidores de a-amilasa (15-18 kDa)
(Bernal y col, 2006).
En base a lo anterior, la faseolina se ha considerado
como el principal determinante de la calidad nutricional y de la
cantidad de proteína presente en las semillas de frijol
(Bliss y Brown, 1983; Gepts y Bliss, 1984). Sin embargo, la
faseolina es deficiente en aminoácidos azufrados como la
metionina y la cisteína, contrario a los cereales que
generalmente contienen suficientes aminoácidos azufrados
pero son deficientes en aminoácidos esenciales como la
lisina y triptófano (presentes en las leguminosas). Por lo
anterior es que el consumo combinado de cereales y leguminosas en
una proporción de 2:1 produce un equilibrio mejorando el
balance en la dieta de sus consumidores (Bressani, 1983)
(Broughton, 2003).
Aún cuando el contenido de proteína en la
semilla de frijol es alto (20% de peso seco aproximadamente), su
valor nutricional es pobre debido a factores intrínsecos
de la semilla, tales como la presencia de inhibidores de
tripsina, taninos y ácido fítico que inhiben de
forma irreversible a las proteasas intestinales, formando
complejos con las proteínas, disminuyendo su solubilidad e
hidrólisis. Sin embargo, la actividad de los inhibidores
puede ser eliminada hasta en un 90% durante la cocción
(Deshpande, 1992), los taninos y el ácido fítico
pueden ser removidos en una buena proporción durante el
remojo (Maga, 1982; Barampama y Simard, 1994). Es importante
destacar que dichos componentes tienen propiedades duales ya que
han sido asociados con la prevención de enfermedades de
tipo crónico degenerativas, lo cual ha provocado que en
años recientes se haya incrementado la importancia del
frijol y exista un mayor interés por su carácter
nutracéutico.
Además el carácter nutracéutico del
frijol se debe tembién a la actividad antioxidante y
antimutagénica que brindan los compuestos fenólicos
presentes en la semilla. Porque pueden ayudar en la
prevención de enfermedades degenerativas como el
cáncer. Existen reportes de efectos
anticarcinogénicos de los extractos fenólicos de
frijol común que respaldan su potencial uso como alimento
funcional (Preza y Lerma, 2003). (Rocha-Guzmán, 2007). El
color del frijol es importante, algunos estudios señalan
que los frijoles negros poseen mayor contenido de fenoles que
aquellos de color claro (Barampama y Simard, 1993). Tambien es
importante señalar que los factores ambientales, el lugar
de crecimiento y los factores genéticos del cultivo
influencian el nivel de los fenoles totales. Por otro lado, la
concentración y la composición de fenoles,
así como la de taninos totales (procianidinas) y la de
antocianinas determinan el color de la semilla de frijol
(Feenstra, 1960).
Nutracéuticos: salud y dieta
En los últimos años se ha reconocido que
las enfermedades crónico degenerativas asociadas a los
problemas de obesidad, tales como diabetes, enfermedades
cardiovasculares, hipertensión y cáncer
están afectando a una gran parte de la población
mundial, no sólo en países desarrollados en los
cuales existe abundancia de alimento, sino también en los
países en vías de desarrollo, donde existe
malnutrición (WHO, 2003). Dos factores principales son la
causa de este importante problema de salud, la dieta y la falta
de actividad física. Desde tiempos remotos,
Aristóteles sugirió la importante relación
entre salud y dieta, poniendo como manifiesto "que tu alimento
sea tu medicina"; sin embargo, los patrones de
alimentación han cambiado hacia una dieta no balanceada.
Así mismo, debido al creciente aumento de la
población, el principal objetivo en cuanto a
nutrición ha sido alcanzar los requerimientos
calóricos necesarios sin tomar en consideración el
balance o calidad de los alimentos ingeridos.
Por otra parte, en América Latina se han
presentado cambios en los patrones de alimentación debido
al desarrollo, la industrialización, los estilos modernos
de vida, etc., que han afectado los patrones alimenticios de la
población, incrementando el consumo de alimentos ricos en
carbohidratos y grasas y reduciendo la ingesta de cereales,
leguminosas, frutas y verduras (Bermúdez y Tucker, 2003).
Para tratar de frenar y combatir estos problemas de salud, la
Organización Mundial de la Salud ha propuesto que la mejor
estrategia es la prevención y en los últimos
años se ha dado gran importancia a cambiar los
hábitos alimenticios, recomendando una dieta rica en
frutas y verduras y baja en carbohidratos y grasas, generado una
tendencia hacia los estudios sobre los compuestos nutricionales
cuya ingesta beneficia directamente a la salud. A estos
compuestos se les ha denominado como "nutracéuticos",
término creado en 1979 como resultado de la fusión
de nutrientes y fármacos por Stephen De Felice fundador y
presidente de la Fundación de Innovación en
Medicina (FIM, Cranford, NJ) quien explicó que un
Nutracéutico es "cualquier alimento, o parte de un
alimento que puede proveer de beneficios a la salud, incluyendo
la prevención y el tratamiento de enfermedades". (Durante,
2006). Muchos de estos compuestos cuentan con propiedades
antioxidantes (Erdman y col, 2007), antimutagénicas
(Aparicio-Fernández y col, 2005) y anticarcinógenas
(González de Mejía y col, 2005) que previenen al
organismo de enfermedades crónicas y se encuentran en
frutas, leguminosas y vegetales.
Las leguminosas además de jugar un papel
importante en el aporte nutrimental de muchas personas a
través del planeta, también brindan beneficios a la
salud y propiedades terapéuticas (Geil y Anderson, 1994).
Estudios epidemiológicos han mostrado correlaciones entre
el consumo de alimentos con alto contenido de fenoles, como las
frutas, vegetales, granos y leguminosas y la disminución
de muchas enfermedades, por ejemplo, el cáncer,
envejecimiento prematuro y enfermedades cardiovasculares
(Anderson y col, 1999; Kushi y col, 1999; Miller y col, 2000;
Kris – Etherton y col, 2002). Un estudio epidemiológico
reciente señaló que de entre muchos alimentos
comunes, sólo el consumo de frijoles y lentejas
está relacionado con la baja incidencia de cáncer
de seno (Adebamowo y col, 2005). También se han reportado
actividades antioxidantes significativas producidas por
compuestos fenólicos en muchas leguminosas consumidas
comúnmente (Tsuda y col, 1993, 1994, 1996; Takahata y col,
2001; Cardador-Martínez y col, 2002; Duenas y col, 2002,
2004; Troszýnska y col, 2002; Amarowicz y col, 2003, 2004;
Beninger y Hosfield 2003; Lee y col, 2004; Madhujith y col, 2004;
Heimler y col, 2005; Madhujith y Shahidi 2005; Takahashi y col,
2005). (Xu, Yuan y Chang, 2007).
Compuestos nutracéuticos en
frijol
El color de la cubierta de las semillas es atribuido a
la presencia y a la concentración de los polifenoles,
así como de los glicósidos de flavonoles, taninos
condensados y antocianinas (Beninger y Hosfield, 1999; Takeoka,
G. R. y col, 1997; Choung y col, 2003; Salinas-Moreno y col,
2005; Romani y col, 2004) y su función es proteger a la
semilla contra patógenos y predadores (Islam y col, 2003).
Estos compuestos tienen actividades antioxidantes,
antimutagénicas y anticarcinogénicas y
también propiedades contra radicales libres
(González de Mejía y col, 1999;
Cardador-Martínez y col, 2002; Beninger y Hosfield,
2003).
Los polifenoles de frijol seco pueden actuar como
antioxidantes que inhiben la formación los radicales
libres que resultan de la degradación natural de los
alimentos (Namiki, 1990). Recientemente se ha demostrado que los
taninos condensados y los hidrolizables de peso molecular
relativamente alto, también son efectivos antioxidantes,
con mayor actividad que los fenoles simples (Hagerman, y col,
1998; Beninger, 2003).
El carácter nutracéutico del frijol ha
llamado la atención en los países desarrollados
debido a los importantes beneficios que aporta a la salud,
incluyendo la reducción del contenido de colesterol en
sangre, la tolerancia a la glucosa, disminución de
enfermedades cardiovasculares y prevención de ciertos
tipos de cáncer (Messina, 1999; Guzmán-Maldonado y
Paredes-López, 1998).
Los beneficios a la salud por el consumo de
antocianinas, son bien conocidos por los países
desarrollados como EUA, su consumo es entre 180-215 mg por
día, obtenido principalmente por alimentos rojos y azules
y por el vino tinto. Sin embargo, estas mismas fuentes no son
disponibles en todos los países en vías de
desarrollo por lo que una buena alternativa es la ingesta de 100
g de frijoles negros, que pueden incorporar lo mismo o mayores
cantidades (349 mg/dia) de antocianinas en la dieta básica
(Espinosa-Alonso, 2006).
Contenido Fenólico Total
Los fenoles naturales realizan sus efectos
benéficos en la salud principalmente a través de su
actividad antioxidante (Fang y col, 2002). Estos compuestos son
capaces de remover los radicales libres, realizar
catálisis para quelar metales, activar enzimas
antioxidantes e inhibir oxidasas (Heim y col, 2002).
Los compuestos fenólicos son originados a partir
de una de las principales clases de metabolitos secundarios en
plantas, derivados de la fenilalanina. Las plantas y los
alimentos contienen una gran variedad de derivados
fenólicos, incluyendo simples fenoles, fenilpropanoides,
derivados del ácido benzoico, flavonoides, estilbenos,
taninos, lignanos y ligninas, suberina y cutina. Los compuestos
fenólicos son esenciales para el crecimiento y
reproducción de plantas, actúan como
antipatógenos. Contribuyen con la pigmentación de
las plantas y son atrayentes de polinizadores. Además
actúan como pesticidas naturales y participan en el
establecimiento de la simbiosis con el género
Rhizobium. Protegen a las plantas de la luz UV y son
antioxidantes naturales. Esta última propiedad atrae
enormemente nuestra atención debido a la constante
formación de radicales libres que ocurren de forma natural
en nuestro organismo, originados como productos del metabolismo.
Los radicales libres son inestables y altamente reactivos, pero
su reactividad puede ser contrarestada por medio de los
antioxidantes, los cuales pueden actuar a diferente nivel, pueden
disminuir la concentración de oxígeno, prevenir la
formación de la reacción en cadena por
secuestramiento de los radicales de iniciación,
unión a los iones metálicos catalizadores y
descomposición de los productos primarios de
oxidación, previenen la unión a proteínas y
la mutación del ADN y el daño a tejido (Shahidi,
2000). Además de su actividad antioxidante, presentan
actividad antimutagénica y anticancerígena y juegan
un papel muy importante en la salud debido a que se han asociado
con la reducción de enfermedades
crónicas-degenerativas (Rui Hai, 2004).
El consumo de compuestos fenólicos en la dieta
está afectado por los hábitos y preferencias del
consumidor. Las principales fuentes de compuestos
fenólicos son frutas, vegetales, cereales y leguminosas.
Se ha estimado que el consumo diario de compuestos
fenólicos en personas que comen varias raciones de fruta y
vegetales al día es de 1 g. La Academia Nacional de
Ciencias de EU recomienda el consumo de al menos 5 raciones de
frutas o vegetales diarios para un buen funcionamiento del
organismo y para la prevención de enfermedades
crónicas degenerativas. Las catequinas son compuestos
fenólicos flavonoides presentes ampliamente en plantas
comestibles como la soya y especialmente en el té (Ho y
col, 1992; Huang, M. y Ferraro, 1992; Dreosti, 1996). Se ha
reportado que las catequinas inhiben la generación de
tumores y algunos tipos de cáncer. (Conney y col, 1992;
Wang y col, 1992; Chung y col, 1992; González de
Mejía y col, 1999).
Contrario a la recomendación, en países de
América Latina se observan cambios en los patrones de
consumo y en la actualidad se ha incrementado el consumo de
alimentos de origen animal, productos ricos en grasa y
azúcares y al mismo tiempo, la disminución de la
ingesta de cereales, frutas y algunos vegetales (Bermudez y
Tucker, 2003). De tal manera que el consumo de compuestos
fenólicos es cada vez menor y para algunos sectores de la
población resulta inaccesible el consumo de frutas debido
a sus condiciones socioeconómicas. Se ha descrito que la
semilla de frijol contiene diferentes compuestos
fenólicos, contenidos principalmente en la cascarilla y
que su color está determinado por la presencia y
concentración de polifenoles tales como flavonoides
glicosilados, taninos condensados y antocianinas (Takeoka y col,
1997; Beninger y col, 1999; 2003; Choung y col, 2003; Romani y
col, 2004; Salinas-Moreno y col, 2005). Y se han descrito
diferentes propiedades antioxidantes, anticancerígenas y
antimutagénicas en diferentes cultivares de frijol.
(González-De Mejía y col, 1999;
Cardador-Martínez y col, 2002; Beninger y col, 2003;
Aparicio-Fernández y col, 2006). De tal manera que se
está considerando al frijol como una buena fuente de
compuestos fenólicos en la dieta, tomando en cuenta que es
un alimento de costo accesible y que se tiene bien incorporado a
los hábitos tradicionales de
alimentación.
Taninos condensados
Los taninos son producto de la condensación de
fenoles simples y tienen una variedad de estructuras moleculares.
Ellos están generalmente divididos en proantocianidinas
hidrolizables y condensadas (polimeros de flavan-3-oles) (Haslam
1989). Los taninos son compuestos biológicamente activos y
pueden tener efectos nutricionales benéficos o adversos.
Los taninos condensados, compuestos fenólicos predominante
en semillas leguminosas, se encuentran ampliamente en lentejas,
granos de soya coloreados y frijoles comunes (Elias y col, 1979;
Vidal-Valverde y col, 1994; Troszynska y col, 1997, 2002; Wang y
col, 1998; Takahata y col, 2001; Beninger y Hosfield, 2003;
Amarowicz y col, 2004). Están localizados principalmente
en la testa y juegan un papel importante en el sistema de defensa
de las semillas que están expuestas a daño
oxidativo debido al medio ambiente. (Troszýnska y col,
2002).
Los taninos son compuestos fenólicos de peso
molecular intermedio (más de 30,000 Da), son
moléculas altamente hidroxiladas y pueden formar complejos
insolubles con carbohidratos y proteínas, son los
responsables de la astringencia en los alimentos debido a la
precipitación de las enzimas de la saliva. Se clasifican
en dos grupos: hidrolizables y no hidrolizables o condensados.
Los primeros constan de unidades de ácido gálico
que por condensación dimérica forman ácido
hexahidroxidifénico (galoil) que se esterifica como
poliol, contienen principalmente 18 unidades de glucosa que puede
condensarse a otra molécula galoil y así formar
polímeros de alto peso molecular, además pueden ser
hidrolizados por acción química o
enzimática. Los no hidrolizables, llamados también
proantocianidinas, son polímeros de alto peso molecular y
estructuralmente más complejos, formados por unidades de
catequina (flavan-3-ol) con una molécula
leucoantocianidina (flavan-3,4-diol) como precursor, condensados
entre el carbón 4 del heterociclo y el carbón C6 y
C8 de 18 unidades adyacentes (Parr y Bolwell, 2000). En los
alimentos se encuentran predominantemente los taninos
condensados, mientras que los hidrolizables sólo en
cantidades traza. Una gran variedad de alimentos de origen
vegetal contienen taninos, tés, vinos, frutas y granos
(manzanas, plátanos, uvas, ciruelas, peras, duraznos,
fresas, sorgo, mijo, haba, cebada, chícharos, algarrobo, y
otras leguminas, entre las que destaca por su importancia
alimentaria el frijol común).
Además de los efectos negativos de los taninos en
la precipitación de proteínas ó en la
inhibición en forma no competitiva de la actividad
enzimática de celulasa, pectinasa, amilasa, lipasas,
enzimas proteolíticas, ß-galactosidasa, así
como enzimas microbianas que participan en la fermentación
de cereales, también los taninos pueden reducir la
biodisponibilidad de iones metálicos como Fe, Ca y Zn y de
vitamina B12 y afectar la mucosa del tracto gastrointestinal
alterando la excreción de ciertos cationes,
proteínas y aminoácidos esenciales endógenos
(Chung y col, 1998). Otro efecto negativo asociado al consumo de
alimentos ricos en taninos es la incidencia de cánceres
del esófago, hígado, etc. Al investigar este efecto
en animales de laboratorio utilizando extractos de taninos (fruto
del betel y té de hierbas) se observó el desarrollo
de tumores, lo que sugirió el posible efecto
carcinogénico; sin embargo, otros reportes indicaron que
la actividad carcinogénica puede estar relacionada a
componentes asociados a taninos, más que a ellos en
sí ya que se han visto asociaciones negativas entre el
consumo de té y la incidencia de cáncer (Chung y
col, 1998), esto debido a que dichos compuestos han presentado
efectos anticancerígenos, antimutagénicos y
antimicrobianos (Chung y col, 1998; Parr y Bolwell,
2000).
Los efectos antes mencionados se deben al
carácter antioxidante de los taninos que protege a los
componentes celulares del daño oxidativo al reducir el
nivel de radicales libres, así como la peroxidación
y la inhibición de compuestos inductores de tumores.
Además presentan gran efectividad contra bacterias,
hongos, levaduras y virus por la formación de complejos
con enzimas o sustratos indispensables para los microorganismos.
También presentan un mecanismo de toxicidad que
actúa en las membranas inhibiendo el sistema de transporte
electrónico o la formación de complejos insolubles
con nutrientes y iones metálicos, reduciendo así la
disponibilidad y por tanto la capacidad de sobrevivencia de los
microorganismos.
Los taninos son los principales componentes de la
cascarilla de frijol, han sido reportados en todos los colores de
semilla, desde el negro, rojo, café, amarillo, crema e
inclusive en el blanco; sin embargo, no está muy clara la
relación entre el contenido de taninos y la actividad
antioxidante de éstos. Inicialmente se asociaba una mayor
actividad en los frijoles negros y más coloridos,
contradictorio a lo reportado por Beninger y col, (2003) que
encuentra la mayor actividad antioxidante en frijol
blanco.
Es necesario incrementar los estudios en lo que respecta
al papel que los taninos juegan en la alimentación ya que
por un lado ofrecen beneficios preventivos a la salud,
anticarcinógenos o antimutágenicos y por otro lado,
pueden estar involucrados en la promoción de cáncer
o actividad antinutricional, seguramente la dosis es la que marca
el destino final o la acción.
Antocianinas y Antocianidinas
Las antocianinas constituyen uno de los mayores grupos
de pigmentos naturales y son responsables de muchos de los
colores de frutas, vegetales y flores (Rivas-Gonzalo, 2003;
Strack y Wray, 1993). En años recientes numerosos estudios
han sido llevados a cabo para caracterizar los perfiles de las
antocianinas de diferentes productos naturales, entre ellos los
frijoles (Phaseolus vulgaris), principamente para usar
este tipo de compuestos fenólicos como una alternativa a
los colorantes sintéticos usados en la industria
alimenticia (Harbone y Grayer, 1988; Hong y Wrolstad, 1990).
Dichos compuestos son una atractiva alternativa debido a su alta
solubilidad en agua (Macz-Pop y col, 2006), la cual facilita su
incorporación en diferentes productos; sin embargo,
presentan inconvenientes en cuanto a la estabilidad debido a que
en solución son afectadas por la luz, los cambios de pH y
especialmente por su combinación con dioxido de azufre
utilizado como conservador en los alimentos (Brouillard, 1982;
Coutalte, 1986; Harbone y Grayer, 1988).
Las antocianinas integran una larga familia de
flavonoides incluyendo cerca de 4000 miembros, son por mucho las
moléculas mas bioactivas que llevan consigo los efectos
fisiológicos más fuertes que ningún otro
compuesto vegetal, son pigmentos de tejidos epidermales que
imparten el color rojo, azul y morado a las plantas y a los
alimentos, las principales fuentes son las frutas y vegetales
rojos y morados (arándanos, zarzamoras, betabel, etc.),
así como el vino tinto (Clifford, 2000).
De acuerdo al pH las antocianinas pueden estar en forma
no colorida o colorida y se encuentran en forma de mono y
diglucósidos principalmente. Las antocianinas y las
antocianidinas (agliconas de las antocianinas) han despertado el
interés de los científicos, mostrando
principalmente estudios "in vitro" de los efectos
benéficos para la salud. Existen muchos reportes en los
cuales se demuestran propiedades antinflamatorias,
vasotónicas y antioxidantes de las antocianidinas y su
respectiva aglicona. (Cardador, Loarca y Domah, 2002;
García, de Pascual-Teresa, Santos-Buelga y Rivas-Gonzalo,
2004; Tsuda y col, 1994; Wang y col, 1997, Clifford, 2000). Ellas
además pueden jugar un papel importante en la
prevención de enfermedades degenerativas como el
cáncer, Alzheimer o enfermedades cardiovasculares (Markham
y Bloor, 1998).
La dosis recomendada de ingesta de antocianinas es de
180 a 215 mg diarios (Clifford, 2000). Sin embargo, para la mayor
parte de la población Mexicana estas fuentes no
están disponibles, por lo que se sugiere que 100 g de
frijol negro puede aportar altas cantidades (340 mg) de
antocianinas en la dieta (Clifford, 2000).
La presencia de antocianinas en frijol sólo ha
sido descrita para frijol negro y rojo (Takeoka y col, 1997;
Beninger y col, 2003; Choung, 2003; Romani y col, 2004).
Inicialmente sólo se habían identificado malvidina
3-glucósido, petunidina 3-glucósido y delfinidina
3,5-diglucósido, extraídas de frijol negro. Sin
embargo con el desarrollo de técnicas y equipos más
eficientes se ha logrado identificar en frijol negro cultivado
todas las agliconas de las antocianinas (antocianidinas) como la
delfinidina, petunidina, cianidina, malvidina, pelargonidina, y
peonidina (Takeoka y col, 1997; Romani y col, 2004;
Salinas-Moreno y col, 2005).
Las antocianidinas tienen una solubilidad limitada en
agua, son rápidamente destruidos por álcalis y son
fotolábiles. Además tienen un tiempo de vida muy
corto en relación con sus derivados glicosilados. Debido a
esta inestabilidad las antocianidinas aparecen raramente en la
naturaleza (Dao, Takeota, Edwards y Berrios, 1998) y hasta este
momento no se ha descrito la presencia de estos compuestos en
otros productos o en ninguna otra fuente natural.
Figura 1. Estructura de las
antocianidinas (1-5)
Muchos autores han determinado y cuantificado las
antocianidinas en diferentes productos. Siempre se han analizado
las antocianidinas por hidrólisis ácida del
material base ya que nunca aparecen naturalmente en los alimentos
solamente en sus derivados glicosilados (Merken, Mermen y
Beecher, 2001; Nyman y Kumpulainene, 2001).
En 1998 Dao y col, determinó que las agliconas de
la delfinidina, petunidina y malvidina en una solución
metanólica ácida desaparecen completamente
después de 48 horas a temperatura ambiente, o
después de cuatro días en refrigeración. La
estructura casi plana de las antocianidinas con una
deslocalización electrónica extendida, contribuye a
la posible formación de muchos complejos moleculares
estables.
Hasta el momento se han caracterizado alrededor de 600
antocianidinas, de las cuales la cianidina y la delfinidina son
las más interesantes. (NSN 2000. 5(6):231-4). Estudios
recientes han señalado que las cianidinas encontradas en
muchas fuentes frutales presentan "una función de potente
antioxidante in vivo" en animales japoneses. (Tsuda, 2000). Otra
fuente afirma que la cianidina es cuatro veces más
poderosa que la vitamina E. (Rice-Evans, 1995)
En el caso de los estudios realizados en animales se
señala que las cianidinas protegen la membrana celular
lipídica de la oxidación de una amplia variedad de
sustancias dañinas (Tsuda, 1998).
Investigadores franceses utilizaron antocianinas sobre
aortas animales y norepinefrina, que constriñe los vasos
sanguíneos y demostraron que la delfinidina relaja la
aorta en un 89% mientras que otra antocianina llamada malvidina
fue inefectiva. Los investigadores concluyeron que la delfinidina
puede estar relacionada con la reducción de casos de
mortalidad por cuestiones cardiovasculares, por medio de la
ingesta de vino, frutas y vegetales en la dieta (Andriambeloson,
1998).
En el laboratorio también se ha encontrado que
las antocianinas inhiben algunos tipos de células
tumorosas. La cianidina y la delfinidina inhiben el receptor de
factor de crecimiento epidérmico en células
cancerosas, mientras que malvidina es menos efectiva (Meiers,
2001).
Después de la ingestión de las
antocianinas, las antocianidinas podrían ser el metabolito
inmediato. Esto es debido a que la enzima B-glucosidasa
encontrada en las bacterias intestinales puede hidrolizar
fácilmente a las antocianinas (glicósidos) a
antocianidinas (agliconas) (Tsuda y col, 1994).
Las antocianidinas más comunes presentes en
plantas superiores son cianidina, delfinidina, malvidina,
pelargonidina, peonidina y petunidina, las cuales se encuentran
distribuidas en la naturaleza en un 50, 12, 12, 12, 7 y 7%,
respectivamente (Kong y col, 2003).
Se dice que el número de grupos hidróxilo
y metóxilo en el anillo B de las antocianidinas
influencian fuertemente la inhibición del crecimiento de
líneas celulares de cáncer (Kong y col,
2003).
Las antocianidinas en comparación con las
antocianinas inhibieron preferencialmente el crecimiento de
líneas celulares de carcinoma de vulva humano A431,
estando sobrexpresado el factor de crecimiento epidérmico
(EGFR) (Meiers y col, 2001).
En Estados Unidos se realizaron pruebas de antocianinas
y antocianidinas sobre líneas de células de
cáncer humano, las cuales fueron, AGS (estomago), HCT-116
(colon), MCF-7 (seno), NCI H460 (pulmón), y SF-268
(Sistema Nervioso Central) a 12.5-200 ug/mL. Las antocianinas
probadas no inhibieron la proliferación celular de las
líneas celulares probadas a 200 ug/mL. Sin embargo, las
antocianidinas si mostraron actividad inhibitoria en la
proliferación celular (Kang, 2003).
La delfinidina, cianidina y petunidina inducen apoptosis
de las células HL-60 detectadas por cambios
morfológicos y fragmentación del DNA, mientras que
la pelargonidina no muestra dicha inducción de apoptosis
(Hou y col, 2003).
La pelargonidina inhibió el crecimiento celular
de AGS, HCT-116, NCI H460, MCF-7 y SF-268 en un 64, 63, 62, 63, y
34% respectivamente, a 200 ug/mL. Igualmente a 200 ug/mL, la
cianidina, delfinidina y petunidina inhibieron el crecimiento de
las células de cáncer de seno en un 47, 66 y 53%,
respectivamente (Zhang y col, 2005).
La pelargonidina también ha demostrado que tiene
la propiedad de proteger al aminoácido tirosina del
altamente reactivo oxidante peroxinitrilo. (Tsuda, 2000) Se cree
que la nitración del peroxinitrito de los residuos de
tirosina de enzimas y proteínas es la principal causa del
daño en el cerebro en enfermedades neurodegenerativas y
traumas cerebrales. La tirosina nitrada bloquea los sitios
receptores del nervio del factor de crecimiento previniendo el
nuevo crecimiento neural e inhibiendo el reparo. Es previniendo
esta nitración de la tirosina que la antocianina
pelargonidina puede ayudar a proteger contra enfermedades
neurológicas (Joseph, 1999).
Las antocianinas también tienen propiedades
antinflamatorias que evitan el daño provocado al
colágeno del sistema nervioso. Con esta habilidad protegen
tanto los vasos sanguíneos largos como los pequeños
del daño oxidativo derivado de múltiples efectos.
Existen varias vías en que las antocianinas realizan esta
protección, una es neutralizando las enzimas que destruyen
el tejido conectivo, otra es porque su capacidad antioxidante
previene el daño que los oxidantes puedan hacer al tejido
conectivo. Experimentos con animales han mostrado que la ingesta
de suplementos con antocianinas efectivamente previenen la
inflamación y subsecuentemente el daño a los vasos
sanguíneos (Bertuglia y col, 1995).
A pesar de la importancia del consumo de frijol en el
mundo, los datos relacionados con la composición de
antocianinas de estas leguminosas es escaso. El primer trabajo en
este respecto fue elaborados por Feenstra en 1960 (Mazza y
Miniati, 1993), describiendo la presencia de los 3 – glicosidos
corresponidnetes de malvidina, petunidina, delfinidina y el 3, 5
– diglucosido de delfinidina en frijol Phaseolus
vulgaris L. Otros autores reportan resultados similares,
pero detectando cantidades pequeñas de otras antocianinas,
como los 3 – monoglucosidos y 3, 5 – diglucosidos de cianidina y
pelargonidina (Takeota y col, 1997). La mayor parte de los
estudios coinciden indicando que las principales antocianinas son
siempre delfinidina 3 – glicosido (Choung, y col, 2003; Romani y
col, 2004). Hay importantes diferencias dependiendo de la
variedad analizada, como por ejemplo en Phaseolus
lunatus L., la principal antocianina es peonidina 3 –
glicosido, seguido de peonidina 3 – rutinosido (Yoshida y col,
1996).
Una característica importante de la planta de
frijol es que sus raíces cuentan con la propiedad de
interactuar con microorganismos benéficos de la
rizósfera del suelo, que le permiten a la planta en
desarrollo obtener más fácilmente los nutrientes
necesarios, aún en suelos pobres. Dentro de la
población de microorganismos que participan en este evento
se encuentran hongos y bacterias, entre las que destacan las
bacterias fijadoras de nitrógeno y las promotoras del
crecimiento (PGPRs) y los hongos micorrícicos
arbusculares.
Las PGPR´s representan una amplia variedad de
bacterias del suelo, que al ser crecidas en asociación con
una planta hospedera estimulan el crecimiento de dicha planta.
Actualmente el término biofertilizante permanece poco
claro, pero comúnmente se refiere al uso de
microorganismos del suelo para incrementar la disponibilidad e
ingesta de nutrientes minerales para las plantas. El modo de
acción de las PGPR´s como biofertilizantes es
ayudando directamente a proveer nutrientes a la planta hospedera,
o indirectamente por influencia positiva en el crecimiento de las
raíces o por brindar otras relaciones simbióticas
benéficas. No todas las PGPR´s son biofertilizantes.
Muchas estimulan el crecimiento de las plantas ayudándolas
a controlar a los organismos patógenos. (Whipps, 2001;
Zehnder y col, 2001).
La manera en la cual un PGPR mejora los niveles
nutricionales de la planta hospedera puede ser categorizada en
cinco áreas: (1) fijación biológica de N2,
(2) incremento de la disponibilidad de nutrientes de la
rizósfera, (3) inducción del incremento de la
superficie de área de la raíz, (4) mejorando otras
simbiosis benéficas en la planta hospedera y (5) por
combinación de los diferentes modos de acción
(Vessey, 2003).
Dentro de los efectos de los biofertilizantes
PGPR´s es común ver que se produzca un sinergismo o
se promuevan los efectos benéficos de una tercera parte de
los microorganismos de la rizósfera. En estos casos,
cuando los PGPR´s logran esa relación
planta-simbionte se les da el nombre de bacterias "ayudantes". La
vasta mayoría de estudios que investigan a los
PGPR´s como ayudantes de otras relaciones planta-simbionte
incluyen tanto la simbiosis entre leguminosas y rizobia o la
simbiosis entre planta y hongo (Vessey, 2003).
Los biofertilizantes de PGPR´s algunas veces
mejoran indirectamente el crecimiento de la planta al estimular
la relación entre la planta hospedera y los hongos
rizosféricos benéficos del suelo, como lo son los
hongos micorrícicos arbusculares (AM). Al igual que los
PGPR´s. estos hongos AM son bien conocidos por ayudar a
mejorar la ingesta de varios nutrientes del suelo (especialmente
fósforo) (Bethlenfalvay, 1993; Marschener, 1998; Ness y
Vlek, 2000; Tobar, 1994). Existen estudios que señalan el
hecho de que una coinoculación entre estos hongos con
algunos PGPR´s produce un incremento en la relación
entre la planta y el simbionte fúngico (Vessey,
2003).
Se mencionó anteriormente que un biofertilizante
es definido como una sustancia que contiene microorganismos vivos
que cuando son añadidos a las semillas, a la superficie de
la planta, o al suelo, se coloniza la rizosfera o el interior de
la planta y promueve el crecimiento por incremento del aporte o
disponibilidad de nutrientes primarios de la planta hospedera.
Esta definición está basada en la lógica del
término biofertilizante es un diminutivo del
término fertilizante biológico. Como la
biología es el estudio de los microorganismos vivos, un
biofertilizante debe contener organismos vivos los cuales
incrementen el nivel de nutrientes de la planta hospedera
mientras exista una asociación con la planta. Esta
definición separa el término biofertilizante con el
de fertilizante orgánico, el cual contiene compuestos
orgánicos los cuales directamente o por
descomposición, incrementan la fertilidad del suelo
(Vessey, 2003).
Tampoco el término biofertilizante debe ser usado
para referirse a la composta, fertilizantes a base de suplementos
orgánicos químicos, etc, Como se define, los
biofertilizantes deben contener microorganismos vivos, los cuales
promueven el crecimiento de la planta mejorando el nivel de
nutrientes en la planta. Sin embargo, no todos los
biofertilizantes serán PGPR´s. Existen hongos
rizosféricos como los hongos micorrícicos
arbusculares (Bethlenfalvay, 1993) y Penicillium bilaii
(Vessey y Heisinger, 2001) ampliamente conocidos por promover
efectos de crecimiento en las plantas incrementando los niveles
de nutrientes de la planta hospedera.
Estudios recientes han reportado que esto tipos de
interacciones producen un aumento en la concentración de
ácidos fenólicos en tomate (licopeno y caroteno) y
albahaca (ácidos rosmarínico y caféico) los
cuales son una buena fuente de antioxidantes naturales
(Toussaint, y col, 2007).
Respuesta Fisiológica de las
plantas a la colonización Micorricica
Arbuscular
Como ya hemos mencionado anteriormente, las plantas
interactúan con una gran variedad de microorganismos los
cuales pueden tener un efecto perjudicial o benéfico
(directo o indirecto) sobre su crecimiento y desarrollo. La
asociación mutualista entre las plantas superiores y los
hongos formadores de micorriza arbuscular mejora el crecimiento
de la planta simbiótica particularmente bajo condiciones
poco favorables de crecimiento (Gerdemann, 1964; Kotari y col,
1991; Suramanian y col, 1995; Ruíz-Lozano y Azcon, 1995).
Bajo condiciones de baja fertilidad en el suelo, el efecto
positivo de la micorriza arbuscular está basado
principalmente en el aumento de la asimilación de
nutrimentos preponderantes de fósforo (Gerdemann 1964;
McArthur y Knowles, 1993; Gavito y Varela, 1995), aunque la
respuesta significativa de crecimiento de plantas con alta
disponibilidad de nutrimentos indica el involucramiento de
mecanismos fisiológicos no nutricionales.
En los últimos años se ha incrementado el
número de reportes referentes a que la colonización
micorrícica arbuscular puede (independientemente del
estado de fósforo en la planta hospedera) aumentar la tasa
de transpiración, la conductancia estomacal y la tasa
fotosintética (Ruiz-Lozano y Azcon, 1995).
Brown y Bethlenfalvay (1987) evaluaron la
fotosíntesis de plantas de soya (Glycine max L.
cv. hobbit) en respuesta a diferentes condiciones de simbiosis
(i) MA, (ii) Bacterias fijadores de nitrógeno, (iii) MA +
bacterias fijadoras de nitrógeno y (iv) control (sin MA ni
bacterias fijadoras de nitrógeno) pero suplementado con N
y P para compensar la tasa de crecimiento. Los cuatro
tratamientos registraron valores estadísticamente iguales
de biomasa seca, pero las plantas con micorriza registraron mayor
tasa fotosintética y área foliar y menor
concentración de fósforo en el follaje, asociando
estos valores con la nutricion fosforada (o la presencia de
hongos MA).
Un año más tarde, los mismos
investigadores (utilizando los mismos tratamientos), evaluaron la
eficiencia fotosintética en las plantas con micorriza y
vieron un efecto aditivo del hongo MA y la bacteria fijadora de N
en la fijación de CO2.
Bethlenfalvay y col. (1989) evaluaron la respuesta
fisiológica, morfológica y nutricional de sistemas
Glycine max – Bradyrhizobium inoculados con
aislados micorrícicos de tres zonas climáticas
árida (AR), semiárida (SA) y una zona mésica
(ME) y un control sin hongo micorrícico, observando
diferencias consistentes entre el tratamiento inoculado con el
aislado AR y el resto de los tratamientos. La fotosíntesis
y la actividad del nódulo fue mayor en todos los
tratamientos con micorriza y únicamente el tratamiento
inoculado con el aislado AR registró mayor eficiencia
fotosintética en base al uso del agua que el tratamiento
control.
Fay y col. (1996) evaluaron el efecto de MA sobre el
crecimiento y fotosíntesis de cebada sembrada bajo cinco
niveles de fósforo (50, 100, 200, 400 y 800 mg P/kg). El
porcentaje de infeccion MA fue bajo y su valor disminuyó a
medida que se incrementó el nivel de fósforo
aplicado. La fotosíntesis y la eficiencia en el uso de N y
P fueron mayores en las plantas con micorriza fertilizadas con el
nivel más bajo de fósforo.
Ruiz-Lozano y Azcon (1995) evaluaron el efecto de dos
hongos MA (Glomus fasciculatum y Glomus deserticola) y
un control sin MA (pero suplementado con P) y tres niveles de
humedad sobre la fotosíntesis en plantas de lechuga
(Lactuca sativa L.). G. fasciculatum
incrementó significativamente la fotosíntesis y la
eficiencia en el uso del agua, G. deserticola fue
más eficiente para asimilar nutrimentos como N, P y
K.
La simbiosis MA es reconocida por sus múltiples
efectos positivos sobre el crecimiento de las plantas y su
importante contribución en el mantenimiento de la
fertilidad del suelo, la mayor y más rápida
asimilación de nutrimentos (McArthur y Knowles, 1993), el
aumento de la tolerancia al estrés hídrico de
plantas colonizadas (Subramanian y col, 1995), la
protección contra fitopatógenos (Sharma y col,
1992), mejoramiento de la estructura del suelo (Tisdall y col,
1997), la expresión de genes (Murphy y col, 1997) y la
modificación en el contenido de proteínas y del
perfil de polipéptidos (Arines, et al, 1993) son los
mecanismos por medio de los cuales la simbiosis MA modifica
(positivamente en la mayoría de los casos) el
comportamiento fisiológico de las plantas colonizadas,
sobre todo bajo condiciones poco favorables para su crecimiento y
desarrollo.
Para la realización de este proyecto se eligieron
los materiales de frijol comercial mas consumidos en la
República Mexicana donde se determinó que la
demanda de frijol en México depende de las raíces
culturales y regionales, destacándose la siguiente
tendencia:
En el noroeste, los frijoles claros.
En el norte, el frijol pinto.
En el centro, el flor de mayo y flor de
junio.En el sur, el frijol negro.
(Sagarpa, 2004)
Es por lo anterior que los cinco materiales comerciales
elegidos fueron los frijoles Peruano, Texano, Flor de Mayo, Negro
Jamapa y Negro Michigan, los cuales fueron adquiridos en un
centro comercial y cuya marca es de las mas consumidas por la
población.
Peruano
Proveniente de los estados de Nayarit, Sonora y Sinaloa.
Es un frijol grande, de forma oval, muy grueso y color amarillo
pálido. Se vende principalmente en Jalisco y Nuevo
León.
Pinto Texano
Es un frijol grande, de forma oval, de color beige y con
muchas manchas color café, viene de Chihuahua, Durango y
Zacatecas.
Flor de Mayo
Se cultiva en Zacatecas y Guanajuato, de tamaño
mediano a grande, su forma va de oval a romboide abultado, es de
color beige claro con manchas lilas, es el segundo frijol claro
preferido en el país.
Negro Jamapa
Proviene de Nayarit, es pequeño, de forma oval y
aplanado, es de color negro opaco, y es de los preferidos en la
Ciudad de Mexico
Negro Michigan
Regularmente viene de Zacatecas y Durango o de Estados
Unidos, es un frijol de tamaño mediano, de forma oval,
abultada y su color es negro brillante, se consume principalmente
en la ciudad de México, el sureste y el Golfo.
Las semillas de frijol fueron sembradas bajo 3
tratamientos diferentes. El primero recibió condiciones
normales en su siembra. El segundo se inoculó con una
bacteria promotora del crecimiento (PGPR) y el tercero se
inoculó con un hongo micorrícico arbuscular (HMA),
posteriormente se determinó la producción del
frijol, el peso y la longitud de la semilla, analizando el efecto
de cada inoculación.
Cepas microbianas
1) Bacteria Promotora del crecimiento
(PGPR): Bacillus subtilis2) Hongo Micorrícico
Arbuscular (HMA): Glomus mosseae
Tratamientos
Para cada material comercial de frijol se utilizaron 45
macetas con una capacidad de 5 litros y el suelo con el que se
rellenaron fue una mezcla de arena/limo previamente bromurada en
una proporción 3:1, Se necesitaron 15 macetas en cada
tratamiento (frijol-control, frijol-Bacillus y
frijol-Glomus), siendo en total 3 tratamientos por
material comercial de frijol.
1) Cada una de las 75 macetas destinadas al
tratamiento con la bacteria promotora del crecimiento
Bacillus subtilis, se inocularon con 10ml de una
infusión PDA (Papa-Dextrosa-Agar) de estas bacterias
con una concentración de 10-7 UFC/ml.2) Las 75 macetas utilizadas para el
tratamiento con hongo micorrícico fueron inoculadas
con 100gr de suelo con esporas de Glomus moseae con
una concentración de 13 esporas por gramo de
suelo.3) En el caso de las 75 macetas utilizadas como
control, estas no recibieron ningún tratamiento antes
de la siembra de los frijoles.
Los riegos fueron constantes de 2 a 3 veces por
semana
Siembra-Cosecha
Dentro del invernadero, cada maceta de una manera
azarosa se sembró con 3 semillas de cada material de
frijol en los 3 diferentes tratamientos (15 repeticiones cada
uno) y cada maceta fue etiquetada debidamente. Después
solo se dejaron 2 plantas de frijol por maceta.
El riego de agua se realizó tres veces por semana
a partir de la germinación de la semilla.
A los 30 días desde la siembra, las macetas
inoculadas con la bacteria Bacillus subtilis fueron reinoculadas
bajo las mismas especificaciones del día de la
siembra.
A los 90 días se aplicó una dosis de
fertilización con la solución Long Ashton con 11
ppm de fósforo para las macetas inoculadas con hongo
micorrícico Glomus mosseae y 22 ppm de
fósforo para las inoculadas con Bacillus subtilis
y la plantas control. Ésta misma fertilización se
repitió a la semana siguiente, fortaleciendo a las plantas
en su etapa de floración.
Producción total de frijol
Al término de la cosecha de cada planta, se
cuantificó la totalidad de vainas y frijoles obtenidos en
cada variedad comercial de frijol, posteriormente se
determinó el peso de la producción
total.
Peso de frijoles cosechados
Se determinó el peso de 100 semillas de cada
variedad de fríjol utilizando una báscula
analítica Sartorius tipo 1574, posteriormente se
determinó la longitud de las semillas.
Longitud de la semilla
El 10 % de la producción total de cada material
comercial obtenido fue separado para determinar la longitud de la
semilla de frijol, dichas semillas se tomaron de una manera
azarosa y la medición correspondiente fue realizada con
ayuda de un Vernier Mitutoyo Digital.
Procesamiento de la semilla
Para llevar a cabo los análisis posteriores fue
necesario almacenar las semillas a una temperatura de 4 oC.
Después fueron secadas durante 36 horas a una temperatura
de 37 oC y a continuación se prosiguió a moler las
semillas de frijol, en un molino Analytical Mill A-10
Tekmar. La harina de cada material comercial de frijol fue
cernida en un tamiz # 40 y se mantuvo en refrigeración
hasta su análisis, protegiéndola de la
luz.
B.1 POLIFENOLES
Obtención de los extractos para el
análisis de fenoles totales
Para llevar a cabo la extracción de los
compuestos fenólicos totales se llevó a cabo lo
siguiente, se pesaron 200 mg de harina de cada muestra de frijol
en tubos Eppendorf, se les adicionó 1 mL de metanol al 80
% y se dejaron en agitación a 80 rpm, durante toda la
noche. Después se centrifugaron las muestras a 13,000 g
durante 10 min. y el sobrenadante fue separado. El residuo
sólido fue resuspendido de nuevo en 1 mL de metanol 80 % y
se mantuvo en agitación por dos horas más y se
centrifugó de nuevo. Los dos extractos obtenidos en cada
muestra se combinaron y se protegieron de la luz. Posteriormente
se almacenaron a 4 °C hasta su análisis.
Determinación de fenoles
totales
Para llevar a cabo la extracción de los
compuestos fenólicos totales se realizó lo
siguiente, se pesaron 200 mg de harina de cada muestra de frijol
en tubos Eppendorf y se adicionó 1 mL de metanol 80 %,
después las muestras de dejaron en agitación a 350
rpm, durante toda la noche (8 horas). Transcurrido este tiempo
los tubos fueron centrifugados a 12,500 g durante 15 min a una
temperatura de 4 oC y el sobrenadante fue separado. El residuo
sólido fue resuspendido de nuevo en 1 mL de metanol 80 % y
se mantuvo en agitación por dos horas más y se
centrifugó de nuevo. Los dos extractos obtenidos en cada
muestra se combinaron y se protegieron de la luz. Posteriormente
se almacenaron a 4 oC hasta su análisis.
La determinación de los fenoles totales en cada
muestra de harina de frijol, se llevó a cabo por
triplicado de acuerdo al método de Folin-Ciocalteu
descrito por Singleton y Rossi en 1965. Para esto se tomaron 50
µL del extracto total (obtenido siguiendo las indicaciones
del párrafo anterior) y se le adicionaron 200 µL de
agua desionizada y 250 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu
(50 % v/v). Esta mezcla se agitó vigorosamente y
después de 3 min se adicionaron 500 µL de Na2CO3
(7.5 % w/v) y de nuevo se agitó vigorozamente.
Después las muestras fueron incubadas a 45 °C por 15
min y al concluir este periodo de tiempo, las muestras se
centrifugaron 5min y posteriormente se midió la
absorbancia a cada muestra a una longitud de onda de 760 nm.
Estas determinaciones fueron realizadas mediante el uso del
espectrofotómetro Beckman DU 640. Para llevar a cabo los
cálculos se preparó una curva de calibración
con ácido gálico y otra de (+) catequina y la
concentración fue expresada en miligramos equivalentes de
ácido gálico o catequina por gramo de harina de
frijol, respectivamente.
Determinación de taninos
condensados
La determinación de los taninos condensados al
igual que la determinación de los fenoles totales, se
realizaron por triplicado, pero en este caso la
metodología utilizada fue la propuesta por Deshpande y
Cheryan en 1987, llamado el método de la vainillina-HCl.
Para llevar a cabo dicho método se comenzó con la
extracción de dichos compuestos de la manera que se
describe a continuación. A 100 mg de cada muestra de
harina de frijol se le adicionó 1 mL de metanol
acidificado al 1 %, manteniendo una agitación constante
durante 8 h. Al concluir este tiempo las muestras se centrifugan
a 13,000 g durante 10 min.
Después se tomaron 166 µL de dicho extracto
y se le adicionaron 834 µL del reactivo de vainillina al
0,5 %. Después se agitó vigorosamente y enseguida
se incubó a 30 °C durante 20 min. La absorbancia fue
leída a 500 nm usando un espectrofotómetro Beckman
DU 640. Con el fin de corregir la interferencia de los pigmentos
naturales del frijol, fue necesario preparar un blanco elaborado
con cada muestra de harina de frijol junto con todos los
reactivos descritos, menos con el reactivo de vainillina.
También se preparó una curva de calibración
de (+) catequina para realizar los cálculos y el contenido
de taninos fue expresado como miligramos equivalentes de (+) –
catequina por gramo de harina de frijol.
Determinación de antocianinas
totales
En el caso de la determinación de las
antocianinas totales, estas se realizaron por triplicado mediante
el método descrito por Abdel-Aal y Hucl en 1999. Para esto
se obtuvo un extracto etanólico a partir de 100 mg de
harina de frijol donde se adicionaron 5 mL de etanol-HCl 1 N
(85:15 v/v) precedido por una agitación vigorosa. El pH de
esta solución obtenida se ajustó a pH 1 con HCl 4
N. La mezcla fue agitada durante toda la noche y posteriormente
se centrifugó por 15 min a 13,000 g. El sobrenadante se
introdujo en un matraz volumétrico de 10 mL y se
aforó con etanol acidificado y por último se
midió la absorbancia a una longitud de onda de 535 nm.
Para realizar los cálculos de cada muestra se
utilizó el coeficiente de extinción molar (25,965
cm-1 M-1) y el peso molecular de la cianidina 3 –
glucósido (C3G) (449,2) y los resultados fueron expresados
como miligramos de cianidina 3 – glucósido por gramo de
harina.
Determinación de antocianinas por
HPLC
Los análisis de HPLC fueron realizados usando un
equipo Hewlett Packard Serie 1050 de longitud de onda variable.
Software Agilent Chem Station for LC3D 1990 – 2003 y una columna
de separación EPS C – 18 (7 x 53 mm) Rocket GRACE/ALLTECH.
El solvente A fue agua con ácido fórmico al 5 % y
el solvente B fue acetonitrilo con ácido acético al
5 %. El volumen de inyección fue de 20 ul con un flujo de
1 mL/min a una absorbancia de 220 nm. Para la elución de
las antocianidinas el gradiente lineal fue:
La detección de los compuestos se efectuó
en base a los tiempos de retención de cada estándar
utilizado.
Figura 2. Cromatograma típico obtenido por
HPLC por una mezcla de estándares de
antocianidinas
La concentración de cada antocianidina
determinada se obtuvo en base a la curva de calibración
obtenida para cada estándar.
Extracción e hidrólisis de antocianinas
por HPLC
Para llevar a cabo la extracción de las
antocianinas se siguió el protocolo descrito por Romani y
col. (2004). Dichos extractos se obtuvieron a partir 500 mg de
cada harina de frijol a los cuales se les adicionó 15 mL
de metanol (70 %), dicha mezcla tuvo que ajustarse su pH a 2 con
ácido fórmico y después fue puesta en
agitación a 80 g durante 3 h. Este proceso se
realizó tres veces sobre la misma muestra y todos los
extractos fueron combinados y evaporados a sequedad con ayuda de
un rotavapor, el residuo finalmente se resuspendió en 2 mL
de H2O/CH3CN/MeOH/HCOOH (45:22,5:22,5:10 v/v/v/v).
Después de terminados los pasos anteriores se
realizó la hidrólisis de las muestras para evitar
la presencia de mezclas de glucósidos de antocianinas,
Para esto se siguió el método de Takeoka y col.
(1997) donde se señala que a 1 mL del extracto se le
adiciona 1,0 ml de HCl 2N y se coloca en un baño de agua
hirviendo por 60 min. y enseguida se enfrían los tubos en
baño de hielo. Estos pasos fueron seguidos al pie de la
letra y las antocianinas se extrajeron dos veces con 2 mL acetato
de etilo (Baker) y se llevaron a sequedad en un rotavapor.
Después se resuspendieron en 1 mL de ácido
fórmico al 10 % para finalmente, centrifugar dicho
extracto a 13,000 g durante 10 min. y se inyectó
rápidamente en el HPLC para ser analizado.
B.2 PROTEÍNA SOLUBLE TOTAL
Extracción
Para llevar a cabo la extracción de
proteína soluble total se pesaron 50 mg de harina de cada
muestra y se disolvieron en 1ml de buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,2
(preparado a partir de Tizma-HCl SIGMA 1 M, pH 8,0
T-2694).
Se agitó cada muestra con vortex y después
las muestras fueron colocadas en baño de ultrasonido por
70 min, el agua del baño estuvo en recirculación
constante a una temperatura entre 39 – 41 oC y las muestras
fueron mezcladas con vortex cada 10 min. Se hicieron dos
extracciones independientes para cada muestra.
Pasados los 70 min, todos los tubos fueron centrifugados
a 18000 g por 30 min a 8 oC. Después el sobrenadante fue
separado.
Ensayo en Microplato para Proteina DC
Para llevar a cabo la determinación de
proteína soluble total presente en cada muestra, fue
necesario realizar una curva de calibración
estándar de proteína. El reactivo utilizado fue
Albúmina de suero bovino para electroforesis con una
concentración mínima de 98 % (BIO-RAD 500-0116/CAS
9048-46-8)
Dicha curva de calibración se realizo pesando 15
mg de Albúmina diluyéndola en 10 ml de agua
desionizada (1500 ug/ml) y se hicieron las diluciones
correspondientes en agua desionizada para obtener soluciones con
concentraciones de 1200 ug/ml, 900 ug/ml, 600 ug/ml, 300 ug/ml,
100 ug/ml, 30 ug/ml y 10 ug/ml.
Después se procedió al tratamiento de cada
muestra, para esto cada una se diluyó a una
concentración 1:100 (5 ul muestra + 495 ul de agua
desionizada) y a partir de esta dilución se tomaron 5 ul
cada muestra y cada solución estándar y fueron
puestos en orden dentro de un plato de microtitulación
limpio para su análisis posterior.
Cuando la última muestra fue depositada en el
microplato, inmediatamente que se añadieron 25 ul del
Reactivo A en todos los pocillos (Reactivo A para ensayo de
proteína DC, BIO-RAD). Terminada la adición de
dicho reactivo inmediatamente se añadió el Reactivo
B de la misma manera en cada uno de los pocillos. (Reactivo B
para ensayo de proteína DC, BIO-RAD). Se agitó el
microplato suavemente y después de 15 min se
determinó la absorbancia de cada uno de los pocillos a una
longitud de onda de 630 nm en el equipo ELx 808IV Ultra
Microplate Reader (BIOTEC Instruments) (Urbana, Illinois). Dicho
análisis se realizó por triplicado.
Determinación del peso molecular de las
proteínas por medio de SDS- PAGE
Para llevar a cabo la determinación del peso
molecular de las principales proteínas presentes en cada
muestra de harina de frijol, se utilizó la electroforesis
SDS-PAGE, para esto fue necesario el uso de geles con una
concentración en gradiente de 4 – 20% de poliacrilamida,
dodecil-sulfato de sodio (BIO-RAD).
De cada muestra se aplicaron 50 ug de proteína en
el gel. Para esto fue necesario utilizar los resultados de la
cantidad total de proteína soluble presente en cada
extracto y a partir de ellos se hicieron los cálculos
correspondientes para conocer el volumen de carga.
Las siglas asignadas a cada material de frijol son las
siguientes, NMC, negro Michigan control, NMB, negro
Michigan-Bacillus, NMG, negro Michigan-Glomus,
NJC, negro Jamapa-control, NJB, negro Jamapa-Bacillus,
NJG, negro Jamapa-Glomus, FMC, Flor de mayo-control,
FMB, Flor de mayo-Bacillus, FMG, Flor de mayo-
Glomus, PC, Peruano-control, PB,
Peruano-Bacillus, PG, Peruano-Glomus, TC,
Texano-control, TB, Texano-Bacillus, TG, Texano-
Glomus.
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