Caldo de Fermentación Con Células Proteínas
Intracelular Separación de Células Rompimiento
Celular Separación Material Intracelular Sobrenadante Sin
Células •Células inmovilizadas
•Células retenidas Precipitación Ácidos
Nucleicos, Proteasas Tratamiento de cuerpos incluidos
Concentración Purificación Alta Resolución
Refinamiento Permite •Altos niveles de pureza
•Estabilidad del producto
Membrana celular Estructura de la membrana celular La
características de las membranas nos permiten diferenciar
a las bacterias en 2 tipos: – Gram-negativas Como modelo se
utilizará un bacteria Gram-negativa, no tiene
núcleo y todo su material genético se encuentra en
una simple cadena de DNA, un ejemplo es la E.coli, ampliamente
utilizada como huésped en la mayoría de
proteína recombinantes. – Gram-positivas Entre ellas las
bacterias del tipo Bacillus.
Gram-negativas La estructura de una Gram-negativa involucra tres
capas : Membrana externa: 8nm de ancho, polímero que
contiene proteínas y lipopolisácaridos.
Peptidoglucano: Delgada capa de peptidoglucano. Espacio
periplasmático: 8 nm de ancho, donde a menudo se localizan
algunas enzimas.
Membrana plasmática : Compuesta de fosfolípidos,
pero contiene proteínas dispersas e iones
metálicos, estas moléculas de lípidos,
tienen dos partes una parte hidrofóbica y una
hidrofílica. La parte hidrofóbica o cola, a menudo
contiene dos grupos alquilos, y la parte hidrofílica o
cabeza a menudo tiene un grupo cargado, o un grupo alcohol. La
cola hidrofóbicas suelen agruparse con otros grupos
hidrofóbicos y las cabezas son expuestos al agua
Gram-positivas Gram-positivas involucra sólo dos capas :
•Peptidoglucano •Espacio periplasmático
•Membrana plasmática En el caso de las bacterias de
este tipo la capa de peptidoglucano presenta condiciones de mayor
resistencia que en bacterias gram- negativas, motivo por el cual
no resultan necesariamente más fáciles de
romper.
Funciones de las membranas Cada membrana tiene diferentes
funciones: La membrana externa y la capa de peptidoglucano
proporcionan la resistencia mecánica y su ruptura es lo
fundamental para la ruptura de células. La membrana
plasmática es muy débil y controla la permeabilidad
de la célula, lo que incluye el transporte de nutrientes
al interior de la célula y la exportación de
metabolitos “en el interior de las soluciones
circundantes”. El interior de la célula llamado
citoplasma, es una solución acuosa de sales,
azúcar, amino ácidos y biopolímeros. En los
biopolímeros se incluyen proteínas, muchas de ellas
enzimas, RNA y DNA.
Células Procariotes En los procariotes ocurre que las
proteínas se encuentran en solución, pero en muchos
procariotes modificados se sintetiza un exceso de
proteínas las cuales precipitan en el interior del
citoplasma (muchas veces éstas son las proteínas
que se desean recuperar). En algunos casos sólo se quiere
remover algunas de las capas para liberar alguna proteína
específica.
Células Eucariotes En el caso de las células
eucariotes, que poseen un núcleo y son estructuras
más complejas que las procariotes, tienen una membrana
alrededor de las células similar a las que tienen las
procariotes. La membrana de las eucariotes contiene organelos,
como las mitocondrias que son las responsables de la
respiración y los núcleos que contienen el DNA en
los cromosomas. Cada estructura está rodeada de una
membrana similar a la membrana celular interna de los
procariotes.
¿Cuándo se usa? ROMPIMIENTO DE CÉLULAS (
Cell Disruption) Los procesos de bio-separación se inician
con una separación de la biomasa desde el resto del
cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en el medio.
En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender
como sub-producto. Pero en otros casos el producto de
interés se encuentra en el interior de las células,
en particular la mayoría de las proteínas
producidas por manipulación genética de bacterias
que no segregan las proteína al medio, pero que son
precipitadas en el interior de la células en forma de
cuerpos incluidos (“inclusion bodies”) . Se trata de
proteínas intracelulares.
Procesos y Equipos La liberación de las proteínas
intracelulares involucra la ruptura o permeabilización de
la pared celular. Los equipos involucrados en esta etapa no han
sido diseñados especialmente para el área
biotecnológica sino que son prestadas de otras
áreas (área de alimentos, de pinturas y pigmentos).
Este rompimiento o permeabilización se puede llevar a cabo
por dos métodos: •Métodos No- Mecánicos
•Métodos Mecánicos
La selección de una u otra técnica dependerá
las características del producto que se desea purificar,
tales como: •Resistencia a: • Medios alcalinos. •
Solventes. • Detergentes. • Enzimas. •
Temperatura. • Esfuerzo de corte. La técnica
utilizada determinará el tamaño de los desechos que
se producirán.
Métodos No-Mecánicos Pueden ser de dos tipos:
•Agente químicos •Solventes orgánicos
• Detergentes • Alcalis • Agua (shock
osmótico) •Enzimáticos se trata de enzimas que
permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales
como lisozima, glucanasas, mananasas, etc. Los métodos
no-mecánicos son fáciles de escalar, si uno
necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta
con adicionar 10 veces más reactivo químico o
enzimático.
Métodos No-mecánicos Técnicas Permeabili-
zación Enzimático Principios
Permeabilización de la pared celular, lo cual produce el
rompimiento de la Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento
de M. lysodeikticus con lisozima. célula Shock
Osmótico Solubiliza- ción Ruptura Osmótica
de la membrana Disolución de la membrana celular Suave
Suave Barato Moderada- mente Caro Ruptura de Células de
Glóbulos Rojos. Rompimiento de bacterias con con
detergentes SDS. Disolución de Lípidos Solventes
orgánicos que disuelve la pared celular y también
la Modera do Barato Rompimiento de levaduras desestabilizan con
tolueno. Tratamien- to con álcalis Solubilización
de la membrana por saponificación de los lípidos
Fuerte Barato
de Métodos Mecánicos El rompimiento se lleva a cabo
por acción mecánica, pudiendo ser: •
Fricción • Efecto de la presión •
Colisiones. Estos métodos incluyen las operaciones
unitarias ultrasonido, homogenización , molinos de bolas,
etc. Estos métodos resultan ser agresivos con las
proteínas de interés, debido principalmente a la
generación de calor. Adicionalmente, el escalamiento
resultan ser un problema significativo.
Métodos Mecánicos Técnicas Homogeni- zador
de cuchillos Homogeni- zador alta presión Ultrasonifi-
cación Principios Las células son rotas en un
mezclador Las células son forzadas a pasar a través
de un pequeño orificio lo que produce que se rompan por el
esfuerzo de corte Las células son quebradas en una Stress
Moderado Fuerte Fuerte Costos Moderado Moderado Caro Ejemplos
Rompimiento de tejidos y células animales. Tratamiento a
gran escala de suspensión de células. Rompimiento
de suspensiones de cavidad ultrasónica células a lo
menos en pequeña escala Molienda Las células son
Moderado Barato rotas por medio de una molienda con abrasivos
Molinos de bolas Las células son trituradas con bodas de
acero o Fuerte Barato Rompimiento a gran escala para suspensiones
de células y células de vidrio plantas
Rompimiento Celular Métodos No- Mecánicos
Métodos No-mecánicos Técnicas Permeabili-
zación Enzimático Principios
Permeabilización de la pared celular, lo cual produce el
rompimiento de la Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento
de M. lysodeikticus con lisozima. célula Shock
Osmótico Solubiliza- ción Ruptura Osmótica
de la membrana Disolución de la membrana celular Suave
Suave Barato Moderada- mente Caro Ruptura de Células de
Glóbulos Rojos. Rompimiento de bacterias con con
detergentes SDS. Disolución de Lípidos Solventes
orgánicos que disuelve la pared celular y también
la Modera do Barato Rompimiento de levaduras desestabilizan con
tolueno. Tratamien- to con álcalis Solubilización
de la membrana por saponificación de los lípidos
Fuerte Barato
Tratamiento enzimático Teoría Existen enzimas que
pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando
la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos
compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio. Una
comparación entre un proceso de rompimiento y otro de
permeabilización.
Metodología El modo de acción es muy simple basta
con agregárselo a una suspensión y se produce una
reacción muy rápida la cual deteriora la pared
celular. La reacción es selectiva y ataca a determinadas
estructuras de la pared celular como son las glucanasa,
mananasas. Ventajas: Método suave y selectivo escalable
Desventajas: escala. Costo de la enzima lo hace difícil de
utilizar a gran Microorganismo Bacterias Levaduras Células
de plantas Enzima Lisozima Complejo glucanasa- mananasa Celulosas
y peptinasas Efecto Ruptura de los enlaces ß-1,4 entre
N-acetil murámico y N- acetil glucosamida Rompe la capa de
glucano y de manano Rompen capa de celulosa y peptino
y Shock Osmótico Teoría Resulta ser uno de los
métodos más simple: 1. Las células se
colocan en una volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de
células. 2. Bajo estas condiciones las células se
hinchan, debido a un simple flujo osmótico que se produce
debido a que las células contienen solutos (los causantes
del flujo osmótico de agua al interior de la
célula). 3. Las células se hinchan y algunas llegan
a reventarse. La susceptibilidad de las fuertemente de su tipo.
células es relativa depende
Los glóbulos rojos son fáciles de lisar. Las
células vegetales son muchos más difíciles,
dado que sus paredes contienen compuestos que son impermeables al
flujo osmótico. Se puede calcular la presión
necesaria para romper células a partir de la ley
van´t Hoof. La cual se deduce desde la condición de
equilibrio : DP = – R*T*c1 Donde c1 : Concentración de
solutos en el interior de la célula. En el caso de una
célula que contiene una concentración de solutos
del orden de 0.2 M, calculando la diferencia de presión
alcanzara valores del orden de -5 atm (dentro mayor
presión que afuera).
Solubilización Teoría Es uno de los método
no-mecánico rompimiento de células. más
utilizado para el Los detergentes tienen una zona
hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta
razón pueden interactuar tanto con el agua como con los
lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización
de los lípidos de la pared celular. Los detergentes
más utilizados son de tres tipos: •Detergente
aniónico •Detergente catiónico
•Detergente no-iónico y polidispersante
Ejemplos Detergentes aniónicos •Dodecil Sulfato de
Sodio (SDS) CH3(CH2)11 SO3- Na+ •Sulfonato de Sodio
CH3(CH2)9 -Phenyl-SO3- Na+ •Tauroclorato de Sodio El SDS es
uno de los detergentes aniónicos más ampliamente
estudiados. Entre los materiales aniónicos se encuentran
los jabones (sales de ácidos grasos), estos jabones
dependen del grupo de ácido carboxílico que tengan
y resultan efectivos a altos pH donde el grupo se encuentra
ionizado. A su vez resultan ineficientes en aguas duras que
contengan iones calcio que pueden reaccionar con ellos y formar
compuestos insolubles. Las desventajas de los detergentes
tradicionales se puede superar si se reemplazan los grupos
carboxilos por grupos sulfatos. Los sulfatos que contienen grupos
fenilos son más efectivos que los compuestos que contienen
grupos alquilos, debido principalmente que no son fáciles
de degradar microbianamente, como son los detergente utilizados
para lavado.
Ejemplos Detergentes cationicos •Bromuro de Catiltrimetil
Amonio (CTAB) CH3(CH2)15 N+ (CH3)3 Br- Son detergentes más
suaves (tipo shampoo), por lo cual se produce un rompimiento
más suave de las células. Ejemplos •Triton
X-100 Detergente no-iónicos C8H17-Phenyl-(OCH2CH2)9.5OH
Son generalmente polímeros solubles en agua, se utilizan
en los detergente para lavar vajilla. Estos detergente
también tienen una parte hidrofóbica y una
hidrofílica, pero la parte hidrofílica no es ni un
sulfato ni un tetraalquilamonio sino un alcohol. .
A bajas concentraciones de detergente no se produce
degradación de los lípidos, pero a alta
concentración se produce una degradación que
resulta lineal a la concentración de detergente, junto a
esta variable también se altera la tensión
superficial de la solución. La relación que se
produce entre la solubilización y otros fenómenos
es que el detergente forma micelas, en cuyo interior se
encapsulan los lípidos digeridos (Cabezas
hidrofílicas y colas hidrofóbicas que están
en contacto con la sopa de lípidos).
Procedimiento 1. Se coloca un determinado volumen de detergente
concentrado por un volumen de células. Generalmente la
mitad de volumen de detergente que de volumen de células.
2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La
suspensión resultante se centrifuga para remover los
fragmentos de células y luego se pasa a través de
una columna de adsorción o por etapas de extracción
para aislar el producto.
Tratamiento con solvente (disolución de lípidos) Es
una técnica la cual no ha sido muy documentada,
sólo se requiere de información experimental. Una
buena forma de seleccionar el solvente es analizar la volatilidad
(desde manuales), este parámetro puede relacionarse con
las interacciones lípido solvente, poniendo
atención en el calor de mezcla. Solventes con similar
solubilidad atacarán los lípidos de forma similar.
Procedimiento 1. El método consiste en adicionar la
suspensión de biomasa un volumen de tolueno del orden de
un 10% de biomasa. 2. El tolueno es absorbido por las
células, las cuales se hinchan y luego explotan. 3. El
contenido de las células se libera al medio y luego puede
ser separado.
• • • • • Existen otros solventes que
puede ser utilizados como : Benceno ( que es cancerigeno y de una
alta volatilidad, el tolueno también es cancerigeno pero
de más baja volatilidad). Cumeno Clorobenceno Xileno
Octanol (Altos alcoholes)
Tratamiento alcalino Es un tratamiento bastante fuerte, no
selectivo y barato. Algún álcalis es agregado a un
suspensión de células, el álcalis reacciona
con la pared celular en diversas formas, produciendo la
saponificación de lípidos. Desventajas : Una alta
concentración de álcalis puede hasta producir la
denaturalización de las proteínas (destruyendo el
producto). Resulta la opción menos utilizada.
Rompimiento Celular Métodos Mecánicos Unidad II
Ingeniería de Bioseparaciones
MÉTODOS MECÁNICOS Los métodos
mecánicos se pueden dividir en dos tipos : Métodos
a pequeña escala son : •Ultrasonificación
•Molina con abrasivos •Homogenizadores Métodos a
gran escala •Homogenizadores •Molinos de bolas a alta
presión Ambos son operaciones unitarias típicas de
la Ingeniería de Procesos y de la industria de
alimentos.
MÉTODOS MECÁNICOS Pequeña Escala
2. 3. 4. 5. 6. 6 Desintegración completa de una
célula Para determinar el contenido de proteínas
total de una célula se debe realizar la
desintegración total de ellas, para ello se utiliza la
siguiente metodología: 1. Se adicionan 1 volumen de bolas
de vidrio en un ependorf. 1-3 4-5 Se adiciona 1 volumen de las
células a desintegrar (en forma de pasta, previamente
separadas del caldo) Se adiciona 0.5 volumen de buffer, se puede
adicionar algún detergente (SDS, Triton X-100) Se agitan
fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no
se caliente) Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no se
rompen más las células. Se separan los desechos de
la solución y se analiza la concentración de
proteínas. 100% Rompimiento
Ultrasonificación Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto
produce vibraciones que provocan el fenómeno de
cavitación. • Se producen zonas de baja
presión en el líquido • El líquido se
transforma en gas formándose pequeñas burbujas
• Las burbujas colapsan debido a los cambios de
presión. • Se producen fuertes esfuerzos de corte en
el líquido que rompen las células.
Ultrasonicador
Molienda con abrasivos Procedimiento: 1. Se utilizan un
recipiente donde se agrega algún agente abrasivo, como
bolas de vidrio. 2. El sistema se hace vibrar lo que produce:
• Colisiones de las bolas con la biomasa • Fuertes
esfuerzos de cortes • Se produce la ruptura de las
células. 3. Posteriormente, se separan las bolitas y
desechos celulares y se recupera el sobrenadate.
Homogenizadores La idea es generar altos esfuerzos de corte que
produzcan la ruptura de las células. Los altos esfuerzos
de corte se pueden obtener por: 1. Embolos 2. Cuchillas 3.
Pistones Émbolos Cuchillas Pistones
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