Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1

Resumen

Se desarrollo el método PCR-Rep1 para diferenciar
serovares de Leptospira sp, para ello se optimizaron
condiciones de PCR. Se tomaron 25 serovares referenciales del
cepario del Laboratorio de Zoonosis Bacteriana del Instituto
Nacional de Salud para la optimización del ensayo, y 20
muestras positivas por PCR convencional (Cinco de aguas, cinco de
sangre, cinco de orina y cinco de tejido (riñón de
roedores) para evaluar el poder de la prueba. Se evidencio que la
mejor extracción y purificación de ADN fue usando
el kit Qiamp DNA Tissue de QIAGEN. Las condiciones optimas para
el PCR Rep1 fueron: Temperatura de hibridación: 49,1°C
Cloruro de Magnesio: 3mM, Enzima: 2.5 Unidades ,200uM dNTPs, 2uM
Primer y 100 ng de ADN para un volumen final de 50 ul.

El PCR Rep1 permitió la diferenciación
entre serovares de diferentes especies patógenas de
importancia epidemiológica como: L. interrogans, L.
borgpetersenii, L. weilii, L. kirscheni, L. santarosae, L.
alexanderi, L. biflexai y L.noguchi. El ensayo mostró
una sensibilidad del 72.7% con respecto al método
referencial MAT. La reproducibilidad fue de 88,9%. La prueba
mostró ser inespecífica, se observo
amplificación en DNA de otros agentes etiológicos
como Pseudomonas aeruginosa, Bartonella sp,
Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella
sp.

El poder de la prueba fue evaluado con muestras de agua,
sangre, orina y tejido; se observo una inhibición en la
muestra de orina. No se obtuvo un patrón de bandas
diferenciable entre las muestras.

El PCR Rep1 optimizado permitió diferenciar
serovares de relevancia epidemiológica como: mankarso,
icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi,
autummalis, bataviae canicola y wolffi de L
.interrogans; ballum y javanica de L.
borgpetersenii; asi como diferenciar entre las especies
L. weilii, L. kirscheni, L. santarosae, L. alexanderi, L.
biflexa y L. noguchi, mientras que algunos serovares no
pudieron ser diferenciados.

El PCR-Rep1 provee un método rápido y poco
costoso comparado a otras pruebas moleculares y serologicas para
la identificación de serovares de Leptospira sp y
puede ser usado para la caracterización de aislamientos
durante un brote epidémico.

Palabras claves: Zoonosis bacteriana, leptospirosis,
serovar, PCR Rep1.

ABSTRACT

The development of Rep1 PCR for differentiating
serovares in Leptospira sp, implied the standardize the
conditions the Rep1 PCR . 25 serovares referential of National
Institute of Health –Lima –Perù were took and
20 samples (5 in water, 5 in blood,5 in urine,5 tissue in
kidney),the better method of extraction for DNA was using the kit
Qiamp QIAGEN, thus the better conditions for Rep1 PCR were for
temperature of hybridization 49.1°C, 3mM Mg, 2,5 U Enzyme ,
200uM dNTPs, 2uM Primer and 100ng DNA in a final volume of 50 ul
of reaction.The Rep1 PCR has differentiated between serovares
patogens of main species :L.interrogans,
L..borgpetersenii: L. weilii ,L.kirscheni ,L.santarosae
,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi.The Rep1 PCR has shown
a sensibility of 72.7% respect to the referential method
MAT,88,9% of reproducibility ,in the specify the Rep1 PCR has had
cross reactions with Pseudomonas aeruginosas, Bartonella
sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella
sp 5/7 samples evaluates =72% of unspecific .Respect to the
inhibition evaluated in the samples in water, blood, urine and
tissue in kidney have seem a hard inhibition in the samples in
the urines.

The Rep1 PCR could differentiated between serovares the
main epidemiologic interest: mankarso, icterohaemorrhagiae,
cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae
,canicola and wolffi (L.interrogans), ballum and
javanica (L.borgpetersenii), L. weilii ,L.kirscheni
,L.santarosae ,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi.The Rep1
PCR could not differentiated within the serovares
australis,bratislava,mankarso (L.interrogans)same
happened within serovares icterohaemorrhagiae ,copenhageni ,
djansiman y hardjo(L. interrogans).

.The inhibition in the urines could be possible because
the presence of urea.The Rep1 PCR provide a method faster and
less expensive compared other methods molecular and serologic by
classifying serovares in Leptospira by using in the
cases like to outbreaks where the time and easily method is
necessary.

Introducción

La "Leptospirosis" es una de las Zoonosis bacteriana
distribuida ampliamente a nivel mundial y de mucha importancia en
Salud Publica. Es causada por una espiroqueta patogénica
del genero Leptospira presente en una gran variedad de
mamíferos que actúan como reservorios, algunos de
importancia en las zonas rurales y urbana por ejemplo ganado
vacuno, porcino, caprino, canes, marsupiales y roedores los
cuales presentan una alta probabilidad de transmitir la
enfermedad al ser humano (8).

La bacteria Leptospira sp se encuentra en la
familia Leptospiracia que incluye dos géneros
Leptospira y Leptonema , Leptospira sp
es una bacteria estrictamente aeróbica y presenta una gran
movilidad (32).