Resumen
El cultivo celular es la técnica que ha permitido
conocer el comportamiento in vitro de todo tipo de
células, en la actualidad esta técnica es utilizada
para la producción de biofármacos, junto con la
estandarización de algunos protocolos que facilita su
manejo ha permitido grandes avances en la búsqueda de
nuevas curas ha enfermedades que antes se creían
incurables. En esta revisión se realiza con el fin de dar
a conocer los avances en las aplicaciones del cultivo celular a
la inmunología, se hace la relación de algunas
técnicas de laboratorio que pueden aplicarse sobre estos
cultivos y se ejemplifica la utilidad de las mismas, tomando como
modelo diversos trabajos que estudian las respuestas del sistema
inmunológico frente a diferentes enfermedades haciendo
énfasis en el uso de esta técnica en cáncer
y la búsqueda de vacunas.
Palabras clave: cultivo celular,
inmunología
Introducción
La inmunología es una ciencia que estudia los
procesos moleculares y celulares implicados en la defensa de la
integridad biológica del organismo a través de la
identificación de las sustancias propias y
detección de las sustancias extrañas y su
destrucción. En cada organismo, los mecanismos de defensa
son muy diversos y heterogéneos, aunque siempre existe una
actuación integrada de todos ellos. Entendemos por
respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el
sistema inmune al objeto de defender la integridad
biológica del individuo frente a cualquier agresión
(estimulo antigénico). La Inmunología comprende
diversas áreas: Inmunogenética,
Inmunobiología, Inmunopatología o
Inmunología clínica, Inmunofarmacología,
Inmunología veterinaria, etc.
Los seres vivos al entrar en contacto con el ambiente
siempre están expuestos a diversos factores adversos como
generación de tumores e infecciones de bacterias, virus,
hongos, etc. Para enfrentar a estos diferentes factores los
organismos disponen de un conjunto de elementos especiales,
conocido como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere
antes de nacer y se madura y consolida en los primeros
años de la vida fuera del seno materno.
El cultivo masivo de líneas celulares animales es
fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos
productos biotecnológicos. Una de las aplicaciones
más interesantes del cultivo celular ha consistido en la
obtención de productos de uso terapéutico que ya
han alcanzado el mercado farmacéutico. Los avances
logrados en la tecnología de cultivo celular han permitido
que productos cada vez más complejos se pongan al alcance
del público usuario.
En esta sección se presentan los diferentes
productos del cultivo celular en orden creciente de complejidad
del proceso involucrado. Los productos biológicos
producidos mediante la tecnología del ADN recombinante en
cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintéticas,
inmunobiológicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas,
linfoquinas y agentes anticancerígenos).
Las aplicaciones del cultivo celular en la
inmunología se han dado especialmente gracias a la
introducción de las técnicas de fusión
celular en la producción de anticuerpos monoclonales,
así como en el análisis de la genética de la
célula somática.
Discusión
Una de las áreas en las cuales se han observado
grandes avances con la utilización de cultivos de
células es el diagnóstico de infecciones virales.
Dicho diagnóstico es posible al buscar señales de
cambios degenerativos conocidos colectivamente como efecto
citopático en cultivos en monocapa de diferentes
líneas celulares. El observador experto puede emitir un
diagnóstico preliminar basándose en la línea
celular implicada, en el tiempo de incubación y en la
magnitud del efecto citopático, aunque pruebas adicionales
son necesarias para la identificación definitiva del
virus. (Tavira et al., 2009).
Elemplo de esto son los analisis terapeutico que se han
realizado anticuerpos monoclonales contra el Virus del Dengue
tipo 2 (DENV-2), recordemos que esta enfermedad es de amplia
distribucion y que en la actualidad no se le ha encontrado cura,
este estudio tubo como objetivo identificar anticuerpos
monoclonales (MAbs) que pueden servir como terapia
post-exposición, se investigó en detalle la
actividad funcional de un amplio grupo de nuevos anti-DENV-2
mouse MAbs. sitios de unión fueron asignadas por la
exhibición de la levadura de superficie y escapar de la
neutralización, ensayos de inhibición de
células de cultivo se realiza con cepas homólogas y
heterólogas, y la actividad profiláctica y
terapéutica se evaluó con dos modelos de
ratón. (Sukupolvi et al., 2010)
Los resultados optenidos en esta investigacion
sugieren:
los anticuerpos producidos contra un genotipo dentro
del serotipo DENV-2 puede haber disminuido la potencia
inhibitoria contra genotipos heterólogos. Teniendo en
cuenta que este paradigma también parece cierto para
DENV-1 y DENV-3 , puede ser crítico evaluar si las
respuestas de anticuerpos policlonales generados contra cepas
de la vacuna, que son inherentemente atenuada frente a la
infección natural, neutralizar las cepas de los
genotipos heterólogos más divergentes dentro de
un serotipo de forma duradera. (Sukupolvi et al.,
2010)In vitro se ha demostrado el papel de los
anticuerpos antidengue, sin embargo ha sido difícil
demostrar tales fenómenos en el transcurso de
infecciones naturales dada la complejidad de los procesos que
ocurren durante las infecciones con DENV-2 no ha permitido,
hasta ahora, describir con exactitud los fenómenos
fisiológicos, bioquímicos e
inmunológicos que tienen lugar, lo cual obstaculiza el
desarrollo de terapias preventivas y terapéuticas.
(Sukupolvi et al., 2010)
El uso de vacunas de cultivo celular reduce el riesgo de
reacción alérgica, ya que no contienen los
alergenos comunes como los presentes en la vacuna 17D la cual
??puede causar efectos adversos graves viscerotrópica y
neurotrópica y anafilaxia. viscerotrópica de la
enfermedad es una infección fulminante virus 17D en los
órganos del hígado y visceral parecido a la
adquirida de forma natural la fiebre amarilla.
Neurotrópico enfermedad normalmente que sigue la
invasión del cerebro donde el virus de la vacuna puede
replicarse. El fundamento para el desarrollo de una nueva vacuna
contra la fiebre amarilla ha sido revisado recientememnte cabe
señalar que la fiebre amarilla, es una enfermedad letal,
que se produce en zonas tropicales de América del Sur y
África. Y las vacunas que en la actualidad se utiliza
contienen al virus de manera viva atenuada (17D), este
medicamento fue desarrollado en 1936 y es ampliamente utilizado,
con aproximadamente 20 millones de dosis distribuidas anualmente.
(Monath, et al., 2011)
La XRX-001 es una vacuna experimental contra la fiebre
amarilla fabricado por Xcellerex de la cepa 17D ??cultivada en
células Vero. Virus es purificada a partir de
líquido de el cultivo, inactivada con
ß-propiolactona, adsorbidos en hidróxido de aluminio
0,2% (alumbre), y se formulen con stabilizers. ha demostrado que
la vacuna es altamente inmunogénica en ratones,
hámsters y monos, y ha proporcionado protección
contra virus de la fiebre amarilla. (Monath, et al.,
2011)
Se realizó el primer estudio clínico de
XRX-001. Y se encontro beneficios potencial de mejora de la
seguridad compensará los títulos de anticuerpos
más bajos en las decisiones regulatorias que queda por
determinar. Debido a su baja incidencia, una reducción de
los efectos adversos graves viscerotrópica y
neurotrópica después de la administración de
la vacuna inactivada no puede ser directamente demostrado en
ensayos clínicos y se requieren estudios
post-comercialización. Los próximos pasos
necesarios para el desarrollo de la vacuna XRX-001 incluyen la
evaluación de la durabilidad de la respuesta de
anticuerpos reportados en el presente ensayo y el inicio de un
estudio doble ciego, de fase del estudio clínico. (Monath,
et al., 2011)
En cuanto a las enfermedades inflamatorias asociadas con
la respuesta inmune, un número considerable de pacientes
presentan síntomas inflamatorios no
característicos, y constituyen un reto diagnóstico
y terapéutico. Estos casos no característicos por
lo tanto puede representar una etapa temprana, o mostrar una
presentación atípica, de un trastorno del tejido
conectivo mixto o una infección. La determinación
del fenotipo inmune de los linfocitos desangre por
citometría de flujo es un procedimiento rutinario de
diagnóstico para la evaluación de las enfermedades
linfoproliferativas e inmunodeficiencia VIH del paciente(Jones et
al., 2008). Es por esto que el método empleado por
citometría de flujo es adecuado para laboratorios de
diagnóstico clínico, y que promete ser una valiosa
fuente de información clínica para pacientes con
síntomas inflamatorios inusuales, guiando
máspruebas de diagnóstico y proporcionando una base
para la terapia Ex juvantibus.
Finalmente en cuanto a las respuestas inmunes producidas
por contaminantes del medio ambiente generados por
combustión incompleta de fuentes decarbono, se ha podido
demostrar que una variedad de hidrocarburos aromáticos
policíclicos HAP son cancerígenos e
inmunosupresores. De hecho, los HAP cancerígenos, como el
benzo [a] pireno, puede suprimir tanto humoral (células B)
como celular (mediada por células T) la respuesta inmune
(Allan and Sherr, 2010).
La mayoría de estos efectos adversos están
mediados por el receptor de aril hidrocarburos (AHR). En algunos
casos, la inmunotoxicidad de linfocitos puede estar mediada
indirectamente a través de las células accesorias
(Allan and Sherr, 2010).
Muchos estudios realizados en modelos animales
evalúan los mecanismos por los que los HAP, y otros
ligandos Ahr relacionados (por ejemplo, hidrocarburos halogenados
aromáticos / Hahs), median la inmunosupresión.
Estos estudios revelan que los ligandos Ahr suprimen la inmunidad
por su capacidad de compromiso prácticamente en todas las
etapas de desarrollo de los linfocitos, activación y
función efectora de estudio.
Es por esto que el Ahr juega un papel clave en la
regulación inmune y que los ligandos ambientales Ahr
pueden comprometer significativamente la inmunidad mediante la
alteración de desarrollo y la función de los
linfocitos Ahr-dependientes.
Se ha caracterizado los efectos de la infección
por El virus BK (BKV) en leucemia promielocítica nucleares
PML-RN en su huésped natural, las células RPTE. Los
resultados muestran que la infección por BKV
provocó una reorganización radical de la LMP-RN,
con una disminución en el número PML-NB y un
aumento de tamaño. Además, tanto hDaxx y SP100 se
encontraron dispersos de PML-RN. Esta reorganización
requiere BKV la replicación del ADN, los BKV focos de ADN
se encuentran adyacentes a PMLNBs durante la infección
tardía. Más importante aún, se presenta
evidencia de que la reorganización de la PML-RN es una
estrategia que BKV utiliza para desactivar las funciones
intrínsecas antivirales de la LMP-RN. En él se ha
desarrollado un sistema de cultivo celular en células
primarias de RPTE humanos analizar la infección BKV.
(Jiang et al., 2011)
BKV crece analíticamente en estas células,
y la morfología de las células infectadas por BKV
es similar a la observada en PVAN los riñones del
paciente. Este sistema proporciona un primer paso hacia obtener
una imagen completa del ciclo de vida BKV. Para definir los
factores virales responsables de esta reorganización, se
analizó la localización celular del antígeno
del tumor de grandes BKV (TAG) y el ADN viral. TAG
colocalizó con PML-RN durante la infección
temprana, mientras que un número de cromosomas BKV fueron
junto a la PML-RN durante la infección tardía. Se
demostrado que esta por sí sola no era suficiente para
reorganizar PML-RN y que la replicación del ADN viral
activa se requiere. Derribo de la proteína PML no afectan
de manera dramática el crecimiento BKV en el cultivo. Sin
embargo, fue capaz de rescatar el crecimiento de un virus simple
del herpes ICP0 nulo un mutante cuyo crecimiento defectuoso se
debe en parte a su incapacidad para alterar PML-RN. Se tiene la
hipótesis de que las funciones de antivirales de la LMP-RN
se inactivan través de la reorganización durante el
funcionamiento normal infección de BKV. (Jiang et al.,
2011)
Anticuerpos específicos del factor de virulencia
derivados de la vacunación o empleados como agentes
terapéuticos representan un potencial de defensa contra
las enfermedades bacterianas. Los resultados obtenidos describen
por primera vez recombinante derivado de los anticuerpos
monoclonales contra SEB que poseen alta afinidad y especificidad
de destino, y el potencial terapéutico para
superantígeno shock inducido por tóxicos. Estos
anticuerpos prevenir la intoxicación por toxina interfiere
con la unión a MHC II y / o TCR. Además de las
aplicaciones potenciales para el tratamiento del síndrome
de shock tóxico, los anticuerpos monoclonales humanos
reconociendo SEB u otros superantígenos bacterianos puede
ser útil si se emplea como tratamiento complementario con
antibióticos en el tratamiento de infecciones por S.
aureus difícil. (Larkin et al., 2010)
Por ejemplo, una combinación de
antibióticos y de inmunoglobulinas fue defendida
previamente para la lucha contra las infecciones de S. pyogenes.
Este paradigma puede ser eficaz contra la meticilina, así
como la vancomicina, las cepas resistentes de S. aureus, ya que
muchos aislados en los Estados Unidos producen
superantígenos diversos que incluyen SEB y SEC. Otros
enfoques terapéuticos basados ??en anticuerpos se han
sugerido para el tratamiento de las infecciones por S. aureus.
(Larkin et al., 2010)
Por ejemplo:
un estudio de fase II que emplea un humanizado IgG1
orientación S. aureus factor aglutinante A (ClfA, una
proteína de unión a fibrinógeno) dio
lugar a una buena tolerancia por los pacientes y prometedores
resultados clínicos preliminares. Una
preparación IgIV utilizado clínicamente en los
recién nacidos contiene anticuerpos contra los
componentes de la superficie microbiana que reconocen.
(Larkin et al., 2010)Además de la caracterización in vitro
de los anticuerpos monoclonales, los ensayos
biológicos consisten en un cultivo de células
humanas fueron utilizados para predecir los efectos
fisiológicos (es decir, neutralizar la toxina) los
efectos de cada anticuerpo. Los dominios Fc añadido a
Fab 1 y 3 tuvieron efectos mínimos sobre la IC50 en
cultivos celulares, mientras que nativos de larga
duración Mabs 9 y 10 dio lugar a la inhibición
mucho mayor en comparación con sus homólogos de
Fab. (Larkin et al., 2010)Por último, los anticuerpos policlonales se
mezclaron de sueros humanos y se utilizan actualmente para el
tratamiento de diversas enfermedades como el síndrome
de Kawasaki, colitis por Clostridium difficile, virus
respiratorio sincitial, citomegalovirus, neuropatías
crónicas dysimmune, neuropatía desmielinizante
inflamatoria crónica polyradiculo, y la poliarteritis
nodosa. (Larkin et al., 2010)Estos productos IgIV, naturalmente, varían en
potencia de proceso por lotes, representan un riesgo
potencial para la transmisión de agentes infecciosos,
y los mecanismos de acción generalmente no son bien
caracterizado. Recombinante por ingeniería monoclonal
humano anticuerpos dirigidas a los factores de virulencia
específicos, tal como se presenta en este estudio,
evitar muchas de estas preocupaciones. (Larkin et al.,
2010)
Otros enfoques terapéuticos basados ??en
anticuerpos se han sugerido para el tratamiento de las
infecciones por S. aureus. Por ejemplo, un estudio de fase II que
emplea un humanizado IgG1 orientación S. aureus
aglutinación factor A (ClfA, una proteína de
unión a fibrinógeno) dio lugar a una buena
tolerancia por los pacientes y prometedores resultados
clínicos preliminares. Una preparación IgIV
utilizado clínicamente en los recién nacidos
contiene anticuerpos contra los componentes de la superficie
microbiana que reconocen moléculas adhesivas de la matriz
(MSCRAMM) que se encuentran en los S. aureus y Staphylococcus
epidermidis. En particular, las proteínas de unión
del fibrinógeno y ClfA SDrG (S. epidermidis
proteína repetir serina-aspartato G) son reconocidos por
la IgIV. Es concebible que una combinación de bien
caracterizados anticuerpos monoclonales humanos
orientación toxina de S. aureus (s) y antígenos de
superficie puede ser una más útil para el
tratamiento de inmunoterapia las infecciones por S. aureus.
(Larkin et al., 2010)
Las líneas celulares continuas humanas derivadas
de tumores sólidos se utilizan a menudo para explorar las
alteraciones biológicas y funcionales de las
células tumorales, la infección por Mycoplasma
hyorhinis puede jugar un papel importante en el cultivo de
líneas celulares de cáncer de colon humano que da
lugar a considerable aumento de la fracción celular de
células madre del cáncer CSC y se caracteriza por
la expresión de CD133 (Mariotti et al., 2010).
Es bien conocido que el micoplasma puede tener efectos
adversos en los cultivos celulares, tales como alteración
en los niveles de proteínas y de ARN y síntesis de
ADN, la inducción de aberraciones cromosómicas,
cambios en la composición de la membrana celular y la
modificación de lamorfología celular (Drexler y
Uphoff, 2002 citados por Mariotti et al., 2010). Es por esto que
los métodos para la detección, eliminación y
prevención de la contaminación deben ser incluidos
en el panel básico de técnicas de
investigación CSC (Mariotti et al., 2010).
En cuanto a las células T reguladoras (Treg) y
los mastocitos (MC) que generalmente son abundantes en el
cáncer colorrectal (CCR) se puede observar que la
interacción entre estos dos es conocido por promover la
inmunosupresión o la pérdida de funciones de las
Treg y la autoinmunidad (Blatnera et al., 2010).
El aumento de la respuesta inmune anti-tumoral a
través de agotamiento o la inactivación de Treg es
una opción terapéutica atractiva para el
tratamiento del cáncer (Blatnera et al., 2010).
las células T activadas autólogas
también ejercen un efecto anti-crónico de
células B de leucemia linfática in vitro e in vivo,
la leucemia linfocítica crónica (LLC) se deriva de
la acumulación de antígeno (Ag) y se asocia con
anormalidades inmunológicas graves, tales como
hipo-gammaglobulinemia, la discapacidad inmunoglobulina (IgE) la
formación de cambio de clase y la disminución de
centro germinal, todos los cuales aumentan la susceptibilidad a
las infecciones bacterianas (Di Ianni et al., 2009).
La mayoría de los tumores sólidos
contienen muchas células no malignas, incluyendo las
células inmunes y células endoteliales, que son
importantes en la inflamación. Las células
inflamatorias proporcionan proteasas que facilitan la
invasión tumoral y la remodelación de la matriz.
(Huang, 2002 Citado por Shiau et al., 2010). Kallistatin es un
inhibidor de la proteasa serina que ejerce una gran variedad de
efectos biológicos en las respuestas fisiológicas y
patológicas, como la regulación de la
presión arterial, inflamación y
anti-angiogénesis. Kallistatin puede prevenir la respuesta
inflamatoria al reducir la acumulación de
macrófagos (Chao, 2006 citado por Shiau et al.,
2010).
La entrega kallistatin gen puede ser lograda mediante la
administración sistémica de los vectores
lentivirales que lleven el gen kallistatin y asi la
expresión del gen puede inhibir el crecimiento del tumor y
mejorar la supervivencia en modelos murinos. Al tomar ventajas de
los efectos anti-angiogénicos y anti-inflamatorio de
kallistatin (Shiau et al., 2010).
Las células madre debido a sus funciones
inmunomoduladoras, mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial
en aplicaciones clínicas para prevenir el rechazo en el
trasplante de órganos y prevenir la enfermedad injerto
contra el huésped en células madre
hematopoyéticas (TPH). Dado que las células
dendríticas (DC) juegan un papel importante en la
modulación de diversas T respuestas de las células,
incluyendo el rechazo y la enfermedad del injerto contra el
huésped
Estudios recientes han investigado si las CMM modulan la
diferenciación de CC del CMH y si este efecto
podría ser uno de los mecanismos de inmunidad MSC
"funciones-modulación.
los resultados demuestraron que la
diferenciación de las CMH en países en
desarrollo maduro se inhibe en presencia de MSC.frecuencias similares de los precursores
dendríticas en los cultivos, ya sea con o sin MSC,
sugiere que la inhibición de MSC en la
diferenciación de los países en desarrollo
maduro de HSC puede ser debido a la detención de la
maduración en la etapa precursora
dendríticas.Los niveles reducidos de AMP cíclico,
monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y b-catenina
en las células DC, se detectan, lo que sugiere que la
inducción de la apoptosis y la inhibición de la
diferenciación podría ser la base para la
inhibición de los países en desarrollo maduro
de HSC por MSC.
Conclusiones
La aplicación del cultivo de células
animales dentro de la biotecnología se ha incrementado en
los últimos años ya que las ventajas ofrecidas por
éste son permitir el plegamiento correcto, brindar una
glicosilación compleja adecuada y totalmente relacionada
con la actividad farmacológica y en el caso de su
producción, secretar los productos al medio de
cultivo.
En la actualidad, estas ventajas permiten hacer del
cultivo de células un sistema competitivo a nivel
productivo en los países desarrollados ya que por medio de
él es posible obtener vacunas, anticuerpos monoclonales y
proteínas recombinantes cuyo valor agregado es
considerable. En México, debido a la apertura por parte de
las empresas farmacéuticas para la generación de
productos de origen biotecnológico es necesario brindar
información básica a la comunidad
farmacéutica del desarrollo de este tipo de cultivos a lo
largo de la historia así como de su clasificación y
usos más importantes, para facilitar la comprensión
de procesos farmacéuticos que utilicen este tipo de
sistemas.
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Autor:
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