Detección de Escherichia Coli en cárnicos y lácteos mediante el uso de métodos rápidos

Resumen:

La especie Escherichia Coli es considerada
generalmente como integrante de la flora del intestino es uno de
los géneros que integra el grupo coliforme, y se divide en
muchos biotipos (W. C. Frazier y D.C. Westhoff 1993) produciendo
en muchas ocasiones efectos patógenos de gravedad
(Granados P. y Villaverde P. 1997) causados principalmente por la
toxina Shiga (Marzocca M. A. et al 2006). El presente
trabajo se realiza con el objetivo de señalar los
métodos rápidos para la identificación de
Escherichia Coli; así como las medidas
preventivas para evitar el contagio ocasionado por la toxina que
contiene esta bacteria. Analizando cárnicos y productos
lácticos en productos de venta artesanales en la sierra
Norte de Puebla.

1. Generalidades
de Escherichia Coli.

La especie Escherichia Coli es considerada
generalmente como integrante de la flora del intestino es uno de
los géneros que integra el grupo coliforme, y se divide en
muchos biotipos (W. C. Frazier y D.C. Westhoff 1993)
filogenéticamente es un grupo relativamente
homogéneo dentro del grupo gama de las proteobacterias y
se caracteriza por: bacilos Gram negativos no esporulados,
inmóviles, o móviles, por flagelación
peritrica (Madigan M. T. et al 1999); son
Enterobacterias que corresponden a la familia de bacilos o
cocobacilos aerobios o anaerobios facultativos ( Granados P. y
Villaverde P. 1997).

1.1 Ciclos
Biológicos.

Las bacterias son microorganismos unicelulares muy
pequeños constituidos por elementos obligados
(indispensables para la vida de la bacteria como la pared
celular, membrana plasmática, citoplasma, ribosomas y la
región nuclear) y elementos facultativos los cuales pueden
o no estar en la bacteria (capsula, flagelos, pelos, endosporas e
inclusiones citoplasmicas) (Madigan M. t. et al 1999).
En cuanto a las enterobacterias se caracterizan por ser
fermentadoras de glucosa, suelen ser huéspedes habituales
del tracto intestinal produciendo en muchas ocasiones efectos
patógenos de gravedad (Granados P. y Villaverde P.
1997).

1.2 Ecología.

Los miembros correspondientes a este género son
habitantes casi universales del tracto intestinal de humanos y
animales (Madigan M. t. et al 1999), desempeñan
en el caso de las bacterias inocuas ayudan en la síntesis
de vitaminas. En el caso de las entero patógenas
productoras de la toxina shiga son causantes asociadas de
enfermedades transmitidas por alimentos (Marzocca M. A. et
al 2006).

1.3 Patología.

Como se menciono con anterioridad existen distintas
clases de E. Coli algunos son inocuos y otros
enteropatógenos (Franco U. lima et al 2001) en 1993 se
detecto el primer brote en estados Unidos el cual Provocó
700 enfermos y 4 muertos; causando pérdidas millonarias
esto a consecuencia del consumo de hamburguesas poco cosidas que
contenían una variedad de E. Coli (0157:H7)
(Silvia M. 2003). En este mismo país se ha estado
estimando que las infecciones por esta bacteria suman 20mil casos
de enfermos y

250 muertes anuales, las infección se deben
principalmente por el consumo de carne y derivados de la
industria láctea no pasteurizada (M.L. Roldan et al 2007)
E. Martínez señala que los bivalvos representan uno
de los alimentos de mayor consumo en el mundo estos son capaces
de acumular materiales del ambiente y por esta razón
constituye un riesgo para la salud (E. Martínez
2005).

La expresión de enfermedades a consecuencia de
E. Coli puede ser leve o severa y se presenta
regularmente a los 8 días del ingreso de la bacteria
siendo los niños el grupo más vulnerable. La toxina
de esta bacteria causa diarreas acuosas o casualmente con sangre,
dolores abdominales, nauseas, vomito y en ocasiones fiebre (S.
Michanie 2003).

Con el objetivo de señalar los métodos
rápidos para la identificación de Escherichia
Coli; así como la medidas preventivas para evitar el
contagio por dicha bacteria en la sierra Norte de Puebla
analizando Carne y lácticos en puntos de venta artesanales
en dicha zona.

2.
Materiales:

Pipetas estériles de 1ml con
algodón graso no absorbente. Tubos de ensayo.

Tapones de corcho estériles Placas
petri de 10 cm de diámetro

Caldo de bilis y verde brillante. Bolsas
estériles para homogeneización.

Asas de siembra. Balanza de
precisión. Estufa a 37°C.

Agua de peptona tamponada

(BPW) estéril. Stomatcher. Kit de
APIS. Kit Simplate.

3.
Metodología:

3.1. Elaboración de medio de
cultivo.

Para la identificación de Escherichia
Coli se recomienda usar caldo de bilis y verde Brillante
(R.Granados y C. Villaverde 2002) este medio se es indicado para
la investigación de coliformes en la leche y otros
alimentos la presencia de este microorganismo como se menciono
anteriormente se debe al mal funcionamiento de algún
proceso, tras su inoculación e incubación a
37°C deberá permanecer en estufa de cultivo al menos
24 horas.

El método utilizado para elaborar este medio de
cultivo corresponde a las especificaciones del proveedor de igual
manera si se prefiere existen en el mercado cajas petris con el
medio de cultivo Caldo de bilis y verde brillante.

La eficiencia de este medio de cultivo para detectar
coliformes se debe a que el caldo de bilis y verde brillante
inhibe el crecimiento de Gram + y muchas Gram-. La
aparición de gas en el medio antes de 48 horas indica que
ha fermentado la lactosa y, por tanto, la presencia de
coliformes.

3.2 toma de muestras.

Colocar en bolsas estériles la muestra del
alimento (carne o leche) la toma de muestra debe realizarse en
condiciones asépticas utilizando cubiertos y bolsas
estériles especiales para homogeneizador esterilizadas (C.
Gamazo et al 2005) y se le coloca una etiqueta que
contenga el nombre de la muestra, lugar en donde se tomo, la
fecha y hora de recolección; así como el nombre de
la persona que tomo la muestra, esto con el objetivo de poder
aislar e identificar si existe riesgo en la
producción.

Posteriormente las muestras se llevan al laboratorio
para la siembra. En esta etapa deben llevarse las muestras en una
hielera con una temperatura menor a los 4°C para evitar el
posible desarrollo de otros microorganismos.

3.3 Preparación de soluciones y
siembra.

Este proceso debe realizarse en condiciones de asepsia y
utilizando material y equipo de laboratorio esterilizado a mas
de

120° C en autoclave durante 25 minutos (W. C.
Frazier y D.C. Westhoff 1993). En la mesa de trabajo deben
colocarse tres mecheros formando un triangulo para tener un campo
estéril en este campo se deben realizar todos los
procesos.

3.4 Homogeneizado.

Se puede utilizar un homogeneizador comercial de paletas
para que la distribución de microorganismos en el medio
sea homogénea. En este punto de la muestra tomada se pesan
10 g y se añaden 90 ml de caldo de peptona estéril.
El triturado de la muestra debe ser por al menos 2 minutos (C.
Gamazo et al 2005).

3.4.1 preparación de la
solución

Salina al 85%. El método de empleado es el de
disoluciones decimales seriadas con posterior siembra del inoculo
de cada dilución en los medios de cultivo:

3.4.2 Disoluciones

Colocar en los tubos de ensayo

9ml de agua peptona da y enumerar los tubos;
posteriormente colocar en el tubo de ensayo 1 un mililitro de la
muestra, luego entonces tomar un mililitro de la muestra 1 y
colocarlo en el tubo 2; después tomar un mililitro del
tubo 2 en el tubo 3 tal como lo muestra la imagen (…),
cada dilución debe realizarse con pipetas diferentes y
estériles. Tantas como se quieran, sembrándose en
el medio las de las ultimas diluciones.

3.5 Siembra.

Técnicas de los cuatro cuadrantes. Con un
marcador se marca en el reverso de la caja petri (con el medio de
cultivo previamente elaborado) se dibujan dos líneas
perpendiculares de tal forma que queden cuatro cuadrantes
iguales. Posteriormente tomar el asa estéril una cantidad
de inoculo de los tubos de ensayo del paso anterior y se
adicionara en uno de los extremos de los cuadrantes
extendiéndose en forma de zigzag se realiza la misma
operación en los demás cuadrantes sin flamear se
tapa la caja petri y se incuba a

37°C en estufa de cultivo al menos 24 horas para la
lectura de los resultados.

4. Otros
métodos rápidos para la identificación de
Escherichia Coli.

4.1. Uso de Las APIS:

Para conocer si E. Coli se encuentra en el
medio se recomienda realizar la prueba del sistema en tiras (API)
estas pruebas se comercializan en Kits (R. Granados, C.
Villaverde 2002); los medios deshidratados se encuentran
contenidos en microtubos mediante una suspensión
bacteriana y luego se cultivan Mas tarde se incuban y en este
proceso de metabolismo del microorganismo genera cambios en el
medio de cultivo que se aprecia con un cambio de color de este o
al añadir reactivos (Madigan M. t. et al 1999).
Estos cambios se interpretan mediante tablas de lectura o
mediante ordenadores. Después de la utilización de
este método el kit debe destruirse o
incinerarse.

4.2 Método
Simplate.

Simplate. Es un sistema de reactivos basados en
reacciones de Oxido-Reducción y/o enzimas múltiples
para detectar, cuantificar y analizar los microorganismos
objetivos en poco tiempo. Interpretándose solamente con
cambios de colores o fluorescencia.

Los 4 formatos existentes son:

? Cuenta total de mezofilos

? Coliformes totales y E.coli.

? Hongos y levaduras.

? Campylobacter

4.2.1 Forma de uso.

Mezclar la muestra y el medio de cultivo y colocar en el
dispositivo Simplate, posteriormente distribuir el medio e
incubar por 24 horas. Por último se lee el resultado con
base a lo establecido por las tablas que contenga el kit del
proveedor. Las ventajas de este método es que ayuda en la
identificación de hongos y bacterias indicadoras de
contaminación en poco tiempo además de que su uso
no requiere de gran equipo de laboratorio (biblio).

4.3 Agar Flurocult.

Para determinar si se encuentra
contaminación por Escherichia Coli

0157:H7 se recomienda ocupar el
método Agar Flurocult para E. Coli

0157:H7 (Franco U. lima et al

2001)

5
Conclusiones.

La presencia de organismos indicadores como E
.Coli es signo de que no se están tomando las medidas
higiénicas en algún proceso (Madigan M. t. et al
1999), lo cual causa enfermedades severas en la población
consumidora (Franco U. lima et al 2001) por esta
razón se mencionan las medidas que ayudan aprevenir y
controlar la presencia de microorganismos con toxinas que afectan
a los consumidores, entre las medidas se recomienda el uso de
equipos limpios y buenas prácticas higiénicas que
prevengan la contaminación así como el aumento de
la pasteurización y buena cocción de los alimentos,
ya que por ser una enterobacteria a altas temperaturas se elimina
(Silvia M. 2003).

Literatura
citada

1. C. Gamazo, I. López, R. Diaz, 2005 Manual
práctico de Microbiología, Ed. Elsevier Doyma,
Barcelona España, 231 pág.

2. Franco u.; lima; Vargas P.; Ximena; Mendoza L.;
Alberto; Bayona R.; Martin; Plaza; Ada. 2001,
determinación de Escherichia Coli 0157:H7 a
partir de productos Cárnicos y Lácteos artesanales
Empleando dos Sistemas de Aislamiento. Universitas scientarun,
vol. 6, núm. 1, enero- Junio, 2001, Pontificia,
Universidad Javeriana, Colombia.

3. Madigan M. T.; Martinko J.M.; Parker J. 1999, Brok
Biología de los Microorganismos, octava edición,
Prentice Hall Iberia, Madrid, 986 páginas.

4. Marzocca M. A.; Marucci P. L.; Sica M.G.;
Álvarez E.E. 2006, detección de Escherichia
Coli 0157: H7 en carne Picada Fresca y Hamburguesas
congeladas, Rev Argentina de microbiología, Vol. 38,
Núm. 1, Marzo 2006, pp. 38-40, Buenos Aires
Argentina.

5. R. Granados P. y M. C. Villaverde P.
2002, Microbiología tomo 2, Thompson, Madrid
España, 365 páginas.

6. R. Granados P. y M. C. Villaverde P.
1997, Microbiología tomo 1, Thomson, Madrid España,
323 páginas.

7. R.E. Martínez N. L.B. Villalobos B 2005,
Escherichia Coli enteropatógena en moluscos crudos y
cosidos, Rev Científica, Abril, año-Vol. XV, numero
002, Universidad del Zulia Maracaibo, Venezuela, pp.
163-167.

8. Roldan, M. L. Chinen, I.; Otero J. Li Miliwebski. E.
S.; Alfaro N.; Burns P.; Rivas M. 2007, Aislamiento,
caracterización y subtipificacion de cepas de
Escherichia Coli 0157:H7 a partir de productos
Cárnicos y leche, Rev Argentina de Microbiología
Vol. 39, Núm. 2, Junio 2007, pp. 113-119, buenos Aires
Argentina.

9. Silvia Michanie 2003, La Bacteria que
dispara el HACCP en la industria de la Carne, Énfasis
Alimentos, Año 1, núm. 3, Julio-Agosto, consultora
de Empresas en seguridad sanitaria de los alimentos.

10. W. C. Frazier; D. C. Westloff
1993 microbiología de los Alimentos, Ed. Acribia Zaragoza
España, 681 páginas.

Autor:

Rodolfo Aldana
Pérez

Licenciatura en
biotecnología

Universidad interserrana del estado de
Puebla Ahuacatlan.

Ahuacatlan Puebla México.