Análisis de flujos metabólicos como herramienta para la evaluación de fenotipos industriales

Resumen

La versatilidad del metabolismo microbiano ofrece la
posibilidad de obtener una gran variedad de metabolitos de
interés biotecnológico. Para el desarrollo racional
de bioprocesos destinados a la obtención de dichos
metabolitos es necesario contar con herramientas de
análisis global que permitan el estudio holístico
del metabolismo. El análisis de flujos metabólicos
basado en marcación con sustratos que contienen 13C se ha
convertido en una importante herramienta de análisis
aplicada en Ingeniería Metabólica, y permite la
cuantificación de los flujos intracelulares del
metabolismo central de un microorganismo proveyendo una
visión completa del mismo. El conjunto de
metodologías utilizadas para este tipo de análisis
ha evolucionado considerablemente en los últimos
años y la introducción de nuevas técnicas ha
permitido la implementación de análisis de flujos
metabólicos en períodos de tiempo relativamente
cortos. En esta actualización se resumen algunas de las
aplicaciones recientemente descriptas en la bibliografía
para el análisis de flujos metabólicos relacionado
al estudio y optimización de bioprocesos industriales. El
texto concluye con una perspectiva de desarrollos
futuros.

Palabras clave: Análisis de flujos
metabólicos; Ingeniería Metabólica;
metabolitos de interés industrial; experimentos de
marcación con carbono; isotopómero;
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas

Metabolites of biotechnological interest à la
carte: Metabolic flux analysis as a tool for industrial
phenotypes evaluation

Abstract

Microbial metabolism is highly versatile, and offers the
possibility to obtain a wide range of biotechnological
metabolites. In order to design bioprocesses rationally to obtain
such metabolites, it is necessary to apply tools for global
analysis, which give a holistic view of the metabolism. Metabolic
flux analysis based on labeling with 13C-substrates has become an
important tool in Metabolic Engineering, and allows the
quantification of metabolic fluxes thus providing a whole picture
of the central microbial metabolism. The methodologies involved
in this kind of analysis have evolved considerably during the
last few years, and the introduction of new techniques enables
the implementation of accurate metabolic flux analysis with
shortened experimental time. In this work, a number of
recently-published applications of metabolic flux analysis on
industrial bioprocesses study and optimization is shortly
reviewed and discussed. An outlook to possible future
developments concludes the text.

Keywords: Metabolic flux analysis; Metabolic
Engineering; metabolites of industrial interest; carbon labeling
experiments; isotopomer; gas chromatography couple to mass
spectrometry

Introducción

La redundancia de enzimas individuales y de caminos
metabólicos completos en numerosas especies bacterianas es
una indicación inequívoca de la naturaleza
altamente flexible del metabolismo microbiano (25). Dado que
estas vías metabólicas son activas solamente bajo
ciertas condiciones específicas, en cada ambiente o
condición de crecimiento opera una determinada
distribución de flujos metabólicos que permite a la
célula acoplar la generación de energía y el
catabolismo de la fuente de carbono con los requerimientos
anabólicos para alcanzar un crecimiento óptimo. Por
este motivo, conocer, identificar, y, consecuentemente, manipular
las vías metabólicas activas en distintas
condiciones de crecimiento es un requerimiento esencial para el
diseño de bioprocesos destinados a la obtención
biotecnológica de productos derivados del metabolismo
microbiano.

La Ingeniería Metabólica comprende
una serie de metodologías pertenecientes a diversas
disciplinas y podría definirse, sensu lato, como la mejora
racional y dirigida de la formación de un producto, o una
propiedad celular, a través de la modificación de
reacciones bioquímicas del microorganismo, o introduciendo
nuevas rutas biosintéticas. El análisis de
flujos metabólicos (AFM) se ha convertido en las
últimas décadas en una de las herramientas
más relevantes en Ingeniería Metabólica. El
principal objetivo del AFM es la cuantificación detallada
de todos los flujos metabólicos del metabolismo central en
un organismo. El resultado final de un estudio de este tipo es,
por lo tanto, un mapa de reacciones bioquímicas que
muestra la distribución de flujos anabólicos y
catabólicos en el contexto de una red de reacciones
bioquímicas. Además de tratarse de una herramienta
de gran importancia para el análisis fisiológico
(41), surge en forma evidente la posibilidad de identificar (y
modificar) reacciones para la obtención de uno o varios
metabolitos a través de AFM.

En esta actualización se discuten brevemente las
metodologías de análisis fenotípico global
basadas en interpretación de flujos metabólicos
(por cálculo estequiométrico directo y por
marcación isotópica), y se exponen algunos ejemplos
de la aplicación de estas metodologías en
bioprocesos de interés industrial.

Análisis
estequiométrico de flujos
metabólicos

Esta metodología, establecida por Varma y Palsson
en los años 90 para la interpretación del
metabolismo central de Escherichia coli (38), hace uso del
conocimiento de la estequiometría en cada una de las
reacciones de una red metabólica determinada para la
estimación de flujos. Una de las restricciones más
importantes en este tipo de análisis es que el sistema
debe encontrarse en un estado estacionario o cuasi-estacionario
(esto es, la concentración intracelular de cada
metabolito, y consecuentemente el flujo asociado al mismo, debe
ser constante mientras dure el experimento). Estas condiciones
pueden ser fácilmente establecidas en un cultivo continuo
que ha alcanzado el estado de equilibrio estacionario y, con
ciertas restricciones, durante la fase exponencial de un cultivo
en lote o en un cultivo en lote alimentado (esto es, fed-batch)
si la variación en el flujo de alimentación durante
el experimento

es pequeña. Para cualquiera de estas condiciones
de equilibrio estacionario, la suma de los flujos "de entrada"
para cada metabolito iguala a la suma de los flujos "de salida"
(en otras palabras, no existe acumulación neta del
metabolito). Esta situación puede describirse
matemáticamente con una única ecuación
lineal para cada metabolito considerado, procedimiento que
colectivamente se denomina balance de masas. La Fig. 1a
ilustra este concepto a partir de una red bioquímica
sencilla, en donde puede observarse que existen flujos
intracelulares y extracelulares.

Fig. 1. Ejemplo de un diagrama de flujos para una
red bioquímica sencilla. a) Los flujos u, r, y p pueden
ser determinados directamente mediante la estimación de la
velocidad de consumo de sustrato y de producción de
metabolitos extracelulares, respectivamente. A partir de la
medición de al menos dos de estos flujos puede deducirse
el valor de todos los flujos restantes. b) Para el AFM basado en
marcación isotópica es necesario conocer el destino
de cada uno de los átomos de carbono en los metabolitos de
la red considerada con el objetivo de determinar el
enriquecimiento posicional en el isótopo considerado
(e.g., 13C).

En este caso, asumiendo que el sistema se encuentra en
estado de equilibrio estacionario, se obtiene el siguiente
conjunto de relaciones lineales:

u = q + v v = w w = p p + q = r + v

Es decir, existen cuatro relaciones lineales para seis
variables de flujo. Esto significa que todos los patrones
de flujo posibles en esta red bioquímica forman un
sub-espacio bidimensional (lineal) dentro del espacio
hexadimensional que forman las seis variables de flujo. Dado que
en la mayoría de los casos prácticos la
medición directa de los flujos intracelulares no es
posible, normalmente se utilizan modelos matemáticos que
permiten inferir dichos flujos intracelulares a partir de otros
que pueden ser medidos con mayor facilidad. De esta manera, si se
pudiesen medir directamente al menos dos de los seis flujos
considerados en el ejemplo de la Fig. 1a, el sistema de
ecuaciones se convertiría en un sistema determinado (en
cuyo caso se puede deducir el valor de los seis flujos a partir
de la medición de dos de ellos). Los flujos extracelulares
(ejemplo: velocidad de consumo de sustrato, velocidad de
síntesis de metabolitos extracelulares, evolución
de CO2, etc.) usualmente se utilizan como datos para el
cálculo de todos los flujos restantes. Para el ejemplo que
se está analizando, supongamos que se pueden medir los
flujos extracelulares u y r. Entonces,

v = u – r w = u – r p = u – r q =
r

El resultado final es un mapa de flujos
metabólicos que representa gráficamente cada una de
las reacciones bioquímicas incluidas en el modelo junto a
una estimación de la velocidad en condiciones de estado
estacionario (viz., flujo) a la cual cada reacción tiene
lugar. Este procedimiento sencillo condujo a la primera
publicación, a principio de los años 90,
describiendo el metabolismo central de Corynebacterium glutamicum
(36), una bacteria tradicionalmente utilizada para la
obtención industrial de aminoácidos.

Experimentos de
marcación isotópica

A pesar de la relativa sencillez de su
implementación, desafortunadamente existen numerosas
limitaciones para la interpretación estrictamente
estequiométrica de los flujos metabólicos en un
microorganismo. Algunas de ellas son:

a) existencia de vías metabólicas
paralelas, que conducen al mismo metabolito pero utilizando
(iso)enzimas e intermediarios diferentes. Un caso típico
es la presencia de dos vías enzimáticas
independientes para la síntesis de lisina por C.
glutamicum (15),

b) presencia de ciclos metabólicos en los cuales
no se puede medir directamente al menos un flujo interno en el
ciclo,

c) existencia de vías metabólicas
bidireccionales que operan al mismo tiempo en ambos sentidos.
Este es el caso para la enorme mayoría de las reacciones
bioquímicas de una célula. De hecho, solamente
pueden considerarse como unidireccionales aquellas reacciones
cuya reversibilidad esté fuertemente impedida desde el
punto de vista termodinámico. Un ejemplo particular de
esta situación es el caso de las reacciones altamente
reversibles catalizadas por las enzimas transaldolasa y
transcetolasa en la vía de pentosas fosfato, y

d) dificultades en el balance de co-factores. En una red
metabólica típica, que normalmente consta de la
vía glicolítica de Embden-Meyerhof-Parnas,
vía de pentosas fosfato, ciclo de ácidos
tricarboxílicos, y reacciones anapleróticas,
solamente se pueden determinar estequiométricamente los
flujos asumiendo que la síntesis y el consumo de
metabolitos asociados al balance energético y balance
redox (e.g., ATP, ADP, NADH, NAD+, etc.) se encuentran
perfectamente balanceados. Sin embargo, la evidencia experimental
sugiere que existen numerosos ciclos fútiles, y que la
conversión energética de equivalentes de
reducción, como NADH y NADPH, a ATP no es constante
incluso para el mismo microorganismo en condiciones de cultivo
similares (26).

Estas limitaciones pueden ser evitadas, al menos
parcialmente, utilizado un sustrato isotópicamente marcado
para el experimento de AFM, tal como 13C- o 14C-glucosa. La
utilización de 14C-glucosa se implementó en AFM en
los años 80 (3), pero pronto fue desplazada por
estrategias de marcación isotópica no radioactiva
en lo que genéricamente se denomina experimentos de
marcación con carbono. En este tipo de experimentos,
el sistema biológico se alimenta con el sustrato marcado,
y los átomos de éste se distribuyen entre los
metabolitos de la red bioquímica hasta que en condiciones
de equilibrio estacionario los átomos de 13C/14C se
encuentran en estado de equilibrio isotópico (17). En este
punto, el enriquecimiento isotópico de cada uno de los
metabolitos en la red puede determinarse empleando
técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) (31)
o espectrometría de masas (EM) (5, 7, 44). El proceso
descripto permite la identificación de cada uno de los
metabolitos en la red y evita la mayoría de las
complicaciones asociadas al análisis puramente
estequiométrico dado que se conoce el destino de las
moléculas marcadas y se puede seguir su "trayectoria"
intra y extracelular. En el contexto de este tipo de
análisis surgen algunos términos
específicamente asociados a los experimentos de
marcación con carbono en los que se basa la técnica
de 13C-AFM. Por ejemplo, isotopómero es un
término derivado de isótopo e isómero, e
identifica a cada uno de los posibles estados de marcación
en los que puede encontrarse una molécula de un
determinado metabolito. Dado que un metabolito que contiene n
átomos de carbono podrá contener un isótopo
o un átomo en su estado isotópico natural en cada
posición, el número de isotopómeros para ese
metabolito está dado por 2n.

Uno de los requerimientos más importantes para la
implementación de 13C-AFM es que se debe conocer
exactamente el destino de cada uno de los átomos de
carbono dentro de los metabolitos de la red considerada (41). La
Fig. 1b ilustra esta situación para la red
bioquímica sencilla considerada anteriormente. En este
esquema puede apreciarse la complejidad de la transición
entre los átomos de carbono en cada metabolito. A partir
de esta red de transición de átomos de carbono se
puede deducir la red de isotopómeros esperada. Esta red
indica cómo los isotopómeros reaccionan entre
sí dando lugar a nuevos metabolitos marcados.

Si bien existen numerosas metodologías para
asociar la presencia de isotopómeros y la
distribución de metabolitos dentro de la red
bioquímica en estudio, la medición de metabolitos
marcados normalmente se realiza utilizando cromatografía
de gases (CG) acoplada a EM (5, 10). Dentro del conjunto de las
numerosas biomoléculas que proveen información
acerca del estado isotópico de intermediarios
metabólicos, usualmente se utilizan los aminoácidos
proteinogénicos. Esto implica que después de
someter a la biomasa a hidrólisis ácida completa,
los aminoácidos componentes de la misma deben ser
derivatizados para convertirlos en moléculas
volátiles y permitir su separación por CG (7). Los
compuestos que se eluyen de la columna del cromatógrafo
son ionizados, lo cual genera fragmentos con diferentes
relaciones m/z (masa/carga). Esta técnica es
particularmente importante dado que no solamente puede
determinarse la masa de los isotopómeros del ion molecular
si no que además se analiza el espectro de masas de
diferentes fragmentos del mismo isotopómero, lo cual
aumenta y diversifica la información disponible acerca del
metabolito analizado. Es preciso notar aquí que existen
varias técnicas alternativas para la determinación
de isotopómeros; como 1H-RMN y 13C-RMN,
cromatografía líquida (CL) acoplada a EM, o
MALDI-TOF* acoplado a EM (43).

* MALDI-TOF es una técnica de ionización
suave utilizada en espectrometría de masas. Se denomina
MALDI por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization (desorción/ionización
láser asistida por matriz) y TOF por el detector de iones
que se acopla al MALDI y cuyo nombre procede también de
sus siglas en inglés Time-Of-Flight.

Evaluación
in silico de experimentos de marcación isotópica y
construcción del mapa de flujos

A pesar de que el análisis de la
distribución de isotopómeros utilizando modelos
matemáticos es una metodología sumamente compleja,
es necesario conocer los lineamientos generales en los que se
fundamenta para comprender la forma en la que se evalúan
los experimentos de marcación con carbono.
Básicamente, la interpretación de los resultados se
basa en simulaciones matemáticas (32). En una
simulación de este tipo, en cada iteración se asume
que se conocen los valores para los flujos en la red
bioquímica estudiada. A partir de un conjunto limitado de
flujos "libres" (a los cuales se les asigna un valor arbitrario)
y de la composición isotópica del sustrato
carbonado se puede reconstruir la distribución de
isotopómeros de cada metabolito en el estado de equilibrio
estacionario. Para ello, el modelo matemático utilizado
para correlacionar la distribución de isotopómeros
y los flujos intracelulares contiene una ecuación
(normalmente, no lineal) para cada uno de los isotopómeros
en el sistema. Por lo tanto, para una red bioquímica
"mediana" que incluya solamente las vías
metabólicas centrales, se tiene un sistema de alrededor de
1000 ecuaciones no lineales. La dimensión del sistema se
relaciona con el hecho de que ciertas moléculas pueden
tener numerosos isotopómeros derivados. Por ejemplo,
solamente la molécula de corismato* tiene 210 = 1024
isotopómeros asociados. Esto hace que los procesos de
análisis isotopomérico y evaluación de
flujos metabólicos requieran de herramientas
informáticas adecuadas para el manejo de tal cantidad de
datos y variables. Generalmente, los programas
informáticos utilizados para la interpretación in
silico de flujos metabólicos se basan en operaciones
algebraicas con matrices (35).

*(Ácido corísmico) Es un intermedio clave
en la síntesis del triptófano, la fenilalanina y la
tirosina, es decir, en la síntesis de ácidos
aromáticos, siendo el primer punto de ramificación,
con una rama que conduce a triptófano, otra que conduce a
la fenilalanina y otra a la tirosina.

Una vez establecido un procedimiento para la
simulación de la marcación isotópica, la
estrategia para la determinación y evaluación de
flujos (Fig. 2) normalmente incluye los siguientes
pasos:

a) asignación arbitraria de algunos valores de
flujos al sistema de modo tal que se cumplan las restricciones
estequiométricas de las reacciones bioquímicas del
modelo,

b) simulación de la distribución
isotópica de los metabolitos en la red bioquímica,
la cual debe estar de acuerdo con las restricciones
estequiométricas mencionadas en a),

c) comparación del patrón de
marcación isotópica y los valores de flujo
obtenidos durante la simulación con los valores
experimentales obtenidos por CG-EM,

d) repetición iterativa del procedimiento a
través de un algoritmo de optimización apropiado
(42), de modo tal que la diferencia entre la distribución
in silico y la distribución experimental sea
mínima, y

e) análisis estadístico de los resultados,
en virtud de que la propagación de errores de los
parámetros biológicos observables (e.g.,
distribución isotópica, flujos extracelulares,
evolución de CO2, etc.) al mapa de flujos puede originar
resultados precisos pero estadísticamente erróneos
o inválidos (37).

Fig. 2. Esquema del procedimiento para la
obtención del mapa de flujos metabólicos a partir
de experimentos de marcación con carbono seguidos de
integración in silico de los datos experimentales. En cada
iteración, el patrón espectroscópico de
fragmentos de isotopómeros generado a partir de un
conjunto de flujos cuyos valores se asignan arbitrariamente se
compara con los valores experimentales. La secuencia de
iteraciones se repite hasta minimizar la diferencia entre ambos
conjuntos de valores. CG-EM, cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masa.

Para ilustrar la importancia de la
determinación de flujos metabólicos por
marcación con sustratos isotópicos, consideremos la
secuencia metabólica sencilla que muestra la
Fig.

3a. En esta red, el metabolito A es utilizado
como sustrato por dos vías enzimáticas que operan
con velocidades netas v1 y v2. Si pudiese medirse la velocidad de
consumo de A y la velocidad de secreción de
F y G (asumiendo que estos metabolitos fuesen
excretados al medio extracelular), se podría analizar la
distribución de flujos en los puntos de
ramificación a nivel de los metabolitos D y
H, y se podría derivar matemáticamente la
velocidad de síntesis del metabolito K. Sin
embargo, no sería posible estudiar la distribución
de flujos en el ciclo metabólico A ? B ?
C ? A (esto es: no se pueden conocer los valores de
v1 y v2). Por otra parte, si la reacción que convierte a
C en D consta de más de un paso
enzimático, la distribución de intermediarios de la
vía no podría conocerse y necesariamente se
debería simplificar la secuencia de reacciones a la forma
C ? 2D. Finalmente, y tal como lo ilustra la Fig. 3a, la
conversión de A en C es reversible y no
podría deducirse el grado de reversibilidad de la
reacción a partir de AFM
estequiométrico.

Fig. 3. Ejemplo hipotético de una red
bioquímica sencilla incluyendo rutas enzimáticas
lineales y ramificadas. a) La determinación de la
velocidad de consumo del metabolito A y las velocidades de
síntesis de los metabolitos F y G permite
estimar los flujos para los metabolitos D, H, y
K; pero no distingue los flujos en el ciclo
metabólico caracterizado por v1 y v2. b) En un estudio de
AFM basado en marcación isotópica el
enriquecimiento posicional en el metabolito C permite
distinguir si éste provino de A o B, y
consecuentemente puede estimarse la contribución relativa
de v1 y v2 a la velocidad de síntesis de C. Una
situación análoga se verifica para los metabolitos
D y F.

Consideremos ahora el estudio de la misma
red bioquímica utilizando un sustrato
isotópicamente marcado (Fig. 3b). En este caso, puede
observarse que las reacciones bioquímicas en la red
generan asimetrías en la distribución de
átomos de carbono. Dichas asimetrías pueden
deducirse del análisis de isotopómeros y, por lo
tanto, los metabolitos intermediarios pueden distinguirse unos de
otros incluso cuando conduzcan a la formación de un
único metabolito final. En el ejemplo de la figura, el
metabolito A es una molécula de seis átomos
de carbono cuya primera posición está ocupada por
un átomo de 13C. La primera reacción, representada
por el flujo v1, consiste en una decarboxilación que
origina una molécula del metabolito B sin marca
isotópica. De esta manera, el patrón de
marcación de la molécula C dependerá
de si ésta se originó a partir de A (a
través del flujo v1, en cuyo caso se obtiene una
molécula marcada) o a partir de B (a través
del flujo v2, en cuyo caso la molécula no contiene
isótopos). De esta manera, el enriquecimiento
isotópico del metabolito C (es decir, la cantidad
de moléculas marcadas respecto de las que no contienen
átomos de 13C) será directamente proporcional al
cociente v2/v1. Esta relación también es cierta
para los metabolitos D y F. El grado de
enriquecimiento en 13C en la primera posición del
metabolito F (el cual, como se dijo, puede medirse en el
medio extracelular) provee información acerca de la
velocidad relativa del flujo v2 y, en conjunción con otras
mediciones de flujos y análisis estequiométrico,
permite distinguir entre v1 y v2. Aunque arbitrario, este ejemplo
esquemático guarda similitud con el catabolismo de una
hexosa a través de la vía glicolítica de
Embden-Meyerhof-Parnas (que, en el ejemplo, estaría
asociada al flujo caracterizado por v2) y la rama oxidativa de la
vía de pentosas fosfato (en el ejemplo, representada por
el flujo v1).

Aplicación
del análisis de flujos metabólicos en la
selección y construcción de fenotipos de relevancia
en Biotecnología

Los enfoques clásicos para la obtención de
fenotipos industriales han evolucionado constantemente hacia la
utilización de estrategias más sistemáticas.
Tradicionalmente, el fenotipo de los microorganismos utilizados
en bioprocesos industriales fue consecuencia de un programa de
desarrollo que típicamente incluye varios ciclos de
mutagénesis al azar y selección, lo cual
lógicamente trae aparejados cambios a nivel molecular y
celular que no pueden ser predichos con exactitud (29). De hecho,
en la mayoría de los casos se desconoce la naturaleza de
las mutaciones introducidas. Con el advenimiento de las
metodologías y técnicas de Ingeniería
Metabólica, a través del conocimiento de la
arquitectura genómica, las vías metabólicas
pudieron ser convenientemente amplificadas, suprimidas, o
moduladas basándose en la información derivada de
la red metabólica del microorganismo (16, 35). A pesar de
que se trata de un proceso sistemático, este tipo de
enfoque normalmente está limitado a modificaciones
"locales" más que a la comprensión global del
metabolismo microbiano. Si bien el nivel de expresión de
ciertos genes y la concentración intracelular de
proteínas y metabolitos proveen información
importante acerca del comportamiento de la red metabólica
en estudio, existen limitaciones inherentes a esta
metodología para la descripción del fenotipo
celular debido a la falta de información que integre estos
parámetros y los correlacione para una comprensión
holística del metabolismo. Además, en la
mayoría de los casos se ignora el bioproceso in toto, es
decir, desde el diseño, construcción, y mejora de
la cepa hasta el cultivo de la misma en un
biorreactor.

Según se mencionó anteriormente, los
flujos metabólicos pueden considerarse como una forma de
representar el fenotipo de una célula como resultado de la
interacción entre varios componentes celulares; los flujos
observados reflejan las consecuencias conjuntas de los procesos
de transcripción, traducción, y actividad
enzimática, además de los (a menudo complejos)
procesos regulatorios que los controlan. En otras palabras, se
considera el sistema como un todo, y no sus partes constituyentes
en forma individual. En forma aislada, cada flujo
metabólico provee el grado de participación de la
enzima o vía metabólica en estudio en funciones
celulares y procesos metabólicos. De esta manera, en un
ensayo de AFM se cuenta con información de los componentes
individuales del metabolismo, pero dicha información puede
ser integrada para la comprensión del metaboloma
(ejemplo: el conjunto de flujos metabólicos del
microorganismo en una condición determinada).
Consecuentemente, la cuantificación de estos flujos in
vivo es de especial importancia en el contexto de la
fisiología celular para implementar estrategias efectivas
de Ingeniería Metabólica (6), disciplina para la
cual uno de los objetivos principales consiste en maximizar la
conversión de un sustrato en un determinado producto (35).
En la actualidad, el tiempo necesario para implementar un AFM
completo disminuyó considerablemente gracias al desarrollo
de metodologías de medición isotópica
novedosas así como a la utilización de plataformas
informáticas potentes.

Como ejemplo de aplicación, en la Fig. 4 se
muestra un mapa de flujos metabólicos obtenido para la
levadura Saccharomyces cerevisiae en condiciones
anaeróbicas de cultivo. La información provista por
este análisis sugiere que el principal destino de la
glucosa utilizada como sustrato carbonado es la
decarboxilación reductiva que transforma el piruvato en
acetaldehído y posteriormente en etanol. El diseño
de cepas etanologénicas de S. cerevisiae hizo uso
extensivo de la información provista por este AFM, ya que
permitió el re- direccionamiento racional de algunas
vías competitivas a la síntesis de etanol (viz.,
generación de precursores de biomasa) hacia la
obtención del producto de interés, aumentando
considerablemente el rendimiento de producto en sustrato
(39).

Fig. 4. Representación
gráfica de los resultados de un ensayo de 13C-AFM
realizado en cultivos anaeróbicos de Saccharomyces
cerevisiae. El sustrato carbonado utilizado fue una mezcla de 13C
-glucosa (uniformemente marcada), 13C -glucosa (marcada en la
posición C ), y U 1 1 glucosa no marcada. Para simplificar
la visualización de los resultados, en muchos casos los
flujos se representan como una fracción de la velocidad de
consumo de sustrato (en este ejemplo, 0,033 C-mol de glucosa
· g biomasa-1 · h-1). Para ello, se asigna
arbitrariamente a este parámetro el valor de 100 y los
flujos restantes toman valores porcentuales relativos respecto al
consumo de sustrato. Obsérvese que el AFM permite
explicitar la compartimentalización de las reacciones
bioquímicas consideradas. Datos tomados de Nissen et al.
(28).

En los últimos años se ha empleado el AFM
como herramienta para el diseño y análisis de
fenotipos industriales con frecuencia cada vez mayor y, de hecho,
se ha sugerido que virtualmente cualquier metabolito en el
metabolismo microbiano puede ser producido en forma eficiente si
se manipulan los flujos metabólicos centrales en la forma
adecuada. De acuerdo con este objetivo general, pueden
distinguirse dos tipos de enfoque:

a) estudios en los cuales el AFM se utiliza para
estudiar el metabolismo celular en condiciones compatibles con un
bioproceso para el desarrollo de estrategias adecuadas para el
crecimiento del microorganismo y producción de metabolitos
de interés biotecnológico, y

b) utilización de AFM, llevados a cabo en
condiciones estándar de cultivo, para identificar
vías metabólicas cuya manipulación
podría resultar ventajosa para la obtención de un
fenotipo industrial.

Algunos de los ejemplos más relevantes
disponibles en la lbibliografía se muestran en la Tabla 1.
Estos ejemplos corresponden al primero de los dos tipos de
enfoque recién discutidos. Al mismo tiempo, existen
numerosos ejemplos dentro de la segunda categoría de
ensayos para AFM, en particular en relación a la
manipulación de reguladores globales de la
expresión génica en E. coli como herramienta
relevante en Biotecnología (27, 30, 47).

Tabla 1_ Algunos ejemplos de Ia aplicación de
AFMa para Ia evaluación de fenotipos microbianos asociados
a bioprocesos de interes industrial.

a Las abreviaturas utilizadas son: AFM, análisis
de flujos metabólicos; CL, cromatografía
líquida; EM, espectrometría de masas; RMN,
resonancia magnética nuclear.

Conclusión
y perspectivas

En un futuro, probablemente cercano, la
integración de las tecnologías disponibles para el
análisis del comportamiento metabólico, incluyendo
13C-AFM, permitirá la comprensión de la
dinámica celular in vivo y conducirán al desarrollo
eficaz y racional de bioprocesos industriales.

En la actualidad estas metodologías están
comenzando a ser utilizadas durante el desarrollo de procesos
biotecnológicos con frecuencia cada vez mayor, pero
aún así se recurre usualmente a las técnicas
clásicas de mejora y selección para la
mayoría de los protocolos de obtención de fenotipos
industriales. Un desarrollo prometedor, ligado al advenimiento de
metodologías de detección de metabolitos de alta
sensibilidad y herramientas informáticas poderosas, es el
AFM en tiempo real; esto es, durante el bioproceso. La
elucidación de la distribución de flujos
metabólicos in situ permitiría tomar acciones
correctivas del bioproceso e indudablemente conduciría a
una notable mejora del mismo. Por ejemplo, Soga (34) ha descripto
la utilización de electroforesis capilar acoplada a EM
para la detección simultánea y en tiempo real de
más de 1000 metabolitos cargados. Otros aspectos en los
cuales la introducción de mejoras en el análisis
del metaboloma permitiría una mejor comprensión y/o
el desarrollo efectivo de bioprocesos son:

a) AFM en células eucariotas (libres y en
tejidos). Debido a la compartimentalización inherente a
este tipo de células, el análisis de
isotopómeros e integración matemática de los
resultados se vuelven considerablemente más complejos. Por
ejemplo, el oxaloacetato es un metabolito que se encuentra
simultáneamente en la matriz mitocondrial y en el citosol
en concentraciones distintas, y el patrón de
marcación isotópica como única herramienta
de estudio no permite discernir la localización
sub-celular de este metabolito. Asimismo, en un cultivo de
células de mamífero, las velocidades de crecimiento
son tan bajas que la cuantificación de flujos
metabólicos posee asociada importantes errores.

b) estudios poblacionales mediante AFM. Es un hecho
conocido y ampliamente descripto que aún en un cultivo
continuo que ha alcanzado condiciones de equilibrio
dinámico existe más de una población
metabólicamente identificable. En la mayoría de los
casos, la existencia de sub- poblaciones no altera
significativamente los resultados del análisis, pero si el
equilibrio poblacional se relaciona con un fenotipo de
interés industrial (e.g., pérdida de la capacidad
de sintetizar un metabolito, o enriquecimiento del cultivo en
células con mutaciones adaptativas, etc.) sería
particularmente necesario distinguir entre las poblaciones
presentes en el cultivo. Esta distinción requiere del
desarrollo de técnicas que permitan el estudio de flujos
metabólicos a nivel de células aisladas.

c) medición de metabolitos intracelulares y
estimación de flujos independiente del análisis
retrobiosintético, en el cual se basa la
metodología de AFM. Como se mencionó anteriormente,
los flujos metabólicos en un ensayo de 13C-AFM se deducen
a partir de la presencia y abundancia de metabolitos marcados
utilizando metodologías basadas en simulaciones in silico.
Esto, por definición, implica la existencia de errores
asociados al método de análisis, cuya magnitud
podría ser reducida si la concentración
intracelular de al menos algunos metabolitos en la red
bioquímica pudiese ser directamente determinada in vivo
sin alterar el metabolismo celular.

Por lo tanto, puede concluirse que la
implementación de 13C-AFM como herramienta de
análisis y control de bioprocesos se encuentra actualmente
en un estadío temprano de desarrollo y es altamente
plausible de ser mejorada y adaptada a los requerimientos de cada
proceso en particular.

Agradecimientos

Agradezco muy especialmente a mis directores, Dr. Miguel
A. Galvagno y Dra. Beatriz S. Méndez, por su constante
apoyo y estimulación. Asimismo, agradezco al Dr. George N.
Bennett, Dr. Jiangfeng Zhu, y Dr. Ka-Yiu San (Departamento de
Bioquímica y Biología Celular, y Departamento de
Bioingeniería; Rice University, Houston, Texas) por
haberme ofrecido la posibilidad de trabajar en un laboratorio
líder en el análisis de flujos metabólicos;
y al Consejo de Investigaciones Científicas y
Técnicas (Argentina) y la American Society for
Microbiology (EE.UU.) por el apoyo económico brindado
durante mi estadía en Rice University.

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