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Metabolómica aplicada al diagnóstico preimplantacional no invasivo (página 2)



Partes: 1, 2

Figura 1.- Valoración no invasiva del
consumo y utilización de nutrientes por el blastocisto.
Los blastocistos fueron incubados individualmente en un volumen
conocido de O.5 &µl de medio definido, como el G2.
Series de muestras de nanolitros pueden ser tomadas y analizadas
para carbohidratos, aminoácidos, amonio, oxígeno y
enzimas. La medida simultanea del consumo de glucosa y
producción de lactato puede darnos una medida indirecta de
la actividad glucolítica. Esta actividad
glucolítica ha mostrado ser inversamente proporcional
tanto al desarrollo en cultivo como a su posterior viabilidad. La
medida simultanea del consumo de aminoácidos y la
producción de amonio puede darnos una medida indirecta de
la utilización de los aminoácidos. La
liberación de enzimas al entorno, como lactato
deshidrogenasa, refleja alteración en la integridad de la
membrana y puede ser utilizada para valorar daños por la
congelación.

(Veeck y Zaninovic, 2003) (16)

Diferentes estudios relacionan los perfiles
metabólicos obtenidos, con el potencial reproductivo del
embrión, encontrando diferencias de la viabilidad en el
metabolismo de la glucosa, piruvato (Gardner et al.
2001) (10) y el turn-over de
aminoácidos.

Urbansky et al. (3), exponen un sistema
automático de microfluidos, construido con la
técnica de litografía blanda en multicapas, que
detecta por fluorometría moléculas que
actúan como sustratos energéticos (glucosa,
piruvato, lactato…), así como otros muchos
metabolitos relevantes y numerosos aminoácidos, a
través de reacciones con NADH.

El metabolismo energético ha constituido un
importante objetivo en los estudios del potencial de desarrollo
embrionario sirviendo, asimismo, como biomarcador. Esto se
complementa con las medidas de consumo de oxígeno, con el
scaning electroquímico microscópico (SECM),
Embryoscope®, y con la cromatografía
líquida de alta presión (HPLC) que se ha usado para
analizar el turn-over de aminoácidos.

Pero la mayoría de estas técnicas
están limitadas para el ejercicio de rutina en las
clínicas de reproducción, por requerir tiempo para
los análisis, compleja instrumentación y personal
especializado. Se necesita, pues, un procedimiento rápido,
preciso y no invasivo.

LAS ÓMICAS, nuevas ciencias desarrolladas
desde la descodificación del genoma humano, pueden
ofrecernos esta posibilidad.

Genómica y proteómica se encargan del
análisis, identificación y cuantificación
del conjunto de genes y proteínas, respectivamente. La
transcriptómica atiende a las moléculas intermedias
(ARNm), productos de la transcripción desde los que se
traducen las proteínas.

La proteómica tiene como objeto las
proteínas codificadas por un organismo (proteoma),
así como los efectos de su modificación,
interacción y actividad en un sistema biológico.
Incluye a la secretómica que se restringe a las
proteínas secretadas al entorno celular externo
(secretoma).

La obtención de la secuencia del genoma humano no
explica en sí la naturaleza de muchas enfermedades, por lo
que ha aumentado el interés en conocer su expresión
fenotípica (Nicholson et al. 2002)
(15).

LA METABOLÓMICA, última ciencia que
ha ido emergiendo con fuerza desde los noventa, es el
análisis sistemático del metaboloma, sistema
dinámico constituido por el conjunto de metabolitos,
biomarcadores de pequeño tamaño (<1500 Dalton),
presentes en una muestra biológica (Lindon et al.
2007) (2), que son productos finales de los procesos regulatorios
de las células y representan el fenotipo funcional a nivel
celular (Botros et al. 2008) (5). Por consiguiente,
revelan la respuesta de los sistemas biológicos a la
influencia genética, nutricional y ambiental (Sing y
Sinclair 2007) (12). La metabolómica nos permite
investigar la relación entre el genotipo del organismo y
el fenotipo resultante, al ser el metaboloma el producto final de
su expresión, mostrando la relación entre su
fisiología y las condiciones ambientales (Figura
2).

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Figura 2. Diagrama esquemático detallando
la complejidad de la función celular, incluyendo las
tecnologías ómicas asociadas: genómica,
transcriptómica, proteómica y metabolómica,
que contribuyen al estudio y comprensión de los sistemas
biológicos.

(Katz-Jaffe et al. 2009)
(8)

En conjunción con la proteómica, con la
metabolómica se cubrirá un espectro más
amplio y preciso de la capacidad reproductiva, de manera no
invasiva, complementándose para definir funciones y
propiedades reproductivas que aún no han podido ser objeto
del estudio rutinario. Para ello se necesitará disponer de
diversas técnicas que se adecuarán al objetivo
buscado y que se puedan aplicar como rutina en las
clínicas de reproducción asistida. De entre ellas
destacará la más rápida, precisa y con mayor
definición de las propiedades de la capacidad reproductiva
del embrión que se puedan extraer del análisis de
los biomarcadores en el medio de cultivo. Estos biomarcadores no
serán considerados individualmente. Con la
metabolómica se obtiene un perfil global, considerando el
mayor número posible de éstos. Los perfiles
obtenidos son los que indican la capacidad de implantación
y potencial evolutivo del embarazo, puesto que veremos que son
diferentes entre los embriones con alta capacidad reproductiva y
los no viables.

Estas ciencias, al ser holísticas, consideran la
mayor cantidad de variables posibles para, posteriormente,
extraer de ellas la información verdaderamente útil
y trabajar en su conjunto, utilizando algoritmos de procesado de
señal, propios de la inteligencia artificial.

LAS TÉCNICAS más descritas en la
literatura científica para el análisis
metabolómico son: Espectroscopía por infrarrojos en
el espectro cercano, espectroscopía Raman, que
también es vibracional pero con laser en el espectro
visible, resonancia magnética nuclear y
espectrometría de masas.

Entre las más precisas para evaluar el perfil
metabolómico está la de espectroscopía por
infrarrojo cercano (Near Infrared, NIR) (Seli et
al
. 2007) (1). Basándose en la vibración de
los enlaces por estimulación con haz infrarrojo, esta
técnica nos proporciona información de los cambios
del medio, relacionándolos con las variaciones en las
medidas de las concentraciones de grupos funcionales clave, como
ROH, -SH, C=C, -OH, y –NH, que son los detectados y que
forman parte de moléculas que constituyen el metaboloma
(Botros et al. 2008) (5).

La espectroscopía Raman, basada en la
estimulación de las moléculas con un haz laser y la
detección de la energía emitida al relejarse,
combinada con la bioinformática, es también usada
para determinar el perfil metabolómico y se relaciona con
resultados de embarazo. (Scott et al. 2008)
(7).

La RMN se fundamenta en las propiedades cuánticas
del núcleo atómico. Los núcleos que poseen
un número impar de protones o neutrones tienen un momento
magnético y un momento angular intrínseco, es
decir, un spin nuclear. Al ponerlos en un campo magnético,
este spin se alinea con el campo, emitiendo una señal en
la frecuencia de las ondas de radio. Dependiendo del entorno
electrónico y molecular en que se encuentre
(apantallamiento), esta señal se verá desplazada en
el espectro resultante (desplazamiento químico), por lo
que podemos reconocer este entorno e identificar la
molécula. El espectro se obtiene aplicando la transformada
de Fourier (Figura 3). En un estudio retrospectivo, Seli et
al
. (11) concluyen que el perfil metabolómico del
medio de cultivo embrionario, usando RMN, se correlaciona con el
potencial reproductivo del embrión.

La espectrometría de masas (MS) es un
método analítico de separación y
determinación de la masa molecular de los componentes de
una muestra. Estos son ionizados y separados en relación a
su masa y carga. Esta técnica nos provee de la alternativa
analítica más sensible para detectar metabolitos de
concentración micromolar, niveles típicos de
concentraciones fisiológicas (Botros et al. 2008)
(5).

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Figura 3.- Ejemplos de análisis
metabolómico por espectroscopía RMN de componentes
puros y fluidos biológicos. (A) Regiones conocidas
de desplazamiento químico para RMN (0–12 ppm).
(B) Espectro RMN por transformada de Fourier (0–5
ppm) de ácido láctico 6 mM en agua, obtenido usando
un espectrómetro Varian de 500 MHz. (C) Espectro
RMN, por transformada de Fourier (0–5 ppm) analizando 18 ml
de una muestra de medio de cultivo de FIV, diluida en 600 ml de
una solución 10%D2O/90%H2O, obtenido con un
espectrómetro Varian de 500 MHz. Ileu, isoleucina; Leu,
leucina; Lact, lactato; Ala, alanina; Acet, acetato; Meth,
metionina; Glu, glutamato; Pyr, piruvato; Gluc,
glucosa.

(Botros et al. 2008)
(5)

Técnicas
espectroscópicas aplicadas al análisis
metabolómico

Repasaremos cuatro trabajos sobre análisis
metabolómico, realizados con tres técnicas
diferentes (NIR, Raman y RMN), con el objetivo de comprobar si,
con la aplicación de estas técnicas, se puede
establecer la relación entre sus resultados y el potencial
reproductivo del embrión.

1.- Espectroscopía vibracional: Raman y
NIR
. (Seli et al. 2007) (1)

Se realiza un estudio prospectivo para determinar si el
perfil metabolómico del medio de cultivo se corresponde
con el potencial reproductivo de cada embrión. En ese
estudio se plantea la hipótesis de que el embrión
que resulta en embarazo puede ser diferente, en su perfil
metabolómico, a los embriones que no lo consiguen y que
esa diferencia podía ser detectada con una rápida
evaluación de su medio de cultivo usando el
análisis espectroscópico y la
bioinformática.

Participaron pacientes de dos clínicas, una en
Yale y otra en New Haven. Todas las pacientes de IVF fueron
consideradas para el estudio, excluyendo a las que presentaban un
desarrollo endometrial anormal.

Tras los protocolos de estimulación y
extracción de los ovocitos, estos fueron inseminados. Al
día siguiente (día 1), cada ovocito fue examinado
para comprobar su fecundación. Aquellos encontrados con
dos pronúcleos fueron colocados en gotas individuales de
medio, para su cultivo hasta el estado de división, de
30&µl, días 1 a 3, en Yale y 50&µl
para el mismo periodo en New Haven.

Un sistema de valoración del embrión
basado en la tasa de división y rasgos morfológicos
fue usado en ambos centros para evaluar sus cualidades. Los
pacientes que no tuvieron suficiente número de embriones
de calidad el día 3 susceptible de prolongar el cultivo,
se seleccionaron para transferir sus embriones ese día. De
los que tenían suficientes, se prolongaba el cultivo hasta
el día 5 y ya se transferían.

Una vez extraídos del medio para transferirlos,
se colocaron las muestras del medio en crioviales individuales
etiquetados y se congelaron a -80ºC. Una muestra de medio
que no tuvo embrión se incubó y se congeló
igualmente como control.

Las muestras correspondientes a embriones que no
implantaron se etiquetaron como tasa de implantación
cero. A las muestras correspondientes a pacientes cuyos
embriones transferidos habían implantado todos, se les
asignó la tasa 100.

Se seleccionaron las pacientes con tasa 0 ó 100,
cuyas muestras se enviaron para su análisis en hielo seco
al laboratorio de metabolómica de la Universidad de
McGill, Montreal (Canadá). Un total de 69 muestras de
medio de 30 pacientes, recogidas después del transfer en
el día 3, fueron evaluadas en el estudio.

Realizaron dos análisis de las muestras: uno con
espectroscopía Raman y el otro con espectroscopía
de infrarrojos NIR.

1.1.- Análisis por espectroscopía
Raman

Antes del análisis las muestras se colocaron
durante 30 minutos a 25ºC, esto es, la temperatura de la
habitación. Se usó un espectrógrafo
reflexivo Advantage 200A con un detector CCD. Se llenaron las
cubetas de cuarzo, de 1mm de diámetro, compatibles con
espectroscopía Raman, con 15 &µl de muestra. Se
registró el espectro desde 50 hasta 3450

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empleándose 5 minutos por muestra.

1.2.- Análisis por espectroscopía
infrarrojos (NIR)

Antes del análisis se pusieron las muestras a
temperatura ambiente, de 25ºC, durante 30 minutos. Las
muestras se diluyeron 3:1 en Milli-Q water. Se usó un
espectrógrafo reflexivo, con un fotodiodo detector de
rango dinámico largo. La cubeta de lectura, con una
longitud de paso de 10 mm, fue llenada con 15 &µl del
preparado de la muestra. El espectro se registró desde 700
nm hasta 1050 nm.

1.3.- Desarrollo del modelo espectral.

La cuantificación de las propiedades de la
muestra con el espectro de Raman o NIR consiste en determinar la
más restringida combinación de variables, en el
rango de longitud de onda seleccionado, optimizando con un
programa informático de algoritmo genético
consistente en los siguientes pasos:

1 Elegir el número de variables a incluir en el
modelo.

2 Generar una población inicial de individuos
aleatoria.

3 Evaluar la salud de cada individuo.

4 Obtener la siguiente generación.

5 Repetir los pasos 3 y 4 para un determinado
número de generaciones.

6 Repetir los pasos 1 a 5 con un incremento del
número de variables incluidas en el modelo.

7 Elegir el número de variables
óptimo.

8 Evaluar el modelo usando un conjunto de datos
independientes.

1.4.- Resultados para espectroscopía
Raman.

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C

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Figura 4. (A) Análisis espectral Raman del
medio de cultivo de un total de 36 embriones. Se muestra la
dispersión de intensidades a diferentes números de
onda. (B) Las señales obtenidas, analizando cada
muestra por espectroscopía Raman, son aproximadas por
extracción de la media a cada número de onda. Los
valores medios son calculados para los medios de cultivo de los
embriones que implantaron y llegaron al parto (n ¼ 15,
mostrados en rojo), y aquellos que no implantaron (n ¼ 21,
mostrados en azul). (C) Índices de viabilidad
calculados usando el espectro Raman del medio de cultivo para
embriones que implantaron y llegaron al parto (rojo), y aquellos
que no implantaron (azul). Los círculos y los cuadrados
representan a los pacientes individualmente. En los
gráficos en caja con muescas, las líneas verdes
corresponden a las medias de los grupos de datos. Los valores de
los índices de implantación fueron
significativamente diferentes entre los dos grupos (P<0.001).
(Seli et al, 2007) (1)

El espectro Raman obtenido fue el mostrado en la figura
4-A.

Usando el algoritmo genético descrito, se
identifican tres áreas en el rango espectroscópico
analizado, que fueron identificados como los más
discriminatorios entre los dos grupos de estudio. Aplicando el
modelo matemático se calculó el índice de
viabilidad (Figura 4-B).

Con el análisis por espectroscopía Raman
quedó comprobado el potencial reproductivo, demostrados
los altos índices de viabilidad de los positivos (0.5886
± 0.2222), respecto a aquellos con fallo de
implantación (0.3264 ± 0.2884) (P<0.01). (Figura
4-C). La espectroscopía Raman identificó el
potencial de implantación/embarazo con una sensibilidad
del 85.7% y una especificidad del 76.5%.

1.5.- Resultados para espectroscopía
NIR

El análisis por espectroscopía NIR se
completó obteniéndose un espectro similar al
obtenido con la espectroscopía Raman, en el que fue
observada una amplia variación entre las señales
registradas de las diferentes muestras.

Usando un modelo semejante al anterior, las
señales fueron aproximadas extrayendo el término
medio para cada longitud de onda y calculados los valores
promedio por cada grupo de estudio. Con un algoritmo
genético se identificaron cuatro áreas en el rango
espectroscópico registrado, asignadas como las más
discriminatorias entre los dos grupos. Aplicando el modelo
matemático a esa región, se calculó el
índice de viabilidad. Con el análisis por
espectroscopía NIR, en Morristown (New Jersey), se
comprobó el potencial reproductivo, observando los altos
índices de viabilidad (0.6712 ± 0.27615) comparados
con aquellos con fallo de implantación (0.29227 ±
0.22355) (P<0.05). La espectroscopía NIR
identificó el potencial de implantación/embarazo
con una sensibilidad del 75% y una especificidad del
83.3%.

A pesar de que las muestras fueran recolectadas en
diferentes centros de reproducción y usando diferentes
medios de cultivo, los índices de viabilidad de los
embriones con potencial reproductivo demostrado, fue alto (0.7100
± 0.1420) en comparación con los embriones con
fallo de implantación (0.3540 ± 0.2982)
(P<0.05).

Usando una curva con la sensibilidad óptima, fue
calculada al 100% con una especificidad asociada del 70%.
Resultó un valor predictivo positivo de 1.0 y un valor
predictivo negativo de 0.46.

2.- Espectroscopía NIR (Vergouw et
al
. 2008) (4)

En este estudio investigan si el perfil
metabolómico de los biomarcadores del medio de cultivo
usado por el embrión, analizado por NIR, tiene
correlación con el progreso del embarazo al transferir un
solo embrión

2.1.- Procedimientos de laboratorio.

Tras los protocolos de estimulación y
extracción de los ovocitos, se procede a inseminar los
seleccionados con FIV o ICSI (total de 333 ciclos; 304 de
día 3 y 29 de día 2). A las 16-18 horas de la
inseminación se valora la fecundación. Los
embriones se cultivan individualmente en gotas de 25
&µl de medio de cultivo, con gotas paralelas del mismo
medio, sin embrión, como control. A cada embrión se
le hace una valoración antes de la transferencia, con la
morfología, el número de blastómeras y la
tasa de fragmentación. El embrión con el mayor
número de blastómeras y menor tasa de
fragmentación será el transferido. Si solo hubiera
uno disponible sería el transferido a los dos días
de la recuperación del ovocito y fecundación, sin
tener en cuenta la morfología. Seguidamente, cada gota de
medio usado y el control se congelan y son enviados a
Molecular Biometrics, Montreal (Canadá), donde se
analiza por NIR.

2.2.- Resultados del análisis.

Los grupos espectrales (ROH, -SH, C=C, -CH, -OH y -NH)
que discriminan entre resultados positivos y negativos de
embarazo, definidos por la actividad cardiaca fetal (FCA) a las
12 semanas, son determinados con métodos de
búsqueda por algoritmos genéticos, aplicando el
método de regresión de los mínimos cuadrados
y leave-one-out cross validation, dando una
clasificación relativa de la viabilidad del
embrión. La tasa global de embarazos evolutivos en
día 2 fue 17.2% (5/29), y 29.3% (89/304) en día
3.

El modelo matemático empleado en la
interpretación de los datos de NIR, diferente al usado por
Seli et al. (1), produjo una clasificación de la
viabilidad del embrión que se correspondía con el
potencial reproductivo determinado por los resultados de
embarazo.

El resultado promedio de la viabilidad relativa de los
grupos con FCA negativa y positiva, con transferencia de un solo
embrión (Single Embryo Transfer, SET),
después del día 2, fue 0.2295 (±0.0985)
negativa y 0.2814 (±0.0224) positiva (P<0.03). Del
día 3 fue 0.2767 (±0.1115) y 0.3076
(±0.0974), respectivamente (P<0.02).

Los resultados indican que los embriones que implantan y
consiguen llegar a embarazos evolutivos (positivo), influyen en
su entorno de diferente manera a los que tienen fallo de
implantación (negativo). Esto está de acuerdo con
estudios previos en los cuales fueron encontradas diferencias en
el metabolismo embrionario de la glucosa, piruvato y
turn-over de aminoácidos; la
espectroscopía NIR analiza los cambios en varios grupos
orgánicos funcionales asociados con estos metabolitos. Hay
que considerar los factores que contribuyen a FCA: edad de la
madre, fragmentación y viabilidad relativa asociada a
embarazo evolutivo.

3.- Espectroscopía Raman (Scott et
al.
2008) (7)

El objetivo es determinar si el perfil
metabolómico del medio de cultivo del embrión en
desarrollo, determinado por Raman, está relacionado con
las tasas de implantación en FIV. Posiblemente lo
más importante de estos resultados sea determinar si el
valor límite puede ser usado para predecir mayores
diferencias en el potencial de implantación. El estudio se
realiza con un diseño prospectivo ciego.

3.1.- Procedimientos de laboratorio.

Tras los protocolos de estimulación y
extracción de los ovocitos, se inseminaron por FIV o ICSI,
según fuera lo más indicado, se prepararon en gotas
de 50&µl y se incubaron con un 5% de
oxígeno.

Al día siguiente, después de comprobar la
fecundación por la presencia de dos pronúcleos, se
colocaron en gotas individuales de 50&µl de medio para
su cultivo hasta el estado de división (días 1 a
3). Los pacientes que no tuvieron suficiente número de
embriones de calidad el día 3 como para prolongar el
cultivo, se seleccionaron para transferirlos ya. De los que
tenían suficientes, se prolongaba el cultivo hasta el
día 5, cuando se transferían. Después de
extraer los embriones de los cultivos, los medios se depositaron
en crioviales individuales y se congelaron a
-80ºC.

Los pacientes que alcanzaron el 100% de
implantación y progresaron hasta el alumbramiento,
tuvieron acreditado su potencial reproductivo y fueron
identificados los primeros. En cada caso, el siguiente paciente
de la misma edad, con nivel de FSH de 1 UI/L, con tasa de
implantación 0, fue seleccionado para representar los
embriones con la menor tasa de implantación.

Las muestras se volvieron a identificar con
números aleatorios y enviados a la Universidad de McGill
para su análisis bioespectroscópico, que se
realizó usando un sistema Raman basado en HeNe (DeltaNu
Advantage100, Laramie. WY), con un espectrógrafo reflexivo
y un detector CCD. Las cubetas de cuarzo, compatible con Raman,
de 1 mm de diámetro, fueron llenadas con 15 &µl
de muestra. Se registró el espectro desde 50 a 3450
Monografias.coma 25ºC
± 1ºC, empleando 5 minutos por muestra. La
interpretación y cuantificación de las propiedades
de cada espectro se facilitaron usando un modelo de algoritmo
genético.

Los índices de viabilidad de los embriones que
implantaron se compararon con los que no lo consiguieron usando
el test de la t de Student. El proceso fue el
mismo para los transferidos en día 3 y 5.

Para finalizar se realizaron curvas ROC (Receiver
Operator Characteristic
) para identificar el valor
límite con mejor sensibilidad y especificidad en conjunto.
Este valor límite fue aplicado a los datos para calcular
con precisión los valores predictivos de positivos y
negativos.

3.2.- Resultados

Un total de 44 muestras ciegas, obtenidas de 19
pacientes, fueron analizadas, de las cuales 35 muestras eran de
14 pacientes (74%) en día 3, y 9 muestras de 5 pacientes
(26%) en día 5. Se obtuvo el espectro de cada una de
ellas. La alta variación observada en las señales
de cada muestra era consecuente con la variación esperada
por el metabolismo de los embriones.

Los resultados fueron cegados y las muestras de los
días 3 y 5 se compararon. Los índices de viabilidad
del día 3 (0.71 ± 0.07) fueron significativamente
más altos que los del día 5 (-0.51 ± 0.13)
(P<0.001). Esto probablemente refleje las diferencias del
metabolismo en las diferentes etapas de desarrollo.

Posteriormente los datos se separaron según los
días del transfer. En el día 3, la
evaluación de las muestras demostró los altos
índices de viabilidad de los embriones con acreditado
potencial reproductivo (0.875 ± 0.12) frente a los que
tuvieron fallo de implantación (0.56 ± 0.09) (P<
0.03). Específicamente, los índices de viabilidad
de las muestras asociadas con implantación (N=16) fueron
significativamente más altas (0.94 ± 0.1) que las
que no implantaron (N=17) (0.51 ± 0.07) (P<0.002). En
el día 5 fueron evaluadas de forma similar, pero una
muestra se salía del rango, y fue eliminada, tal vez por
contaminación del aceite de la placa de
cultivo.

Reevaluando los datos se demostró
significativamente el alto índice de viabilidad asociado
con implantación (-0.81 ± -0.08) frente a los que
no implantaron (-0.21 ± -0.14) (P<0.009).

La curva ROC se realizó para ayudar a seleccionar
el valor límite, que puede ser usado cuando se calculen
los valores predictivos de sensibilidad y especificidad, y la
precisión en su conjunto (Figura 5).

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Figura 5.- Curvas ROC (Receiver Operator
Characteristic
) de índices de viabilidad y resultados
clínicos. La precisión global para predecir
resultados usando los límites derivados del
análisis con la curva ROC fue 80.4%. (A). Curva ROC
generada por 33 muestras de cultivo usado de día 3. La
precisión diagnóstica global para predecir la
implantación y parto fue 76%. (B). Curva ROC
generada por 8 muestras de cultivo de día 5. La
precisión global del diagnóstico fue del
100%.

(Scott et al. 2007)
(7)

4.- Espectroscopía por RMN (Seli et
al
. 2008) (11)

El objetivo es identificar los biomarcadores asociados a
resultados reproductivos a través del perfil
metabolómico, obtenido por Monografias.comRMN, del medio de cultivo del
embrión.

Igualmente, tras los protocolos de estimulación,
extracción, fecundación y evaluación, se
procedió a las transferencias en días 3 y 5, de
acuerdo con el número de embriones de calidad disponibles.
Después se congelaron las muestras de medio. Tras
completar los ciclos, se identificó a las pacientes con el
100% y el 0%, según se implantaran o no, y se
procedió al análisis de las muestras en la
Universidad de McGill.

4.1.- Adquisición del espectro

Las muestras se pusieron a temperatura ambiente 30
minutos. Se diluyeron 18&µl de medio en
600&µl del disolvente preparado por dilución de
TSP [sodio 3-(trimetil-2,2,3,3)-1-ácido
propiónico-, en 250 ml de Monografias.comO/O al 10%. El TSP también actúa
como referencia para Monografias.comRMN. Se adquirió el espectro en un
espectrómetro Varian INOVA NMR a 500-MHz.

4.2– Resultados

Se evaluaron un total de 34 muestras de 18 pacientes, de
las cuales 17 embriones de 10 pacientes implantaron (se les
asignó 100%) y 17 embriones de 8 pacientes no implantaron
(se les asignó 0%).

Un incremento significativo (P=0.002) de las
concentraciones de glutamato se detectó en los medios de
embriones que resultaron en embarazo positivo, respecto a los no
viables. El glutamato puede ser generado con a-cetoglutarato y
amonio por una reacción de transaminación
catalizada por la glutamato deshidrogenasa en presencia de NADH.
Por tanto, los niveles elevados de glutamato en los medios de
cultivo de embriones con un mayor potencial de
reproducción, pueden ser un reflejo de la mayor capacidad
para reducir los niveles de amonio, potencialmente perjudiciales,
de estos embriones que la de los embriones no viables.
Además la señal para alanina, piruvato y glucosa
disminuyó en los positivos.

El índice de viabilidad media de los embriones
del grupo con demostrado potencial reproductivo, fue
significantemente más alto (0.6201 ± 0.1619)
comparado con los del grupo que fallaron en la
implantación (0.3799 ± 0.2660) (P<0.002). La
espectroscopía RMN identificó el potencial de
implantación/embarazo con una sensibilidad del 88.2% y
especificidad del 88.2%. Los dos grupos no se diferenciaron
significativamente en la clasificación embrionaria
previa.

Discusión
sobre las técnicas

Lo que se pretende conseguir con estas técnicas
es determinar las propiedades reproductivas del embrión,
índice de viabilidad, potencial de implantación,
capacidad de desarrollo evolutivo del embarazo y posibilidad de
consecución del parto al término con bebé
sano, a través del análisis metabolómico del
medio de cultivo del embrión, de manera rápida y
precisa.

En la tabla 1 vemos resumidos los resultados obtenidos
para los índices de viabilidad, por las técnicas
espectroscópicas descritas, en diferentes centros y en
días distintos, donde podemos observar que todos coinciden
en que estos índices son significativamente (P<0.05)
más altos para los positivos, con resultado de embarazo,
que para los negativos, que no lo consiguieron.

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En otro trabajo, Seli et al. (14) concluyen que
el perfil metabolómico del medio de cultivo embrionario
humano, obtenido usando NIR, es independiente de la
morfología y se corresponde con el potencial reproductivo
del embrión.

La espectroscopía NIR demuestra que el perfil
metabolómico del medio de cultivo usado, es capaz de
valorar con precisión este potencial en estado de
división, correlacionando la valoración relativa de
la viabilidad con el progreso del embarazo (Vergouw et
al
. 2008) (4). Además, sugiere que la
modificación del medio por oxidación puede ser un
indicador de estos parámetros, porque los grupos
funcionales detectados por NIR son sensibles a las especies
reactivas del oxígeno y es independiente de los criterios
de selección morfológica.

Entre las ventajas de NIR en el análisis del
perfil metabolómico, cabe destacar que sólo se
requiere una muestra de pequeño volumen (7-10
&µl) y, además, no resulta invasivo ni
tóxico para el embrión. Asimismo puede ser
fácilmente incorporado y colocado en las clínicas
como un aparato compacto; es rápido (menos de 1 minuto por
muestra) y relativamente fácil de usar, aunque necesita,
al igual que Raman, calibración externa.

El estudio realizado con espectroscopía Raman
tiene como objetivo determinar si el perfil metabolómico
del embrión en desarrollo está relacionado con las
tasas de implantación en FIV. Posiblemente lo más
importante de estos resultados sea determinar si el valor
límite puede ser usado para predecir mayores diferencias
en el potencial de implantación (Scott et al.
2008) (7)

Recientemente, con la disponibilidad de sistemas laser y
detectores de alta sensibilidad de bajo costo, se ha incrementado
el interés por la espectroscopía Raman, tanto
cualitativa como cuantitativamente, para la valoración de
muestras diversas (alimentos, fármacos,
explosivos…). Igualmente muestra gran capacidad para
establecerse como herramienta que permita una rápida
evaluación no invasiva del potencial reproductivo del
embrión antes de la transferencia. Tiene la ventaja de ser
compatible con muestras húmedas y a temperatura
ambiente.

El análisis del perfil metabolómico con
espectroscopía RMN se llevó a cabo para identificar
los componentes del medio que se corresponden con el potencial
reproductivo (Seli et al. 2008) (11).

La técnica de RMN, sólo está
limitada a la fuerza del campo magnético aplicado. Es una
técnica muy robusta y versátil, que posibilita la
medida de un elevado número de metabolitos de forma fiable
y repetitiva, partiendo de un proceso de acondicionamiento de
muestra muy sencillo, porque no hay que separarla. Tiene
además, un nivel de automatización muy alto, si
bien necesita personal cualificado.

La espectroscopia RMN ha demostrado ser una de las
tecnologías más efectivas para el análisis
metabolómico de fluidos biológicos. Es capaz de
estudiar tejidos intactos y líquidos, dando como resultado
un amplio perfil de los metabolitos.

Los pioneros en la aplicación de esta
técnica al diagnóstico de enfermedades, analizando
fluidos biológicos, fueron Nicholson, Lindon y Holmes en
1999 (13).

Un aspecto importante de la espectroscopia RMN es que
los mecanismos físico-químicos fundamentales son
completamente diferentes a otras técnicas y ofrece una
perspectiva científica distinta (Pauli et al.
2005) (19). En particular, la espectroscopia de RMN es muy
diferente a los procedimientos de cromatografía (tales
como HPLC) que, en combinación con la
espectrometría de masas, han sido hasta ahora los
métodos comúnmente utilizados para la
identificación y cuantificación de especies
moleculares en una muestra biológica.

Las técnicas no espectroscópicas, de
cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
y cromatografía de gases, que se han usado acopladas a
espectrometría de masas (MS), permiten analizar una gran
cantidad de metabolitos a sensibilidades muy superiores a las de
RMN. Sin embargo requieren conocer las propiedades
químicas de la muestra y tienen limitada la sensibilidad
al método de separación. El tratamiento de las
muestras es tedioso, haciéndose más lentas, por lo
que, aunque son útiles en el estudio, no lo son en el
diagnóstico preimplantacional a nivel clínico, que
exige rapidez en el procesado de las muestras y la
obtención de resultados.

Conclusiones

Con métodos de selección rápidos y
no invasivos, como la metabolómica, se consigue dar un
paso más en la búsqueda de la excelencia en las
clínicas de reproducción asistida. Las
técnicas espectroscópicas nos brindan un buen
método para conocer el perfil metabolómico del
embrión analizando el medio de cultivo donde
evolucionó en los primeros días. Al poder detectar
y seleccionar un embrión con alto potencial reproductivo,
las tasas de implantación serán mayores, pudiendo
reducir el número de ciclos de FIV por paciente necesarios
para conseguir un embarazo. A su vez, sin tener que transferir
más de un embrión, disminuirán las
consecuencias derivadas de los partos múltiples. El
número de embriones fecundados necesarios para estos
ciclos también se verá reducido. No siendo
manipulados, los embriones no serán dañados y los
que tengan ese gran potencial reproductivo podrán
desarrollarlo sin alteraciones a la hora de evolucionar tras
implantarse. Diagnosticándose con mayor
aproximación como sanos, se conseguirán en
más ocasiones embarazos evolutivos hasta el parto de un
bebé sano, disminuyendo las tasas de malformaciones,
abortos y riesgos perinatales y neonatales.

Queda mucho por conocer sobre la relación entre
la metabolómica y el diagnóstico de las
alteraciones más importantes aparecidas en el fenotipo
embrionario. La metabolómica, usando diversas formas de
enfoques analíticos, estudia ese conjunto dinámico
de metabolitos como pequeños biomarcadores moleculares a
fin de determinar y cuantificar cuáles están
asociados a estados fisiológicos y patológicos,
reconociendo las disfunciones en la respuesta a la influencia
genética, nutricional y ambiental.

Está por investigar si controlando los factores
externos, nutricionales y ambientales, se podría
establecer la relación entre el metaboloma y alteraciones
cromosómicas, causa de deficiencias fisiológicas
que padecerá el hijo. También queda por determinar
si el análisis metabolómico podría indicar
defectos epigenéticos que, aunque no afectarán al
desarrollo embrionario y al establecimiento del embarazo,
sí que podría influir en el desarrollo fetal y la
salud de los hijos.

Será necesario trabajar desde la perspectiva de
la biología de sistemas, considerando de forma
holística no solamente datos metabolómicos, sino
también genómicos, transcriptómicos y
proteómicos. El descubrimiento de esos biomarcadores nos
permitiría reconocer de forma prematura ciertas
enfermedades cuyo diagnóstico preimplantacional y no
invasivo sería altamente relevante.

Referencias

  • (1)  Seli E, Sakkas D, Scott R, et al.
    Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media
    using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with
    reproductive potential of embryos in women undergoing in
    vitro fertilization. Fertility and Sterility. 2007;
    88: 1350-1357.

  • (2)  JC Lindon, JK Nicholson, E Holmes.
    Handbook of Metabonomics and Metabolomics. Oxford.
    Elsevier, 2007.

  • (3)  John Paul Urbanski, Mark T. Johnson, David
    D. Craig, et al. Noninvasive Metabolic Profiling
    Using Microfluidics for Analysis of Single Preimplantation
    Embryos. Analytical Chemistry. 2008; 80:
    6500–6507.

  • (4)  Vergouw CG, Botros LL, Roos P, et
    al
    . Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy
    as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive
    method for embryo selection. Human Reproduction.
    2008; 23: 1499–1504.

  • (5)  Lucy Botros, Denny Sakkas and Emre Seli.
    Metabolomics and its application for non-invasive embryo
    assessment in IVF. Molecular Human Reproduction.
    2008. Vol.14, No.12 pp. 679–690.

  • (6)  Posillico JT and the Metabolomics Study
    Group for Reproductive Technologies. Selection of viable
    embryos and gametes by rapid, noninvasive metabolomic
    profiling of oxidative stress biomarkers
    . In: Cohen J,
    Elder K. Human Preimplantation Embryo Selection. London, UK:
    Taylor and Francis, 2007, 325–336.

  • (7)  Scott RT, Seli E, Miller K, et
    al
    . Non-invasive metabolomic profiling of human embryo
    culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic
    reproductive potential: a prospective blinded pilot study.
    Fertility and Sterility. 2008; 90:
    77–83.

  • (8)  M.G. Katz-Jaffe, S. McReynolds, D.K.
    Gardner, and W.B. Schoolcraft. The role of proteomics in
    defining the human embryonic secretome. Molecular Human
    Reproduction
    , 2009; Vol.15, No.5:
    271–277.

  • (9)  Sakkas D, Gardner DK. Noninvasive methods
    to assess embryo quality. Curr Opin Obstet Gynecol,
    2005; 17: 283–288.

  • (10) Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schoolcraft
    WB. Noninvasive assessment of human embryo nutrient
    consumption as a measure of developmental potential.
    Fertility and Sterility, 2001; 76:
    1175–1180.

  • (11) Emre Seli, Lucy Botros, Denny Sakkas, and
    David H. Burns. Noninvasive metabolomic profiling of embryo
    culture media using proton nuclear magnetic resonance
    correlates with reproductive potential of embryos in women
    undergoing in vitro fertilization. Fertility and
    Sterility
    , 2008; 90: 2183 – 2189.

  • (12) R. Singh y K.D. Sinclair. Metabolomics:
    Approaches to assessing oocite and embryo quality.
    Theriogenology 68s. 2007. s56-s62.

  • (13) Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E.
    "Metabonomics": understanding the metabolic responses of
    living systems to pathophysiological stimuli via multivariate
    statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.
    Xenobiotica 1999; 29: 1181–1189.

  • (14) Emre Seli, Carlijn G. Vergouw, Hiroshi
    Morita, et al. Noninvasive metabolomic profiling as
    an adjunct to morphology for noninvasive embryo assessment in
    women undergoing single embryo transfer. Fertility and
    Sterility
    , 2009; (Article in press).

  • (15) Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC and
    Holmes E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity
    and gene function. Nat Rev Drug Discov. 2002; 1:
    153.

  • (16) Lucinda L. Veeck and Ninika Zaninovic.
    An atlas of human blastocysts. New York. The
    Parthenon Publishing Group, 2003.

  • (17) Conaghan J, Hardy K, Handyside AH, et
    al
    . Selection criteria for human embryo transfer: a
    comparison of pyruvate uptake and morphology. J Assist
    Reprod Genet
    . 1993; 10(1): 21-30.

  • (18) D. Royère, P. Feuerstein, V.
    Cadoret, et al. Approches non invasives de
    l"embryon: protéomique, métabolomique,dialogue
    ovocyte-cumulus. Gynécologie Obstétrique &
    Fertilité (2009), doi:10.1016/j.gyobfe.2009.09.016
    (Article in press).

  • (19) Pauli GF, Jaki BU, Lankin DC. Quantitative
    1H NMR: development and potential of a method for natural
    products analysis. J Nat Prod 2005; 68:
    133–49.

Trabajo final del máster on
line sobre la base teórica y procedimientos de laboratorio
de reproducción asistida II. ADEIT-UV-IVI

 

 

Autor:

Antonio Cruz
Pinzón

Ldo. en Farmacia

Sevilla, 2009

Partes: 1, 2
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