Métodos rápidos para la identificación de Shigella

Objetivo: identificar y prevenir la presencia de
Shigella en los alimentos muy manipulados como carne o verduras
utilizando métodos rápidos para la
identificación de dicha bacteria.

Se desea comprobar si existe presencia de la bacteria
Shigella en alimentos, específicamente en verduras y
carne, ya que son alimentos muy manipulados y están
expuestos al aire libre, estas condiciones propician la
contaminación del alimento y el crecimiento de dicha
bacteria, es así que se pretende realizar una toma de
muestra en diferentes establecimientos como son
carnicerías o puestos en el mercado, dicha muestra
será analizada con métodos rápidos de
identificación, en caso de existir presencia de esta
bacteria, poder prevenir enfermedades y el crecimiento de
Shigella en este tipo de alimento.

Hipótesis: la identificación de Shigella
en los alimentos (verduras y carne) ayuda a disminuir los
factores que incrementan el desarrollo de la bacteria.

Generalidades

Shigella es un bacilo gran negativo
aeróbico no móvil que se transmite de persona a
persona por la ruta fecal-oral, requiriendo una pequeña
carga de microorganismos de (10 a 100 bacterias) para causar
infección siendo el hombre su único hospedador
natural, Se reconocen cuatro grupos de esta especie: S.
dysenteriae, S.flexneri, S.boydi y S.sonnei las cuales son
la principal causa de disentería (diarrea caracterizada
por eliminación frecuente de heces, conteniendo pus,
sangre y/o mucus) y son causa común de gastroenteritis
bacteriana. (Cabrera. Et al. 2005). Es frecuente en los
países tropicales y subtropicales en desarrollo,
además es una importante causa de mortalidad en los
países en vías de desarrollo, lo que representa
alrededor del 25% del total de las defunciones que ocurren en los
niños menores de 5 años en el mundo
(Martínez. Et al. 2008). La enfermedad causada
por Shigella se conoce como shigelosis o disentería
bacilar.

El número de personas infectadas por
Shigella cuyo origen fueron los alimentos es bajo
comparado con salmonella y campylobacter. En
países avanzados los causantes de shigelosis en alimentos
son principalmente sonnei en torno al 70% y
flexneri aproximadamente el 25%.

El alimento desempeña un papel importante
únicamente como vector inespecífico. Se ha
demostrado que los productos siguientes han tenido un papel
epidemiológico:

• 1. Los alimentos ni excesivamente ácidos
  ni excesivamente secos para permitir el crecimiento, o al
  menos la supervivencia de las shigellas.

• 2. Los productos muy manipulados, como las
  carnes cortadas, los sándwiches y las
  ensaladas.

• 3. Los alimentos que se han dejado durante un
  tiempo a temperatura ambiente.

• 4. Los alimentos que se consumen sin
  cocción o cocinado adicional, incluye los
  sándwiches, las ensaladas y los alimentos marinos
  pelados y cocidos.

Muchos de los casos de shigelosis transmitida por los
alimentos no se han declarado oficialmente, la mayor parte de los
mismos pueden transcurrir sin ser detectados (Mossel. Et
al.2007).

Las pruebas de identificación bioquímicas
estándar y las técnicas serológicas
constituyen los métodos de detección rutinaria
de Shigella sp.

El personal infectado que maneja los alimentos es la
fuente más frecuente de la contaminación de los
alimentos por Shigella por lo que una buena higiene personal es
necesaria para controlar al microorganismo
(León.2002)

Shigella dysenteriae

Las cepas de Shigella dysenteriae serotipo 1
difieren de otras cepas de Shigella por varias
razones:

• Solo S. dysenteriae 1 causa epidemias de
disentería grandes y prolongadas.

• La infección con S. dysenteriae 1
causa enfermedad con mayor letalidad que las infecciones
producidas por otros grupos de Shigella.

• La resistencia a los antimicrobianos se
desarrolla más rápidamente y ocurre con mayor
frecuencia cuando se trata de cepas de S. dysenteriae 1
que con otros grupos. (Bopp. Et al. 2004)

Con frecuencia origina una diarrea profusa y
teñida de sangre. Además de producir la
toxina Shiga (potente neurotóxica, que determina
convulsiones y es responsables de la acumulación de
líquidos en el asa intestinal y de la diarrea acuosa que
puede observarse en la fase inicial de la Shigelosis) que puede
provocar trastornos sistémicos profundos. (Mossel. Et
al.2007)

Ecología

Shigella Invade las células epiteliales del
intestino grueso y la porción distal del intestino
delgado, alcanza las submucosas del colon y es capaz de ulcerar
esos tejidos. (León.2002)

Patología

Una vez que el individuo ingiere el microorganismo este
debe fijarse al intestino delgado y multiplicarse; en esta etapa
no se observa ningún fenómeno clínico y los
síntomas solamente aparecen después de que la
bacteria se traslada a través del epitelio, se multiplica
formando cúmulos bacilares en el interior de la pared se
presenta la inflamación, la lesión progresa y
desciende al colon dando lugar a fenómenos
hemorrágicos, necrosis y a la formación de ulceras.
Las manifestaciones clínicas pueden variar pero algunos de
los síntomas incluyen diarrea, dolor abdominal, fiebre y
vomito (León.2002).

Esta bacteria tiene un periodo de incubación
relativamente corto, generalmente de unas 48horas, pero
varía de 7 a 66 horas, Predomina en los meses de verano y
la trasmisión intrafamiliar ocurre frecuentemente.
(Mossel. Et al.2007)

La temperatura optima de crecimiento de los agentes
causales es de 37oc, creciendo dentro de un intervalo de
temperaturas comprendido entre 10 y 40oc. Estos microorganismos
toleran concentraciones de sal del 5 al 6 % y son relativamente
termosensibles también liberan una endotoxina de
naturaleza polisacarídica que ataca la mucosa intestinal
(Frazier. Et al. 2001).

Para el tratamiento de la shigelosis y cualquier
enfermedad diarreica la primera consideración en tratar es
la corrección de las anormalidades que resulta de la
deshidratación: la acidosis metabólica y la
pérdida significativa de potasio, aunque la
deshidratación severa es rara en shigelosis, con
hidratación apropiada la shigelosis es generalmente una
enfermedad autolimitada. La decisión para prescribir
antibióticos es indicada por la severidad de la
enfermedad, la edad del paciente y la probabilidad de mayor
transmisión de la infección. Los antibacterianos
(trimetropim-sulfametoxazol, ciprofloxacina u ofloxacina en
adultos sulfametoprim-sulfametoxazol, ampicilina o acido
nalidíxico en niños) acortan el curso de enfermedad
y su intensidad y la duración de la excreción del
agente patógeno; deben utilizarse en aquellos casos que lo
justifiquen la gravedad de la enfermedad, o como la
protección a los contactos (como guarderías o
instituciones) cuando este indicado desde el punto de vista
epidemiológico. La elección de medicamentos
específicos dependerá del antibiograma de la cepa
aislada o de los patrones de sensibilidad local a los agentes
antimicrobianos. (León, 20002).

Métodos
rápidos

Los métodos rápidos para la
identificación de de para Shigella pueden ser los
siguientes:

 Métodos de PCR: se realizan en Kits de PCR
(The PrimerDesign) utilizados para la detección y
cuantificación simultánea de varios
patógenos importantes, este método consiste en
 realizar un número de copias de la curva
estándar que se proporciona para la cuantificación
mediante una plantilla de la extracción interna (ADN o
ARN), como controles de la calidad de la extracción de
ácidos nucleicos, además elimina los resultados
falsos negativos.

Otro método rápido es la técnica de
epifluorescencia la cual es una forma de identificación de
microorganismos por la emisión de colores, causada por la
longitud de onda que emiten las muestras al aplicarles
fluorocromos (sustancias fluorescentes). Esta técnica se
basa en la filtración de la muestra a través de una
membrana de policarbonato donde quedan retenidos los
microorganismos (la muestra previamente se trata con detergentes
y enzimas proteolíticas con el fin de evitar la
saturación del filtro con partículas del alimento).
Posteriormente, la membrana se tiñe con naranja de
acridina, que es un fluorocromo nucleofilico que origina
distintos patrones de fluorescencia en el ADN y el ARN
dependiendo de la fase de crecimiento celular. Los filtros
teñidos se observan en un microscopio de fluorescencia y
los recuentos de microorganismos se obtienen mediante el contaje
de las partículas fluorescentes en un número
determinado de campos de fluorescencia. Las células
viables emiten una fluorescencia que va del naranja al rojo y las
células muertas emiten fluorescencia verde.
(Martin)

También se pueden utilizar las APIS las cuales
son kits de pruebas bioquímicas que se componen de
diferentes pocillos donde se agrega la muestra y determina la
presencia de ciertas bacterias. La muestra es colocada en los
pocillos de los kits para identificar a la bacteria y conocer si
el número de bacterias presentes son causa alarmante para
la salud de los que consumen este tipo de alimentos.

Técnicas
de identificación

Otra manera de identificar a la bacteria Shigella es
mediante su aislamiento en medios de cultivo. Para un aislamiento
óptimo de este microorganismo, deben utilizarse dos medios
selectivos diferentes: uno de siembra para propósitos
generales de baja selectividad, como el AMC (Agar MacConkey), y
otro de agar más selectivo, como es el agar DXL (Agar
desoxicolato xilosa lisina). No se debe utilizar agar SS (agar
salmonella-Shigella), porque frecuentemente inhibe el crecimiento
de S. dysenteriae serotipo 1. (Bopp. Et al.
2004)

Después de obtener las muestras, los medios
selectivos se pueden inocular utiliza hisopos o el asa de
siembra. Cuando se inoculan las muestras a una placa para
aislamiento, la superficie completa de la placa de agar debe ser
utilizada para aumentar las oportunidades de obtener colonias
bien aisladas. Los medios de alta selectividad (por ejemplo, DXL)
requieren, cuando se estrían, más solapamiento que
los medios de baja selectividad (por ejemplo, AMC), por lo cual
debe prestarse especial atención al estriado.
Después de la incubación, registre la cantidad y el
tipo de crecimiento (por ejemplo, si fermenta o no fermenta la
lactosa ya que con esta bacteria no existe fermentación).
En AMC las colonias de Shigella aparecen convexas,
incoloras, de aproximadamente 2–3 mm de diámetro,
aunque las colonias de S. dysenteriae 1 pueden ser
más pequeñas. Las colonias de Shigella en
agar DXL son de color rosado a rojo, transparentes, lisas, de
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, aunque las colonias
de agar DXL de S. dysenteriae 1 son frecuentemente
diminutas. Seleccione las colonias sospechosas de las placas de
AMC y agar DXL e inocúlelas en medios de pesquisaje
apropiados, tales como agar hierro de Kligler (AHK) o agar hierro
triple azúcar (AHTA).

Para el AHK o el AHTA Seleccione cuidadosamente al menos
una colonia bien aislada de cada tipo en cada tipo de placa de
las que fueron estriadas para aislamiento, con una aguja de
inoculación toque ligeramente solo el centro de la colonia
sin tocar el resto de la colonia ni la superficie de la placa
porque si lo hace, puede tomar contaminantes que podrían
estar en la superficie del agar.

Materiales y
métodos

Materiales:

-Guantes.

-Cubre bocas.

-bolsas estériles.

-cloro.

-2 cajas petri.

– 2 tubos de ensayo

-Medios de cultivo (DXL, AMC y
AHK).

– agua

– mecheros de bunsen.

-Soporte universal.

-anillo de hierro.

-gradilla

-1 Matraz

-1 agitador

-1 bascula granataria.

-Muestra (lechuga y carne)

MÉTODO:

Primero se realizan los medios de cultivo, se mide la
cantidad de agua a utilizar y se pesan las concentraciones de
agar para cada una de las mezclas, después se calienta el
agua y se le agrega el agar , esta solución es llevada a
ebullición (100oc) y posteriormente se deja enfriar,
cuando baje la temperatura a 40oc es vaciada en las cajas petri(
de cada tipo de agar DXL y AMC) y los tubos de ensayo (AHK) (Los
tubos deben dejarse de manera inclinada) se deja que el medio se
solidifique, si el medio de cultivo no se utiliza después
de que se solidifique se debe llevar a refrigeración.
Teniendo los medios de cultivo se procede a obtener la muestra,
la cual se adquiere del sitio de estudio (puesto del mercado),
estas son colocadas en bolsas estériles y llevadas al
laboratorio (las áreas a utilizar son de desinfectadas con
cloro).

La muestra es homogeneizada (son disgregados sus tejidos
y se rompen sus células) y es utilizada para inocular las
cajas petri. La inoculación consiste en esparcir la
muestra homogeneizada en el medio selectivo DXL y AMC realizando
un estriado, posteriormente se cubre la placa después de
haberla estriado y se coloca la placa de agar con la tapa hacia
abajo (invertida) en la incubadora para evitar el exceso de
condensación. Se Incuban las placas durante 18 a 24 horas
entre 35°C y 37°C. (Bopp. Et al.
2004)

Después de obtener colonias de Shigella aisladas
(se presentan en color rojo) se selecciona una con el asa de
siembra (de cada una de las placas estriadas) y se toca
ligeramente solo el centro de la colonia para evitar tomar
contaminantes que podría estar en la superficie del agar
Para inocular los tubos de AHK se pincha el extremo (tope) y se
estría la superficie de la cuña. Después de
incubar por 18 a 24 horas a 35°C–37°C, se debe
observar la superficie inclinada del agar para ver las reacciones
típicas de Shigella. La presencia de Shigella en
AHK no produce gas, la cuña es de color rojo con fondo
amarillo (Bopp. Et al. 2004).

También se pueden comprar algunos métodos
rápidos para la identificación de Shigella para
ahorrar tiempo y es una manera más fácil de saber
si la muestra está contaminada.

Posibles
resultados

Se encontraron bacterias de Shigella en la muestra pero
la cantidad no es lo suficientemente grande para causar grandes
daños o el desarrollo de la enfermedad, aun así se
debe tener cuidado e identificar el área de mayor
contaminación.

Referencias
bibliográficas

Bopp, Cheryl, Gloria Ajello,MS, John Elliott, PhD
Richard Facklam, PhDoan S. Knapp, PhD, Tanja Popovic, MD PhD Joy
Wells, MS. 2004 Manual de Laboratorio para la
Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los
Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia
para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo.
(Salmonella serotipo Typhi, Shigella y
Vibrio cholerae). Centros para el Control y la
Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para las
Enfermedades Infecciosas Y Organización Mundial
de la Salud, Enfermedades Transmisibles: Vigilancia y
Respuesta, pp.131-135.

Cabrera. C .C., Purizaca. F.R., León P. A. y
Celis s. J. Sepsis por Shigella flexneri. Revista peruana de
medicina experimental y salud pública, abril-junio vol.22,
núm.002, 2005, Instituto Nacional De Salud. Lima,
Perú, pp.145-147

Frazier. W.C y D.C.westhoff. 2001. Microbiología
de los alimentos. Editorial ACRIBIA, México.

León Ramírez Sergio,
shigelosis (disentería bacilar), salud en Tabasco, abril
vol. 8, núm. 001,2002. Secretaria.

Martin, S. R. Métodos rápido y
automatizado aplicado al análisis microbiológico de
los alimentos, Departamento de Nutrición,
Bromatología y Tecnología de los Alimentos.
Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de
Madrid.

Autor:

Guillermina