Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1 (página 2)

Taxonomicamente las leptospiras se pueden clasificar por
métodos serologicos como el CAAT (Prueba de
aglutinación cruzada y absorción) en la que el
taxón básico s el serovar en la que los anticuerpos
son dirigidos contra los lipopolisacaridos
leptospirales.

Recientemente se han realizado pruebas moleculares para
poder clasificar genomaespecies con una clasificación de
17 especies (32).

En el Perú la leptospirosis esta distribuida en
especial en la región nororiental del país como
Loreto y San Martín (8).

Debido a la importancia de esta zoonosis bacteriana
surge la necesidad del uso de antimicrobianos efectivos contra la
bacteria patogénica Leptospira sp así como
el uso de técnicas de identificación efectivas para
el diagnostico. En la actualidad existen técnicas como el
MAT (Prueba de Microaglutinacion) el cual es usado como el
método de referencia, para esta prueba se necesita de una
batería antigénica en constante mantenimiento lo
cual implica un riego en el manejo de la misma, además el
uso de MAT esta confinado a pocos laboratorios referenciales por
la infraestructura necesaria. Otra técnica de amplio uso
es la prueba de ELISA de mucha ayuda como prueba tamiz, pero
carece de la capacidad de caracterizar serovares de
Leptospira sp. Es importante mencionar que tanto MAT
como ELISA por ser pruebas serologicas requieren un tiempo
mínimo de 7 días para la formación de
anticuerpos, esta es su principal desventaja para emplearlas
durante un diagnostico temprano (casos agudos) donde el tiempo de
identificación del agente etiológico es importante.
(2).

El uso de pruebas moleculares resuelve el factor tiempo,
además de presentar en algunos casos mayor especificidad y
sensibilidad en comparación a las pruebas serologicas.
(22)

Entre las desventajas del uso de pruebas moleculares
como RFLP, PCR-IS1500 (Secuencia de inserción), RAPDs
están: alto costo (RFLP), falta de reproducibilidad
(RAPDs), así como la incapacidad para discriminar a nivel
de serovares (IS 1500), (14-15); esto ultimo
epidemiológicamente importante ya que reportes previos
sugieren una diferente actividad virulenta de los serovares
circulantes durante un brote (20). En tal sentido la prueba de
Rep 1 PCR se presenta como una alternativa a los métodos
moleculares actuales, ya que entre sus ventajas están: su
costo semejante al de una prueba de PCR convencional, la
utilización de un solo primer, la capacidad de discriminar
entre serovares obtenidos de un aislamiento a trabes de un
patrón de bandas, presentándose como una prueba
complementaria a la tipificación serologica y la
utilización de antisueros.

El objetivo del presente trabajo es lograr la
identificación de los serovares mas relevantes
epidemiologicamente a trabes del una prueba de
PCR-Rep1.

Marco
teórico

ANTECEDENTES

Las espiroquetas pertenecientes a la familia
Leptospiraceae fueron primero descubiertas en 1914 por Inada y
Cols en Japón, posteriormente Noguchi estudio los
microorganismos que Inada aisló de pacientes con
ictericia, observando una similar morfología con
espiroquetas saprofitas aisladas aproximadamente al mismo tiempo
en los Estados Unidos. Las espiroquetas saprofitas fueron
aisladas por Wolbach y Binger de agua estancada y fueron llamadas
Spirocheta biflexa, mientras que Inada llamo a su
aislamiento Spirocheta icterohemorrhagia. Al estudiar
los aislamientos japoneses Noguchi encontró diferencias
morfológicas entre todos los géneros de
espiroquetas conocidas y decidió en 1917 crear un nuevo
género de espiroquetas llamado Leptospira (9). En la
actualidad los aislamientos se realizan de sangre, tejidos aguas
u otros reservorios contaminados, el medio mas óptimo para
el aislamiento de Leptospira es el medio semisólido
EMJH.

Las pruebas moleculares para identificación de
Leptospira sp son relativamente modernas que aun
precisan más estudios sobre su efectividad y utilidad.
Entre las mas utilizadas tenemos: Marcado con sondas de ADN,
hibridación de ARN con marcaje radioactivo y PCR con mayor
efectividad en muestras de orina (7). La importancia de
diferenciar entre los numerosos serovares de Leptospira ha
llevado a muchos investigadores a ensayar múltiples
métodos moleculares. Zuerner en 1997 propuso una
diferenciación comparando un método de
hibridación (Southern Blot) y con un ensayo de PCR (5).
Anteriormente en Francia, Perolat y su grupo habían
evaluado los métodos de ribotipificacion, AP-PCR y MRSP
pero sin conseguir mayor diferenciación a nivel de
serovares (4). Los métodos de identificación
basados en hibridación de DNA como Southern Blot permiten
identificar la homologia o heterogeneidad dentro de un serogrupo,
así como conocer las relaciones genomicas entre las cepas
de Leptospiras (3).

El LSSP-PCR es una de las últimas técnicas
usadas llevando a cabo una re-amplificación en condiciones
de baja astringencia para obtener patrones de bandas que permitan
discriminar más allá del nivel de especies.
(10).

Estudios en diferentes especies de eubacterias sugieren
la existencia de secuencias de DNA repetitivas que fueron
descritas utilizando los métodos de PCR y la
hibridización por Slot blot. Entre estos se han estudiado
oligonucleótidos como: secuencias repetitivas
palindromicas extragenicas (REP), o elementos
íntergénicos repetitivos enterobacteriales de
consenso (ERIC), estas secuencias obtenidas a trabes de
amplificación por PCR, producen patrones de bandas a
trabes de un gel de agarosa. Estas bandas han mostrado
fingerprints inequívocos de diferentes especies de
eubacterias (6).

Los métodos en los que se usan elementos
repetitivos para la diferenciación de Leptospiras han dado
mejores resultados, en combinación con digestión
con endonucleasas de restricción (1).

Un estudio reciente en el que se realizo una
búsqueda de regiones repetitivas permitió
desarrollar un método de análisis del numero de
repeticiones en tandem multi-locus variable (MLVA), encontrando
seis regiones muy informativas para la diferenciación de
algunos serovares de Leptospira interrogans
(11).

Generalidades

1.-TAXONOMÍA Y
CLASIFICACIÓN

Las Leptospiras pertenecen a familia Leptospiraceae,
segunda familia del orden Spirochaetales. En los últimos
años y gracias a la utilización de nuevas
herramientas y métodos de clasificación, se han
reconocido varias especies del género
Leptospira.

Clasificación taxonómica y especies de
Leptospira sp. (28)

División: Procariontes

Clase: Schizomicete

Orden: Spirochaetales

Familia: Leptospiraceae

Géneros:

Leptospira Leptonema Turneria

Otros géneros relacionados

Familia: Spirochaetaceae

Género: Cristispira

Spirochaeta, Brachyspira, Brevinema, Anguilina,
Serpulina, Treponema, Borrelia

Especies de Leptospira

Patógenas y Saprofitas

L. interrogans 2

L. borgpetersenii

L. noguchii

L. santarosai

L. alexanderi 1

L. kirschneri

L. meyeri

L. fainei

L. Weilii

L. inadai,

L. Biflexa 3

L. wolbachii

L. parva

1 Fue descrita recientemente, pero su
capacidad patogénica no está clara todavía.
Sus estados patogénicos no han sido
esclarecidos.

2 Más de doscientos cincuenta serovariantes
agrupadas en veinticinco grupos

3 Sesenta y tres serovariantes agrupados en treinta y
ocho serogrupos (No patógena para humanos
inmunocompetentes).

1.1 CLASIFICACIÓN
SEROLÓGICA

Antes de 1989, el género Leptospira fue dividida
en dos especies, L. interrogans, que incluye todas las
Leptospiras patógenas y/o de vida parasitaria, y L.
biflexa, especie en la que se agrupan todas las saprofitas
aisladas del medio ambiente (22). A pesar de que esta
denominación es la que se ha estado utilizando durante
varios años, fue oficialmente admitida en 1986. Las dos
especies pueden ser diferenciadas por cualidades culturales
L. biflexa crece a 13º C en presencia de 225ug/mL
de 8-azoguanina, mientras que L. interrogans es negativa
para ambas propiedades (22).

Los seroprupos no poseen taxonómica propia ni se
encuentran definidos, pero tienen importancia
epidemiológica (22).

El serovar es el taxón básico. Dentro de
cada especie de Leptospira, se incluyen uno o más
serovares, que se diferencian entre si por su composición
antigénica (2). La definición de serovar fue
formulada por primera vez en 1954 por Wolff y Broom, y no fue
únicamente por clasificación sistémica, sino
para su aplicación práctica y la descripción
de la relación entre hospedero-parásito. La
clasificación actual utiliza lo que estos dos autores
dejaron planteado acerca de la determinación de los
serogrupos y serovares (20). Por razones prácticas, los
serovares relacionados antigenicamente se clasifican bajo el
mismo serogrupo. Esta forma de clasificación es referida
como la clasificación clásica u oficial y esta
basada en las técnicas de aglutinación cruzada tras
absorción utilizando el método de
aglutinación microscópica (CAAT). (22)

1.2 Clasificación Alternativa

La aparición de nuevos métodos de
clasificación e identificación de Leptospira,
responde a la necesidad de encontrar métodos más
fiables y de menos subjetividad que el método
clásico que además está considerado como
lento y difícil de estandarizar (18). Aunque se recomienda
que el sistema de clasificación taxonómica siga
basándose a nivel de serovar, otros métodos
opcionales para la identificación y clasificación
han sido desarrollados como: anticuerpos monoclonales, patrones a
partir de fragmentos de restricción, sondas de ADN,
estudios de actividad aminopeptidasa, microscopia
electrónica, etc (25).

Diagnóstico

2.1.-DIAGNÓSTICO
EPIDEMIOLÓGICO

En aquellos cuadros compatibles con Leptospirosis en
humanos, se debe considerar los siguientes aspectos:
Síntomas clínicos, edad, sexo, dirección,
ocupación, antecedentes y lugar de exposición
(contacto con animales,y fuentes ambientales), factores
climáticos: precipitación, temperatura,
inundación, desastres naturales, fecha de inicio de
síntomas, fecha del diagnóstico. (22)

2.2.-DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Tiene un carácter presuntivo y se realiza
fundamentalmente a través de los signos y síntomas
que presenten los humanos como ictericia, anorexia, dolor de
cabeza, vómitos, mialgia, dolor abdominal, náuseas,
tos, hepatomegalia, limfadenopatia y diarreas. Además las
lesiones anatomopatológicas características de la
enfermedad aportan una gran ayuda (21).

2.3.-DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Las técnicas bacteriológicas son las
más complejas, pero son las que brindan resultados
más confiables, confirmando a trabes del aislamiento y la
identificación del microorganismo.

Los métodos serologicos se pueden dividir en:
técnicas indirectas, que detectan anticuerpos contra las
leptospiras y las técnicas directas encaminadas a la
detección de leptospiras o sus antigenos. (22)

2.3.1 MÉTODOS DE DIAGNOSTICO

TECNICAS INDIRECTAS

Prueba de Microaglutinacion (MAT)

Es el método serológico de referencia a la
hora de evaluar otras pruebas para el diagnóstico de
Leptospirosis. Se emplea para detectar anticuerpos en sueros de
sospechosos o enfermos (humanos y animales) donde el suero del
paciente sospechoso y enfermo reacciona con antígenos
vivos de leptospiras de 10 días de crecimiento en medio
líquido EMJH enriquecido, y es el más utilizado
cotidianamente (19).

El MAT fue ideado por Martin, en 1917 y en 1918, Martin
y Pettit lograron describir el fenómeno de
aglutinación y "lisis" con suero (20). Desde entonces, el
método ha sido modificado y mejorado por Schüffner y
Mochtar, 1926;Borg-Peterson y Fagroeus, 1949; Wolff, 1954;
Carbrey, 1960; Galton , 1965;Cole , 1973; Sulzer y Jones, 1973.
Ellos trataron de estandarizar factores como: tiempo y
temperatura de incubación, el punto de corte de la
concentración de antígeno y la fecha de
siembra.

En la actualidad, para obtener una adecuada
sensibilidad, se recomienda utilizar serovares representativos de
todos los serogrupos presentes en un lugar determinado. El
título de anticuerpos del suero será la
dilución más alta en la cual encontramos 50 % de
aglutinación. En seres humanos para este método se
considera lo siguiente:

En caso de una sola muestra, el título
serológico = 1:800 confirma el diagnóstico. Los
títulos comprendidos entre 1:50 y 1:800 deben ser
interpretados en el marco de la situación
clínico-epidemiológico del paciente. Para las
muestras pareadas, 1:1600 o más es confirmatorio.
(22)

A pesar de ser la prueba más recomendada y
extendida, presenta una serie de desventajas: no distingue
anticuerpos vacunales de los de infección (17), resulta
difícil su estandarización ya que su
valoración es subjetiva, requiere el mantenimiento de
cultivos de leptospiras y no siempre detecta a los animales
infectados, en especial cuando el serovar implicado es hardjo,
que presenta como característica ser poco
antigénico. (30) 9

ELISA

Las limitaciones del MAT han obligado a los
científicos a emplear otra técnica que ayude a la
detección de anticuerpos en otras condiciones. La prueba
de ELISA es capaz de detectar IgM durante la primera semana de la
enfermedad (16) y la detección tardía de IgG que
permite diferenciar infecciones recientes de pasadas La
detección de anticuerpos específicos IgM con una
sola muestra es confirmatoria de una infección reciente
por leptospiras. (24).

Aglutinación
macroscópica:

Se desarrolló para evitar los problemas derivados
del mantenimiento de cepas vivas de leptospiras en el
laboratorio. Pocos autores la recomiendan debido a su falta de
sensibilidad y porque no es capaz de determinar el serovar
(31)

Hemoaglutinación indirecta
(HA):

Es una prueba serológica
género-específica de alta sensibilidad que utiliza
eritrocitos de ovejas o del grupo sanguíneo O humano. A
pesar de que siempre se ha considerado de utilidad, no ha llegado
a desplazar al MAT y de hecho, se utiliza de manera paralela a
él. (23)

TÉCNICAS DIRECTAS

La demostración de la presencia de Leptospiras, o
sus componentes en la sangre, tejidos y/o leche de animales y
humanos con signos clínicos es de gran valor
diagnóstico.

Observación en microscopio de campo
oscuro: Este método se realiza para la
observación de leptospiras en los fluidos
orgánicos. Es difícil debido al gran número
de artefactos que, por su parecido con las leptospiras, pueden
crear confusión. Además precisa que esten presente
un gran número de microorganismos en las muestras.
(22)

Inmunofluoresencia:

Es adecuada para la detección de leptospiras. Su
mayor desventaja es que requiere la producción de
antisueros policlonales de buena calidad y se requiere
microscopio de fluorescencia. (19)

Métodos de Diagnostico
Molecular

La relevancia de la identificación de los
serovares de Leptospira sp estimulo el desarrollo de
técnicas moleculares, entre las mas utilizadas tenemos:
Marcado con sondas de ADN, hibridación de ARN con marcaje
radioactivo y PCR con mayor efectividad en muestras de orina (7).
La importancia de diferenciar entre los numerosos serovares de
Leptospira ha llevado a muchos investigadores a ensayar
múltiples métodos moleculares. Zuerner en 1997
propuso una diferenciación comparando un método de
hibridación (Southern Blot) y con un ensayo de PCR (5).
Anteriormente en Francia, Perolat y su grupo habian evaluado los
mètodos de ribotipificacion, AP-PCR y MRSP pero sin
conseguir mayor diferenciación a nivel de serovares (4).
Los métodos de identificación basados en
hibridación de DNA como Southern Blot permiten identificar
la homologia o heterogeneidad dentro de un serogrupo, así
como conocer las relaciones genomicas entre las cepas de
Leptospiras (3).

El LSSP-PCR es una de las últimas técnicas
usadas llevando a cabo una re-amplificación en condiciones
de baja astringencia para obtener patrones de bandas que permitan
discriminar más allá del nivel de especies.
(10).

Estudios en diferentes especies de eubacterias sugieren
la existencia de secuencias de DNA repetitivas que fueron
descritas utilizando los métodos de PCR y la
hibridización por Slot blot. Entre estos se han estudiado
oligonucleótidos como: secuencias repetitivas
palindromicas extragenicas (REP), o elementos
íntergénicos repetitivos enterobacteriales de
consenso (ERIC), estas secuencias obtenidas a trabes de
amplificación por PCR, producen patrones de bandas a
trabes de un gel de agarosa. Estas bandas han mostrado
fingerprints inequívocos de diferentes especies de
eubacterias (6).

Los métodos en los que se usan elementos
repetitivos para la diferenciación de Leptospiras han dado
mejores resultados, en combinación con digestión
con endonucleasas de restricción (1).

Un estudio reciente en el que se realizo una
búsqueda de regiones repetitivas permitió
desarrollar un método de análisis del numero de
repeticiones en tandem multi-locus variable (MLVA), encontrando
seis regiones muy informativas para la diferenciación de
algunos serovares de Leptospira interrogans
(11).

Materiales y
métodos

Tabla 1

Serovares referenciales del Instituto
Nacional de Salud Lima-Perú

1. Cepas de Leptospira sp.

Se trabajo con parte del cepario del Laboratorio de
Zoonosis Bacteriana del Instituto Nacional de Salud, entre ellas
cepas referenciales utilizadas para tipificación y en el
MAT (Tabla 1), además de aislamientos provenientes de
diferentes regiones del país. Se realizo un pasaje de las
cepas tomando 1 ml de un cultivo conservado por 30 días y
se inoculo en 5ml de medio EMJH (Medio Ellinghausen y McCullough
modificado por Johnson y Harris) y se incubaron a 28ºC por
aproximadamente 8 días hasta que alcanzaron una

densidad celular de 108 células /ml medido por
espectrofotometría a 420 nm.

2. Extracción de DNA

Se compararon dos métodos de extracción de
DNA: El primero basado en la extracción por afinidad
usando mini columnas de silica con el kit Qiamp DNA Mini Kit
(QIAGEN, Holanda), el segundo método una variación
de la extracción usando Guanidina Isotiocianato
(GET-0.6gr/ml).La cantidad de DNA fue medido por
espectrofotometría a 260 nm y la calidad del producto con
la relación 260/280.

2.1. Extracción de DNA usando
GET

– Se sembraron 500uL de cultivo fresco de 8
diàs de incubaciòn para los 25 serovares de
Leptospira sp. en 5ml en medio EMJH y se incubaron a 28ºC
hasta alcanzar una densidad de 108 células /ml por 19
diàs.

– Se cosecharon, las células,
centrifugando a 8000 rpm por 15 minutos a 4 grados
centígrados, luego se elimino el sobrenadante.

– Se resuspendió el sedimento en 1 ml de buffer
TE 1X (Tris-HCl 10mM; EDTA pH 8.0 1mM), para lavar las
células. Se centrifugo a 14000 rpm por 10 minutos a 4
grados centígrados. Se elimino el sobrenadante

– Se resuspendió el sedimento en 100ul de
solución TE 1X conteniendo lizosima 50mg/ml, y se incubo a
37 ° C por 10 minutos.

-Se adiciono 500ul de solución GET, se agito
suavemente y se incubo por 5 minutos a temperatura
ambiente.

-Luego se adiciono 250 ul de acetato de amonio 7,5M
helado, se agito por inversión hasta homogenizar y se
coloco en hielo por 10 minutos.

– Se añadió 500 ul de cloroformo alcohol
isoamilico (24:1 V/V) y se mezclo suavemente por 5 minutos
mediante inversión, se centrifugo a 14000 rpm por 10
minutos y se transfirió cuidadosamente el sobrenadante a
un tubo nuevo.

-Se agrego 500 uL de etanol absoluto helado se
invirtió el tubo hasta observar la formación de una
nube de ADN por deshidratación. Este ADN deshidratado fue
extraido cuidadosamente con una pipeta Pasteur evitando su
ruptura.

-Se coloco en un tubo nuevo y se lavo 2 veces con etanol
70% el cual fue eliminado mediante aspiración con pipeta
Pasteur, se dejo secar por 5 minutos a 42 grados
centígrados.

– Al final el ADN se resuspendió en
100uL de buffer TE 1X. y se incubo a 65º C por 10
minutos.

– El DNA fue conservado a -20º
C

2.2. Extracción de ADN utilizando el Kit Qiamp
DNA Mini Kit (QIAGEN)

– Se sembraron 500uL de cultivo
fresco de 25 serovares de Leptospira sp. en 5ml en medio EMJH y
se incubaron a 28ºC hasta alcanzar una densidad de 108
células /ml

– Se cosecharon, las células,
centrifugando a 8000 rpm por 15 minutos a 4 grados
centígrados, luego se elimino el sobrenadante

– Se resuspendio el sedimento en 1 ml de buffer TE 1X
(Tris-HCl 10mM; EDTA pH 8.0 1mM), para lavar las celulas. Se
centrifugo a 14000 rpm por 10 minutos a 4 grados
centígrados. Se elimino el sobrenadante.

– Se resuspendió en 200uL de buffer TE
1X

– En un tubo de microcentrifuga de 2ml se agrego 20 ul
de proteinasa K

– Se coloco 200uL de las células
cosechadas

– Se coloco 200 ul de Buffer AL y se homogeniza en el
vortex por 20 segundos.

– Se incubo a 56º C x 10 minutos en Baño
maría.

– Se agrego 200 ul de etanol absoluto.

– Se transfirió la muestra a las mini columnas de
silica previamente preparada con un tubo colector.

– Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El tubo colector
es reemplazado con uno limpio y se agrego 500ul de buffer AW1 a
la minicolumna para el primer lavado.

– Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El tubo colector
es reemplazado con uno limpio y se agrego 500ul de buffer AW2 a
la minicolumna para el segundo lavado.

-Se centrifugo x 3 minutos a 13000 rpm. El tubo colector
es reemplazado con un tubo de mcirocentrifuga nuevo y se agrego
180 ul de buffer AE, para la elusión .

-Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El DNA fue
conservado a -20º C

3. Amplificación por PCR para evaluar la
eficiencia del método de extracción de
DNA

Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador
Perkin Elmer 9600. La reacción de PCR se realizo con 1.5mM
MgCl2, Buffer de PCR 1X (proporcionado con la enzima), 0.2uM
dNTPs, 1U de Ampli Taq DNA polimerasa (Applied Biosystems),20uM
de primer (5´GCG –GAC-TCA-TAC-CCG-CT 3´)
(Primer diseñado por Barocchi para amplificar secuencias
repetitivas de una librería genomica de
L.interrogans serovar copenhageni strain L1-130) en un
volumen final de 50ul. El ciclaje fue el siguiente: Denaturacion
inicial 94°C por 10 minutos, seguido por 35 ciclos de
94°C por 30 segundos, 50 °C por 1,5 minutos y 72° C
por 4 minutos y una extensión final de 72 °C por 7
minutos. Los productos de amplificación fueron resueltos
en un gel de agarosa al 1.5% a 90 voltios por 60 minutos en una
cámara Biorad. El gel fue teñido con bromuro de
etidio y visualizado en un transiluminador UV.

4.- Optimización de las condiciones del PCR –
Rep1.

Componentes de la reaccion

Se evaluaron las siguientes condiciones de PCR para un
volumen final de 50uL: Taq Polimerasa(0.5,1.5,2y2.5U), DNA( 50ng,
100ng,200ng,275ng,300ng,550ng,600ng,1100ng y 1200ng) ,inones de
Magnesio (1,5mM, 2mM, 2,5 mM y 3mM) Temperaturas de
hibridación en un termociclador en gradiente (46.5º,
47.7º, 49.1º, 51.4º, 52.3º C)

Limite de detección

El límite de detección fue obtenido
determinando la mínima concentración de DNA posible
para obtener un patrón de bandas capaz de proporcionar
diferenciación y que sea reproducible a través de
sucesivas repeticiones del método. Se realizo diluciones
sucesivas de 10-1 hasta 10-7

Sensibilidad de la prueba

La sensibilidad de la prueba se evaluó con la
formula

[(PA/N+)x100]
(Sachse,2003)

Donde:

PA = Resultados positivos obtenidos por el PCR
Rep1

N+ = Numero de muestras positivas con el Método
de Referencia

Reproducibilidad

La reproducibilidad del método se evaluó a
través de los patrones de bandas obtenidos por cada
serovar y que la información proporcionada sea
reproducible a través de tres repeticiones del
ensayo.

Especificidad

Se realizo un ensayo de especificidad utilizando DNA de
otras cepas bacterianas durante el ensayo con Rep1:
Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Pseudomona sp,
,Shigella sp,Bartonella baciliformes,y de otros organismos
relacionados con el diagnostico referencial de Leptospirosis como
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Virus del
dengue.

5. Aplicación de PCR-Rep1 para los serovares
referenciales de Leptospira del INS

Se procedió a realizar el PCR-Rep1 con las
condiciones optimizadas utilizando el primer Rep1 5´GCG
–GAC-TCA-TAC-CCG-CT 3´, las condicones de temperatura
fueron 94C° por 5 minutos, 94C° por 30 segundos,
49.1C° por 1.5 minutos y 72C° por 4 minutos con un tiempo
de extensión final de 7 minutos por 35 ciclos, se utilizo
el DNA de 25 serovares referenciales del Laboratorio de Zoonosis
Bacteriana del Instituto Nacional de Salud. Los patrones de
bandas obtenidos sirvieron para obtener el patrón general
para cada serovar del cepario referencial. Frente a este patron
se compararan los subsiguientes resultados. Para un óptimo
resultado respecto a la resolución de bandas se utilizo la
agarosa de alta resolución Nusieve

6.-Tipificación de serovares por
MAT

Se realizo una prueba de microaglutinacion para
confirmar la identidad de los serovares utilizados en el PCR
REP1, Los cultivos obtenidos fueron enfrentados con su respectivo
antisuero en diluciones dobles sucesivas comenzando en 1/100
hasta 1/102400.

a) Tamizaje

-Se preparo diluciones separas de suero 1:50,1:100 y
1:200 en un volumen final de 1.5ml con PBS en un tubo de
dilución.

-Se distribuyo la microplaca en 8 columnas para
dilución de suero y 23 filas para antigenos.

-Se agrego 50ul a cada pocillo de las diluciones
1:50,1:100 y 1:200 seguidos cada uno por un control respectivo
(50ul PBS y 50ul antigeno).

-Se agrego 50 ul de antigeno (23 serovares) a cada
pocillo correspondiente parta las 3 diluciones (1:50,1:100 y
1:200).

-Se coloco la microplaca sobre un skaker y se roto a una
revolución de 500rpm durante 4 segundos para que la
muestra de suero y antìgeno se mezclen
adecuadamente.

-Se cubrió la microplaca con papel platino e
incubar por 2 horas a 30 °C.

b) Titulaciòn

-Todos los serovares mostraron una reacción de 4+
a un titulo de 1:400 por tanto se procedió a
titular.

-Se preparo una placa de microtitulaciòn, se
rotulo el código de los serovares en las filas y se
anotaron las diluciones del suero de 1/100 hasta 1/102400 en las
columnas.

-Se diluyo el suero 1/25 con PBS para un volumen final
1ml.

-Se agrego en la primera columna 50ul del suero diluido
1/25 .

-Se mezclo el suero diluido 1/25 con 50ul de PBS, se
extrajo 50ul y se vertió en la 2 columna se mezclo con
50ul de PBS se extrajo 50ul y se vertió en la 3 columna y
se coloco 50ul de PBS y así sucesivamente hasta una
dilución de 1/ 102400.

-Se agregar 50ul de antigeno a cada columna.

-Se agrego 50ul de antigeno puro en la última
columna como control.

-Se coloco la microplaca en un shaker y se roto a 500rpm
durante 4 segundos.

-Se cubrió la placa con papel platino y se incubo
por 2 horas a 30°C.

c) Lectura

-Utilizando una micropipeta multicanal se extrajo 15ul
de mezcla antigeno-suero y 15ul de control y se traspaso a una
lámina porta-objeto.

–La lectura se realizo un microscopio de campo oscuro
con objetivo 10X,sin cubre objetos.

-Se observo el grado de aglutinación de cada
antigeno en relación con el antigeno control según
tabla 2.

Tabla2.-

7. Evaluación del poder de la prueba con
diferentes aislamientos de Leptospira sp

Para investigar si la prueba puede servir para
diferenciar serovares de Leptospira sp a partir de
muestras biologicas, se realizo el PCR-Rep1 con el DNA de 20 de
muestras diferentes: Cinco muestras de agua, cinco de sangre,
cinco de orina y cinco de riñónes de roedores
silvestres.

8. Evaluación de la inhibición en las
muestras de Agua, Sangre, Orina y Tejido en
Riñón

Se diluyo 1 volumen de DNA de una muestra positiva para
PCR en 3 volúmenes de muestra problema (Agua, Sangre,
Orina y Riñón) y se procedió a realizar el
PCR REP1. Se obtuvo un indicador de porcentaje de
inhibición.

9. Analisis de Datos

Las curvas y gráficos fueron procesados en EXCEL
Se realizo un dendograma a partir de los patrones de bandas
obtenidos con el programa Gel Compare.

Resultados

1 Crecimiento Bacteriano

Las características de crecimiento
en medio EMJH para los diferentes serovares de Leptopira
que se utilizaron para la prueba fueron diferentes. Estos
cultivos fueron usados para la extracción y
purificación de DNA. El grafico 1 muestra la
evolución del crecimiento de cada serovar a los 4,12 y 19
días. Se midió la concentración de
Leptospiras por campo de lectura en un microscopio de campo
oscuro a 400X.

Se observo que los mayores valores de lectura se
obtuvieron a los 12 días de incubación para la
mayoría de serovares, algunos serovares como bratislava
presentaron altas concentraciones (380 por campo) (Grafico1). Por
otro lado, otros serovares presentaron un crecimiento más
lento por ejemplo el serovar celledoni.

Es claro el patrón de crecimiento diferente para
cada serovar, mientras que algunos mantienen la tendencia a
seguir creciendo, otros por el contrario como el serovar djasiman
muestra una tendencia a disminuir su población en
función al tiempo (Grafico 1). Se tomaron para la
extracción de DNA los cultivos con 19 días de
incubación ya que en este tiempo la mayoría
presentaron una adecuada densidad poblacional, que fue
corroborada en las lecturas al espectrofotómetro
correspondientes a mayores de 108 células /ml
(Tabla2).

2. Tipificación de serovares por
MAT

Se realizo una prueba de microaglutinacion para
confirmar la identidad de los serovares utilizados en el PCR
REP1, Los cultivos obtenidos fueron enfrentados con su respectivo
antisuero en diluciones dobles sucesivas comenzando en 1/100
hasta 1/102400. La tabla 3 muestra que todos los serovares
reaccionan con su respectivo antisuero en títulos mayores
a 1/6400 excepto javanica y hardjo que reaccionaron a 1/3200. Los
serovares cynopteri y varillal necesitaron mayor dilucion
después del titulo 1/51200. Corroborando la alta
seroreactividad del serovar varillal.

3. Extracción de Ácidos
Nucleicos

Se evaluaron dos métodos de extracción de
ADN, una modificación de los métodos basados en la
lisis con buffer de isotiocianato de guanidina (GET). Este
método ha dado buenos resultados en la extracción
de ADN de otras bacterias, como Staphylococcus y Mycobacterium
(Calderon, comunicación personal) produciendo buenas
cantidades de DNA intacto. El otro método es el
recomendado con el Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen GMBH, Germany) y
esta basado en la lisis y extracción con un buffer que
contiene proteinasa K y la purificación es llevada a cabo
en minicolumnas de silica. Se midió la
concentración de ADN en un espectrofotómetro UV a
260nm. En la Tabla 4 se observa que por el método con GET
se obtuvo la mayor cantidad de ADN (l60ng/ul), ademas el radio de
las lecturas 260/280 es de 1.6 lo cual indica un buen
índice de pureza. Por otro lado con el método de
Qiagen la mayor concentración de ADN fue de 110ng/ul y el
radio 260/280 de 1.5. Para evaluar la integridad del ADN se hizo
una corrida electroforetica, donde el ADN obtenido por el
método de Qiagen dio un ADN mas integro, los patrones de
bandas obtenidos de la amplificación con el ADN extraido
con el kit de Qiagen fueron de mejor calidad y mayor
definición. (Fig 1 ). Se obtuvo amplificación en
todas las muestras de ADN extraidas por Qiagen, mientras que por
el método con GET generaron patrones de bandas 17 de los
24 serovares a los que se extrajo ADN. (Fig 2 ).

Tabla 3:

Medida de la concentración de
células por espectrofotometría a 420nm. 19
días de crecimiento

* Aislamiento peruano probable nuevo
serovar

Tabla 4:

Titulacion de Serovares de Leptospira sp
con sus antisueros homologos "MAT"

Tabla 5: Cuantificación de DNA
extraído por métodos Qiagen y GET

4. Amplificación con PCR Rep1 del ADN
extraído por los métodos de QIAGEN y
GET

Para evaluar la utilidad de los
métodos de extracción de ADN se realizo una
amplificación por PCR Rep1. De los veinticuatro serovares
que se extrajo ADN mediante el kit de Qiagen, 23 mostraron
amplificación, obteniéndose un patrón de
bandas bien definido, el serovar que no amplifico fue panama,
(Fig 1). En contraste por el método GET se obtuvo patrones
de bandas en 17 de los 24 serovares a los que se extrajo ADN,
algunos carriles presentan un smearring en el track de corrida
(Fig 2), lo que hace suponer una degradación de ADN.
Algunas muestras presentan bandas débiles (Las celdas 9 y
15 en gel A; y celdas 2, 7,8 y 10 en gel B) debido posiblemente a
la presencia de poco ADN integro en la muestra. (Importancia de
la integridad del DNA para el ensayo)

5. Optimización de las condiciones de ensayo
para el PCR Rep1

Optimización en la concentración de
iones Magnesio

Se evaluaron diferentes concentraciones de iones
magnesio para la reacción de PCR Rep1: 1,5mM, 2mM, 2,5 mM
y 3mM, rangos escogidos siguiendo las indicaciones del fabricante
de la enzima. Los ensayos realizados con las concentraciones de
1,5 mM y 2mM no mostraron amplificaciones optimas
cuantitativamente ni cualitativamente (Fig 4) Por el contrario
las reacciones con concentraciones de 2.5mM y 3mM presentaron una
mejor amplificación, (figuras 5 y 6) siendo la mas optima
la reacción con 3mM de magnesio como lo muestra la figura
(6) por presentar un mejor patrón de bandas y con una
menor cantidad de bandas inespecíficas con respecto al
patrón generado en la reacción con 2.5mM. Se puede
apreciar claramente la diferencia entre los serovares bratislava
y canicola.

6.-Concentración de enzima

Diferentes concentraciones de enzima fueron probadas
para ver su efecto sobre el PCR-Rep1. Se probaron 0,5U, 1,5U y 2U
y 2,5U Unidades de enzima en reacciones de 50uL de volumen de
reacción. Los ensayos realizados a bajas concentraciones
de enzima 0,5U y 1,5U muestran baja intensidad en las bandas
amplificadas así mismo no hay un patrón de bandas
que permita diferenciar entre diferentes serovares. Por el
contrario las reacciones con 2U y 2,5U mostraron patrones de
bandas más definidos y con mayor información para
diferenciar entre serovares. Finalmente se decidió usar la
enzima a 2,5U por relacionarse a una mejor discriminación
en el PCR- Rep-1.

7.-Concentración de ADN

Se evaluaron las siguientes cantidades de
ADN 50ng, 100ng, 200ng, 275ng, 300ng, 550ng, 600ng, 1100ng y 1200
ng en un volumen de reacción de 50ul.

8.-Temperatura de hibridación

La temperatura de hibridación del primer es
importante para una adecuada amplificación y
obtención de un patrón de bandas útil para
el ensayo para Se utilizaron los serovares bratislava y hardjo
que se encuentran la especie Leptospira interrogans a
medida que se incremento la temperatura de hibridación se
fue obteniendo un menor numero de bandas en ambos serovares
siendo la temperatura optima 49,1o Celsius (Fig
3)obteniéndose un menor numero de bandas
inespecíficas que temperaturas menores y un patrón
de banda claro respecto a temperaturas mayores a 49,1o C,
obteniéndose bandas a 500 , 750 y 1400 pares de bases para
ambos serovares pero lo relevante es que se pudo discriminar
entre estos serovares tan relacionados por una banda de 1200 pb
solo presente en el serovar hardjo.

9.-Obtención del patrón de
bandas de las cepas referenciales con el PCR Rep1

Las cepas referenciales de Leptospira sp. Utilizadas
para la prueba del MAT en el Laboratorio de Zoonosis Bacteriana
sirvieron de patrón para la aplicación del PCR-Rep1
La figura 10 muestra el patrón de bandas
obtenido:

a)Todos los serovares de L.interrogans
presentan una banda especie especifica de aproximadamente 400pb a
excepción de los servares ictero y copenhagenhi (carril 4
y 5) los cuales son prácticamente indiferenciables observo
que el serovar tarassovi difiere totalmente de los demás
serovares que encuentran en esta especie teniendo mayor similitud
con el serovar javanica (L.borgpetersenii)debido a las
bandas a 800,1250,1800,2900y3000 pb ,así también se
observo que todos los demás serovares que se encuentran en
la especie L .interrogans muestran una banda
característica de aproximadamente 400pb.Los serovares
(australis,bratislava y mankarso) mostraron patrones de bandas
similares de" 400,900, pb", no pudiendo ser diferenciados,
también los serovares (icterohaemorrhagiae ,copenhageni,
hardjo y djansiman) mostraron patrones similares entre ellos de"
300 y600" ,no pudiendo ser diferenciados. Sin embargo
existió una diferencia clara entre los serovares
(mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes,
tarassovi, autummalis, bataviae, canicola y wolffi).

b.) L.borgpetersenii.-Se observo una
diferencia clara dentro de los serovares ballum
(700,850,900,1350,1400,1500,3000,4000 y 5500 pb) y javanica
(850,1350,1500 y 4000 pb) en esta especie.

c.)Los serovares de las demás especies en
estudio, L. weilii ( sv celledoni 600, 875,1600 y 2000
pb), L.kirscheni (sv grippotyphosa 400 y 1200 pb),
L.santarosae (sv georgia 2725 pb), L.alexanderi
( sv borincana 1100 y 3000pb), L.biflexa (Patoc 700,875
y 1725 pb) y mostraron diferentes patrones de bandas
interespecies.

10.-Sensibilidad del PCR REP1.-La
sensibilidad de evaluó por la siguiente
formula:

[(PA/N+)x 100] (Sachse, 2003)

Donde:

PA: El numero de resultados positivos obtenidos por el
PCR Rep1

N+: Es el numero de muestras positivas con el
Método Referencial (MAT)

Para nuestro ensayo se obtuvo 16 serovares diferenciados
por el PCR Rep1 frente a las 22 cepas referenciales tipificadas
por MAT obteniendo un 72.7% de sensibilidad para el
ensayo.

11.-Reproducibilidad.-

En la figura 11 se muestran los resultados para evaluar
la reproducibilidad del ensayo donde se observa que luego de
realizar la prueba por triplicado la mayoría de serovares
presentan el mismo patrón, a excepción de las
replicas para el serovar Bratislava que presentan diferencias
entre ellas (celdas 5-7) mientras que un a replica del serovar
hardjo muestra diferencia (celda 17). en el carril. La
reproducibilidad fue media en función del numero de
muestras que presentan concordancia después de tres
replicas y el numero total de muestra evaluadas después de
tres replicas. Se obtuvo un 88,9% de reproducibilidad.

12.-Especificidad.

Se evaluó la especificidad del
ensayo para lo cual se obtuvo DNA de algunos patógenos que
presentan sintomatología clínica muy similar a
Leptospirosis y que encajan dentro del enfoque de síndrome
febril , importante para el diagnostico diferencial, asi como
otros agentes bacterianos (Siete en total). El PCR REP1 no
presento especificidad ya que presentaron amplificación 5
muestras de DNA de Pseudomonas aeruginosa, Bartonella
sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y
Shigella sp (Fig 12). Estos resultados muestran que la
prueba no puede ser usada para la detección y
tipificación a partir de muestras de biológicas
(sangre, tejidos, etc.). Quedando la tipificación
solamente a partir de cultivo de Leptospira
sp.

13.-Limite de
detección.-

Se evaluó la capacidad del ensayo
para amplificar y dar un patrón de bandas definido. Para
esto se realizaron diluciones seriadas de una muestra de DNA
extraído de un cultivo de 108 células. La
concentración de la muestra de DNA fue de 110ng/ul. En la
figura 13 se muestra que el límite de detección
para el PCR- Rep1 fue hasta 10-1. .Se observo que a mayor
dilución comenzaban a aparecer mas bandas
inespecíficas teniendo un limite de detección
correcto hasta una dilución de 10-1 ,esta dilución
equivale a 11ng/ul(Fig 13 ), las inespecificidades deben ser
debido a que a mayor dilución del ADN los reactivos como
Cloruro de Magnesio como la Enzima estarán en exceso esto
hará de que la enzima en exceso con el cofactor Mg se
pegue a lugares inespecíficos los cuales generan
amplicones que a posteriori en el tiempo competirán por la
enzima y cofactor con los amplicones de la secuencia blanco
correcta generando una disminución de la eficiencia en el
PCR, sin embargo se observo un amplicon tenue en la
dilución 10-6.

14.-Evaluación del PCR REP1 a partir de
muestras de agua, sangre, orina y tejido (riñon de
roedor).- Se realizo un PCR REP1 con muestras de DNA para
evaluar la utilidad del ensayo con muestras biológicas. Se
corrieron cinco muestras de DNA extraído de sangre
positivas a la prueba de Lepto-PCR; cinco muestras de DNA
extraído de aguas positivas; cinco muestras de orina
positivas y cinco muestras positivas de DNA extraído de
riñón de roedores, para evaluar el patrón de
bandas. Se observo que en todas las muestras existió ADN
degradado sin embargo las muestras de agua y de tejido en el
riñón mostraron un patrón de bandas mas
claro que en orina y sangre (Fig 14 y 15).

Ensayo PCR-Rep1 de muestras de ADN
extraidas con el metodo de Qiagen.(Metodo optimo de
extracción) Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5%.

A: Celdas: 1. Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2. sv. australis, 3. sv.
autummalis,

4. sv. ballum, 5. sv. bataviae, 6. sv.
canìcola, 7. sv. celledoni, 8. sv. cynopteri, 9. sv.
djasiman, 10. sv. grippotyphosa, 11. sv. icterohaemorrhagiae, 12.
sv. javanica, 13. sv. georgia, 14. sv. pomona, 15. sv.
pyrogenes.

B: Celdas 1. Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2. sv. wolffi, 3. sv.
tarassovi, 4. sv. bratislava,

5. sv. borincana, 6. sv. canicola, 7. sv.
copenhageni, 8. sv. hardjo, 9. sv. varillal, 10. sv. patoc, 11.
sv. panama, 12. control positivo, 13. control negativo

Fig 2.- Ensayo del PCR Rep1 por el
metodo GET (Tiocianato de Guanidina).Las muestras fueron
corridas en agarosa al 1.5%.

A: Celda 1. Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis,3 sv
autummalis, 4 sv ballum, 5 sv bataviae, 6 sv canicola, 7 sv
celledoni, 8 sv cynopteri,9. sv djasiman , 10 sv grippotyphosa,
11 sv icterohaemorrhagiae, 12 svjavanica,13 sv georgia,14 sv
pomona

B:Celda 1 Marcador de peso molecular
1Kb DNA ladder Fermentas , 2 sv pyrogenes, 3 sv wolffi, 4 sv
tarassovi, 5 sv bratislaval 6 sv borincana, 7 sv canicola, 8 sv
copenhageni,9 sv hardjo, 10 sv varillal, 11 Patoc , 12 sv
panama,13 Control +,14 Control –

M-(46,5)——(47,7)——(49,1)——(51,4)——-(52,3)—

Fig.3.-Temperatura de
hibridación Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5%, se utilizaron los serovares wolffi y hardjo (La celda 1
Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, Celdas 2 y 3
a 46,5 C° , Celdas 4 y 5 a 47,7 C°, Celdas 6 y 7 a 49,1
C°(Temperatura optima),Celdas 8 y 9 a 51,4 C°
,Celdas 10 y 11 a 52,3 C°.

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 13 14 15 16 17
18 19 20 21 22

Fig 4.- Evaluación de Cloruro de
Magnesio 1.5mM y 2mM.Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas,2
sv australis, 3 ballum, 4 sv celledoni,5 sv pomona,6 sv
bratislava,7 sv borincana,8 sv canícola, 9 Patoc, 10
Control+,11 Control -,celda 12 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 13 sv australis,14 sv ballum, 15 sv celledoni,
16 sv pomona, 17 sv bratislava, 18 borincana, 19 sv
canícola,20 Patoc, 21 Control +, 22 Control –

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14

Fig 5.-Evaluación de Cloruro de
Magnesio 2.5 mM Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5% .

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv
canìcola, 5 sv canìcola,6 sv icterohaemorrhagiae, 7
sv copenhageni,8 sv wolffi,9 sv hardjo,celdas 10,12,13 y 14
Controles +,celda 11 control -)

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14

Fig 6.-Evaluación de Cloruro de
Magnesio 3 mM (Concentración optima) .Las muestras
fueron corridas en agarosa al 1.5%

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv
canìcola, 5 canìcola , 6 sv icterohaemorrhagiae, 7
sv copenhageni, 8 sv wolffi, 9 sv hardjo,10 Control +,11 Control
-, 12 sv ballum,13 sv borincana,14 Patoc)

M 2 3 4 5 6 7 8 9(0,5U) M 13 14 15 16 17
18 19 20 (1,5U)

Fig 7.-Evaluación de la Enzima
0,5U y 1,5 U. Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5%

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv
icterohaemorrhagiae, 5 sv copenhageni, 6 sv wolffi, 7 sv hardjo,
8 Control +, 9 Control -, 12 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 13 sv australis, 14 sv bratislava, 15 sv
icterohaemorrhagiae, 16 sv copenhageni, 17 sv wolffi, 18 sv
hardjo, 19 Control + 20 Control –

M 2 3 4 5 6 7 8 9(2U) M 13 14 15 16 17 18
19 20(2,5U)

–

Fig 8.- Evaluación de Enzima a
2U y 2,5 U(Valor optimo).Las muestras fueron corridas en
agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv
icterohaemorrhagiae, 5 sv copenhageni, 6 sv wolffi, 7 sv hardjo,
celda 8 control +, celda 9 control-, 12 Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 13 sv australis, 14 sv
bratislava, 15 sv icterohaemorrhagiae, 16 sv copenhageni, 17 sv
wolffi, 18 sv hardjo, 19 control +, 20 control –

Fig 9.- Evaluación de
Concentración de ADN.Las muestras fueron corridas en
agarosa al 1.5%.

A: Celda 1 Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv balum(50ng), 3 sv
borincana(300ng), 4 Patoc(275ng), celda 5 control +, celda 6
control -, 7 sv balum(100ng) (Cantidad de acido nucleico
optimo), 8= borincana(600ng).

B: Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb
DNA ladder Fermentas ,2 Patoc (550ng), celda 3 control +, 4
control -, 5 sv balum(200ng), 6 sv borincana(1200ng), 7
Patoc(1100ng), celda 8 control +)

TABLA 6.-Cantidad de ácidos
nucleicos a volumes 5ul,10ul y 20ul .-Se recomienda usar
100ng de muestra de ADN siendo la cantidad mínima de ADN
en la que se muestra una buena amplificación.

Fig 10.- Estandarización del
PCR Rep1.-Las muestras fueron corridas en agarosa Nusive al
1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv
icterohaemorrhagiae, 5c sv copenhageni, 6 sv mankarso, 7 sv
autummalis, 8 sv bataviae, 9 sv canìcola, 10 Marcador de
peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas , 11 sv cynoptei, 12 sv
pomona, 13 sv pyrogenes, 14 sv djasiman, 15 sv tarassovi,16 sv
wolffi, 17 sv hardjo,18 sv ballum,19 Marcador de peso molecular
1Kb DNA ladder Fermentas,

20 sv javanica,21 sv celledoni, 22 sv
grippotyphosa, 23 sv georgia, 24 sv borincana, 25 Patoc, 26
panama, 27 sv varillal, 28 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, celda 29 control +

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
18 19 20 21

Fig 11.Repetibilidad- Las muestras
fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 al 4 sv australis, 5 al 7 sv bratislava, 8 al
10 sv icterohaemorrhagiae, ll al13 sv copenhageni, 14 al 16 sv
wolfii, 17 al 19 sv hardjo,celda 20 control +,celda 21 control -,
2 al 7 Serogrupo Australis, 8 al 13 Serogrupo
Icterohaemorrhagiae, 14 al 19 Serogrupo Sjeroe.

A

M 2 3 4 5 6 7 8

FIG12.-Especificidad: Las muestras
fueron corridas en agarosa al 1.5%.

A:Celda 1 Marcador de peso molecular
1Kb DNA ladder Fermentas, 2 Pseudomonas aeruginosas , 3
Bartonella sp, 4 Plasmodium falciparum , 5
Plasmodium vivax , 6 Virus Dengue, 7 Salmonella
sp,8 Shigella sp.

B

B: Celda 1 Marcador de peso
molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, celda 2 control -,celda 3
control + sv copenhageni ,celda 4 control + sv hardjo.

TABLA 7

Patógenos referenciales
utilizados para la prueba de especificidad para el PCR
Rep1

Fig.13.- Limite de
detecciòn.Las muestras fueron corridas en agarosa al
1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas, 2 sv cynopteri, 3 al 9 diluciones sucesivas de
10-1 (Limite de detecciòn optimo) hasta 10-7, celda
10 control (+) sv canìcola.

En el límite de detección se
utilizo el serovar cynoptery

Fig 14.- Evaluación del PCR
REP1 a partir de muestras de agua, sangre y orina .Las
muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas , 2 al 6(Muestras de agua), 7 al 11 (Muestras de
sangre), 12 al 16(Muestras de orina) , 17( Marcador)

Fig 15.- Evaluación del PCR
REP1 a partir de muestras de tejido (riñon de roedor) y
muestras inhibitorias de en agua, sangre, orina y
riñon.

Las muestras fueron corridas en agarosa
al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA
ladder Fermentas , 2 al 6 (Tejido de riñón), 7 y
8(Muestra inhibitoria de agua), 9 y 10(Muestra inhibitoria de
sangre), 11 y12 (Muestra inhibitoria de orina), 13 y 14(Muestra
inhibitoria de tejido de riñon), 15 y 16(muestras
positivas serovar javanica y panama respectivamente) ,Celda 17
Control – , 18 Marcador.

Realización del
Dendograma

Figura 16

Discusión

–El crecimiento en medio EMJH (Medio
Ellinghausen y McCullough modificado por Johnson y Harris) de los
serovares fue variable en los 19 días evaluados algunos
tuvieron tendencia a crecer (Serovar borincana) y otros a
disminuir (Serovar djasiman) esto posiblemente se deba a la
diferente capacidad de aprovechar los nutrientes entre serovares
(27) (Fig 1).

– La mejor calidad de DNA se obtuvo con el
kit QIAGEN (QIAamp DNA Mini Kit ) por mostrar una mayor
integridad del ADN que se relaciono con una mejor
obtención de patrones de bandas en el PCR Rep1, aunque los
mayores valores en cantidad de acido nucleico y calidad en
ácidos nucleicos se obtuvo con el método GET
Ácido ng/ul=160ng/ul y factor de calidad 260/280 de Acido
Nucleico=1,6 respectivamente , es posible que en el Método
GET existiera degradación a de ADN y la presencia de
trazas relevante de ARN (29).

-Las condiciones de optimización del Rep 1-PCR
fueron: Temperatura de hibridación fue 49°C
,utilizando esta temperatura se mostraron amplificaciones de
bandas similares a las reportadas por Barocchi cuando uso
50°C como temperatura de hibridación (2) (Fig 3),
concentración optima de Cloruro de Magnesio 3mM(Fig 5 y
6),Enzima 2,5 U(Fig 7 y 8), 100ng de ADN para un volumen final de
50 ul de reacción (Fig 9).Estas condiciones variaron
respecto a las evaluadas por Barocchi,incrementando la
concentración de Magnesio a 3mM y de enzima a 2,5 U
generando patrones de bandas definibles y claras para las
condiciones evaluadas en este trabajo de investigación(2),
sabemos que la concentración de Enzima está
relacionada con la concentración de Cloruro de Magnesio
por ser un cofactor de la proteína así al aumentar
la sal se pensó que una mayor Unidad de enzima
ayudaría a marcar con mayor diferencia las bandas
discrimatorias entre serovares conociendo los factores adversos
del aumento de las Unidades de la enzima como las
inespecificidades.Es posible que la presencia de proteínas
en las muestras de ADN demandara una mayor concentración
de iones de magnesio y de enzima para optimizar el
PCR-Rep1(Fig.6).

-En el desarrollo para evaluar
diferenciación de serovares por el PCR Rep 1 no se observo
una total diferenciación entre serovares por ejemplo en la
especie L. interrogans existió similitud entre
los serovares (australis,bratislava y mankarso ) en las bandas de
400 y 900 pb, asi el serovar tarassovi difiere totalmente de los
demás serovares que encuentran en esta especie teniendo
mayor similitud con el serovar javanica
(L.borgpetersenii)debido a las bandas a
800,1250,1800,2900y3000 pb . También los serovares
(icterohaemorrhagiae ,copenhageni , hardjo y djaniman) mostraron
patrones similares entre ellos de" 300 y600" ,no pudiendo ser
diferenciados, para L.borgpetersenii se observo una
diferencia clara dentro de los serovares(ballum y javanica) en
esta especie ,así los serovares de las demás
especies en estudio, L. weilii (600,875,1600 y 2000
pb),L.kirscheni (400 y 1200 pb),L.santarosae
(2725 pb) ,L.alexanderi (1100 y
3000pb),L.biflexa (700,875 y 1725 pb) y
L.noguchi (825 y 1725 pb) mostraron diferentes patrones de
bandas ínter especies, en presente trabajo se pudo
corroborar lo observado por Barocchi en la que los serovares
icterohaemorrhagiae ,copenhageni mostraron similares
bandas(2),Otras pruebas moleculares se realizaron para poder
diferenciar serovares del genero Leptospira ejemplo de ello son
PCR IS 1500,IS 1533(6,13), PCR VNTR (Numero de Repeticiones
Variables dispuestos en Tamden)(33),RAPD(Amplificación de
ADN Polimorfico al Azar) (26) en contraste el ahorro de tiempo y
dinero por el empleo del PCR Rep1 en el que se uso un solo primer
coloca a esta técnica ventajosa frente a las pruebas
moleculares mencionadas anteriormente , el PCR Rep1 logro la
diferenciación entre los serovares de mayor importancia
epidemiológica como: mankarso, icterohaemorrhagiae,
cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae
,canicola y wolffi

(L.interrogans),javanica y
ballum(L.borgpetersenii), L. weilii ,L.kirscheni
,L.santarosae ,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi (Fig 2 y
10). La importancia del presente PCR-Rep1 deriva de que
características clínicas y epidemiológicas
son usualmente asociadas a serovares y serogrupos de Leptospira
(33).

–Se obtuvo una sensibilidad del
72.7% respecto al método referencial MAT donde en el MAT
no se diferencio el serovar cynopteri del Var-100 posiblemente
debido a la similitud de Lipopolisacaridos (22).

– En la prueba de reproducibilidad se
observo algunas variaciones tenues en los serovares bratislava y
hardjo pudiendose ajustar esta prueba de reproducibilidad con
sutiles variaciones en la cantidad de enzima y
concentración de Magnesio.

-El PCR REP1 no fue especifico para el genero Leptospira
,la prueba tuvo reacción cruzada con
Pseudomonas aeruginosas, Bartonella sp, Plasmodium
vivax, Salmonella sp y Shigella sp (Fig12), 5/7
muestras evaluadas 72% aproximadamente lo importante es hacer
notar cierta similitud respecto a los patrones de bandas de
Shigella sp ( entre 250 y 500pb,500 y 750 pb,750 y
1000pb,1500 y 2000 pb y 2500 y 3000pb) con los serovares
australis,canìcola y wolffi aunque este patron de bandas
es único para Shigella sp puede tender a
confusión para una persona inexperta , así
también existe un patron de varias bandas en
Bartonella sp(500pb,2000y2500pb y 3000 y 3500 pb) que se
debe de tomar en cuenta, de esto la relevancia de la Ficha
Epidemiológica y el historial del organismo de donde se
toma la muestra así como correr las muestras de ADN en un
gel amplio y utilizar agarosa de amplia resolución como la
NUSIVE en este tipo de pruebas Epidemiológicas
Moleculares.

–El limite de detección se
determino en una dilución de 1/10(11ng/ul) este limite es
relativamente bajo pero se tiene que tener en cuenta que este
tipo PCR donde se requiere un patron de bandas claro es de
esperar que la dilución no sea muy alta.

-La prueba de inhibición mostró el
siguiente orden de mayor a menor inhibición orina, sangre
,tejido de riñón y agua, los posibles inhibidores
serian urea(Orina),lactoferrina y grupos hemo(Sangre),grupos hemo
y urea (Tejido de Riñón ) e iones y nucleasas
(Agua)(Fig 15 del carril 7 al carril 14). El orden de prioridad
para la toma de muestra debería ser:Agua, Tejido de
Riñón, Sangre y Orina estos resultados sugieren la
presencia de nucleasas en las muestras de esto que es importante
que la muestra se procese en forma rápida y con el
protocolo adecuado para cada tipo de muestra para evitar la
degradación de ADN . Se observo inhibición en todas
las muestras evaluadas sin embargo donde se observo mayor
inhibición fue en el orden siguiente en forma decreciente
orina, sangre, tejido de riñón y agua,
además se observo que existieron patrones de bandas que no
corresponden a ningún patrón de bandas
estándar para los serovares estudiados.