Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1 (página 3)

Partes: 1, 2, 3

-En el dendograma(Figura 16) se pudo observar en forma
mas fácil las relaciones que fueron observas en el gel de
electroforesis en el ensayo de PCR-Rep 1( Figura 10)se
mostró las relaciones entre los serovares
bratislava,mankarso y australis (L. interrogans) y
icterohaemorrhagiae ,copenhageni, hardjo y djansiman (L.
interrogans) se observo también la estrecha
relación entre los serovares djaniman y hardjo
pertenecientes a las especies
L.interrogans,también se pudo observar la
estrecha relación entre los serovares ballum y javanica
que se encuentran en la especie L.borgpetersenii ,otro
caso peculiar fue en el que se observo el patrón de bandas
en el serovar tarassovi que se encuentra en la especie
L.interrogans sin embargo mostró un patrón
de bandas diferentes a esta especie por el ensayo PCR Rep 1(Fig
10) .

Conclusiones

-Se observo que existe variabilidad en el crecimiento
bacteriano en medio EMJH (Medio Ellinghausen y McCullough
modificado por Johnson y Harris) respecto a cada serovar
posiblemente debido a su diferente capacidad
metabólica.

-El mejor método de extracción de
ácidos nucleicos fue con el Kit QIAGEN observándose
una mejor calidad en el patrón de bandas en el PCR Rep
1.

-Las mejores condiciones de
optimización para el PCR Rep 1 fueron: Temperatura de
hibridación 50°C , Magnesio 3mM,enzima 2,5 Unidades ,
y 100ng de acido nucleico para un volumen final de 50 ul de
reacción .

-Se obtuvo una sensibilidad del 72.7%
respecto al método referencial MAT

-El PCR Rep1 1 logro la
diferenciación entre los serovares de importancia
epidemiológica como: mankarso, icterohaemorrhagiae,
cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae,
canicola y wolffi.

(L.interrogans), ballum y javanica
(L.borgpetersenii), L. weilii, L.kirscheni,
L.santarosae, L.alexanderi, L.biflexa y
L.noguchi.

Este trabajo ayudara así a
discriminar los posibles reservorios para el genero Leptospira
por ejemplo se conoce que los serovares icterohaemorrhageae y
copenhageni están asociados a ratas domesticas,
canìcola al perro, pomona a cerdos y Leptospira
biflexa saprofita, este conocimiento es de vital importancia
en el control de un brote.

– El PCR Rep1 no fue especifico para el genero
Leptospira generando patrones de bandas también en:
Pseudomonas aeruginosas, Bartonella sp, Plasmodium
vivax, Salmonella sp y Shigella sp

-El límite de detección para el PCR Rep1
fue de 10-1(11ng/ul) .

-En la evaluación de inhibición en el PCR
Rep 1 en las muestras de orines mostraron un claro factor de
inhibición respecto al PCR Rep1.

Recomendaciones

-Se recomienda el uso del Kit QIAGEN para
extracción de ácidos nucleicos, así como
preparar alícuotas para el uso de ácidos nucleicos
y guardarlos a –20 C( se debe tener especial cuidado en la
integridad del ADN en este tipo de PCR ya el primer tiene varias
secuencias blancos a lo largo del genoma.

-Se recomienda el uso de Tips romos para colocar el ADN
en los tubos de reacción para mantener su
integridad.

-Se recomienda preparar el Mix de reacción para
el PCR-Rep1 en un tubo único sin el solvente H2O que
será agregado por separado en cada tubo de
reacción. Así la enzima deberá ser agregada
al mix directamente sin otra manipulación previa para
mantener su integridad.

– Se recomienda utilizar la siguientes condiciones de
optimización para el PCR Rep 1, temperatura de
hibridación 50°C, Magnesio 3mM, Enzima 2,5 Unidades
,100ng para un volumen final de 50 ul de
reacción

-Se recomienda el uso de la Agarosa NUSIVE 3:1, CAMBREX
al 1.5% a 90 voltios por 60 minutos en cámaras
electroforeticas amplias y con posillos de 20 ul de capacidad de
siembre como mínimo esto se debe a que se debe separar lo
mas posible las bandas que se muestran en un PCR
–Rep1.

-Se debe dar relevancia a la Ficha Epidemiológica
y el historial del organismo de donde se toma la muestra debido a
que no existe especificidad en el PCR Rep1 y podría
amplificarse a otros patógenos.

-La muestra para el uso del PCR Rep1 debe procesarse en
forma rápida y con el protocolo adecuado para cada tipo de
muestra para evitar la degradación de ADN así se
puede realizar una dilución de 10-1 de la muestra de ADN
para disolver inhibidores como la urea en la orina.

Referencias
bibliográficas

1.-.Savio M.L ,Rossi C, Fusi P,Tagliabue
S,Pacciarini M.L.(1994) Detection and Identification of
Leptospira interrogans serovares by PCR coupled with
restriction endonuclease analysis of amplified DNA.Journal of
Clinical Microbiology.Vol No .Pgs 935-941.

2.-Barocchi Michele A., Ko Albert I, Ramos Suzana,
Tucunduva Marcos, Galvao Metermayer.( 2001).Identification of New
Repetitive Element in Leptospira interrogans Serovar
Copenhageni and Its Application to PCR-Based Differentiation of
Leptospira Serogroups.Journal of Clinical
Microbiology.Pgs191-195.

3.-Van Eys G.J.J.M.,Gerritsen M.J.,Korver H.,Schoone
G.J.S,Kroon C.C.M,Terpstra W.J.(1991). Characterization of
Serovars of the Genus Leptospira by DNA Hybridization with
Hardjobovis and Icterohaemorrhagiae Recombinant. Probes with
Special Attention to Serogroup Sejroe. Journal of Clinical
Microbiology..Pgs 1042-1048.

4.-Perolat Philippe ,Merien Fabrice ,Ellis William
A.,Barantom Guy.(1994).Characterization of Leptospira Isolates
From Serovar Hardjo by Ribotyping,Arbitrarily Primed PCR and
Mapped Restriction Site Polymorphisms.Journal of Clinical
Microbiology.Pgs 1949-1957.

5.-Zuerner Richard L,Bolin Carole
A.(1997).Differentiation of Leptospira interrogans
Isolates by IS 1500 Hybridization and PCR Assays.Journal of
Clinical Microbiology.Pgs 2612-2617.

6.-Versalovic James ,Koeuth Thearith ,Lupski James
R.(1991).Distribution of Repetitive DNA sequences in eubacteria
and application to fingerprinting of bacterial genomes.
Oxford.University Press .Vol.19.N.24.Pgs:6823-6831.

7.-Zuerner Richard L,Alt David ,Bolin Carole A
.(1995).IS 1533-Based PCR Assay for Identification of
Leptospira interrogans Sensu Lato Serovars.Journal of
Clinical Microbiology .Pgs.3284-3289.

8.-Cespedes Manuel, Ormaechi Melvi, Condori Patricia,
Balda Lourdes, Glenny Martha.(2003).Prevalencia de Leptospirosis
y Factores de Riesgo en Personas con Antecedentes de Fiebre en la
Provincia de Manu, Madre de Dios, Peru. Revista Peruana de
Medicina Experimental de Salud Publica 20(4).

9.-Beran George.(1994).Hanbook of Zoonoses.Second
edition .Pgs:245-264.

10.-Assuncao Marluce,Caballero Otávia,Vago
Annamaria,Harskurl Rudy,Romancha Álvaro,Pena
Sérgio,Simpson Andrew,Koury Matilde.Low –Stringency
Single Specific Primer PCR for Identification of Leptospira
. (2003).Journal of Medical Microbiology .(52)
Pgs:127-135.

11.-Slack Andrew,Dohmt Micheal,Sygmonds Meegan,Smythe
Lee.(2005).Development of a Multiple-Locus Variable number of
Tandem repeat Analysis(MLVA)for Leptospira interrogans
and its application to Leptospira interrogans serovar
Australis isolates from Far North Queensland,Australia.Annals of
Clinical Microbiology and Antimicrobials-Biomed Central
.Pgs:1-32.

12.-Bharti Ajay,Nally Jarlath,Ricaldi Jessica,Matthias
Michael,Diaz Monica,Lovett Michael,Levett Paul,Gilman
Robert,Willig Michael,Gotuzzo Eduardo,Vinetz Joseph.Leptospirosis
:a zoonotic desease of global importance.(2003).THE
LANCET.Infections Diseases.Pg:757-771.

13.-Majed Z.,Bellenger E.,Postic D.,Pourcel
C.,Baranton G.,Picardeu M..Identification of Variable-Number
Tamden-Repeat Loci in Leptospira interrogans Sensu
Stricto.(2005).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:539-545.

14.-Baranton G. ,I.G.Old.The Spirochetes:A
different way of life.(1995).Institute Pasteur.

15.-Corney B. G.,Colley J.,C. G.
Graham.Simplified analysis of pathogenic Leptospiral serovars by
random amplified polymorphic DNA fingerprinting.(1997).Journal
Mediccal Microbiology.Pgs:927-932.

16.-Adler, B., Murphy, A. M., Locarnini, S.
A. and Faine, S.. Detection of specific anti-leptospiral
immunoglobulins M and G in human serum by solid phase
enzyme-linked immunosorbent assay (1980). J. Clin. Microbiol.
11:452-457.

17.-Surujballi Om,Mallory Maria.Competitive
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of Leptospira
interrogans Serovar Pomona Antibodies in Bovine
Sera.(2001).Clincal and Diagnostic Immunology
.Pgs:40-43

18.-Ellis, W.A., Thiermann, A.B.,
Montgomery, J., Handsaker, A., Winter, P.J. y Marshall, R.B..
Restiction Endonuclease Analysis of leptospira interrogans
serovar hardjo isolates from cattle. (1988).Res. Vet. Sci,
44:375-379.

19.-Ellis, W.A.. Leptospirosis as a cause
of reproductive failure. (1994)Vet. Clin. North. Am., Food Anim.
Pract. 10:463-478

20.-Hartskeerl, R., Smith, H., Korver, H.,
Goris, M. and Terstra, W. International Course on Laboratory
Methods for diagnosis of Leptospirosis. (2000) Royal Institute.
Amsterdam, Holland.

21. – Pope V, Johnson R., Effect of heat or
formalin treatment of

Leptospires on antibody response detected
by immunoblotting. (1991).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:1548-1550

22.-Levett, P. N. Leptospirosis. (2001)
Clinical. Microbiology.Pgs:296-326.

23.-Effler Paul,Domen Harry,Bragg
Sandra,Aye Tim,Sasaki David.Evaluation of the Indirect
Hemagglutination Assay for Diagnosis of Acute Leptospirosis in
Hawaii.(2000).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:1081-1084

24.-Smith C.R., Ketterer P.J., McGowan M.R.
and Corney, B.G.. A review of laboratory techniques and their use
in the diagnosis of Leptospira interrogans serovar
hardjo infection in cattle. (1994) Aus. Vet. J. 71,
290-294.

25.-Yan, K. T., W. A. Ellis, D. P. Mackie,
M. J. Taylor, S. W. McDowell,

J. M. Montgomery. Development of an ELISA
to detect antibodies to

a protective lipopolysaccharide fraction of
Leptospira borgpetersenii serovar

hardjo in cattle. (1999) Vet. Microbiol.
69:173–187.

3284–3289.

26.-Ramadass P.,Meerarani S.,Venkatesha
M.,Senthilkumar A.,Nachimuthu K..Charecterization of Leptospiral
Serovares by Ramdomly Amplified Polymorphic DNA
Fingerprinting.(1997)International Journal of Systematic
Bacteriology .Pgs:575-576.

27.- Fairbrother J. Effects of products of
autolysis of tissue and urine on the viability, morphology, and
antigenicity of Leptospira interrogans serovar
pomona.(1985).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:189-194

28.- Broadly reacting precipitating and
agglutinating antigen of leptospirae.

Myers D, Coltorti E. Broadly reacting
precipitating and agglutinating antigen of
leptospirae.(1987).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:580-590

29.-Molzym. Innovative CCT chemistry and
SAM binding matrix – a combination matching highest demands on
RNA preparation.(2006).Accedido el 5 de Enero del 2007.Viable
en:

30.-Lefebvre Rance,Thiermann Alex,Foley
John.Genetic and Antigenic Differences of Serologically
Indistinguishable Leptospires of Serovar hardjo.(1987).Journal of
Clinical Microbiology.Pgs:2094-2097

31.-Brandao Angela,Camargo Eide,Silva
Emilson,Silva Marcos,Abrao Rui.Macroscopic Agglutination Test for
Rapid Diagnosis of Human Leptospirosis.(1998).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:3138-3142.

32.-Bharti Ajay,Nally Jarlath,Ricaldi
Jessica,Matthias Michael,Diaz Monica,Lovett Michael,Levett
Paul,Gilman Robert,Willig Michael,Gotuzzo Eduardo,Vinetz
Joseph.Leptospirosis :a zoonotic desease of global
importance.(2003).THE LANCET.Infections
Diseases.Pg:757-771.

33.-Majed Z.,Bellenger E.,Postic D.,Pourcel
C.,Baranton G.,Picardeu M..Identification of Variable-Number
Tamden-Repeat Loci in Leptospira interrogans Sensu
Stricto.(2005).Journal of Clinical
Microbiology.Pgs:539-545.