Presencia e incidencia de virus de la vid en la zona central de Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se
realizó en 33 predios con vides en producción, y en 6 viveros con plantas madres y
material de propagación, ubicados en la V, VI y
Región Metropolitana, entre los meses de septiembre y
enero de las temporadas 1996 a 2000. En cada predio se colectaron
muestras al azar, según el siguiente esquema: en cada
décima hilera de plantas se colectaron sucesivamente
muestras de cada décima planta. La muestra estuvo
constituida por material verde (hojas y brotes) de una sola
planta, la cual se identificó adecuadamente, se
colocó en bolsa plástica y se almacenó en
una caja de plástico a
temperatura
regulada (inferior a 20°C) para ser llevadas para análisis al laboratorio de
virología del Centro Regional de Investigación La Platina, perteneciente al
Instituto de Investigaciones
Agropecuarias (INIA), ubicado en Santiago.

El número de muestras por campo fue variable,
dependiendo de su tamaño. Generalmente, se tendió a
colectar aproximadamente el 10% del total de plantas. Todas las
muestras se analizaron serológicamente según el
procedimiento
ELISA indirecto, utilizando antisueros para los siguientes
virus; GFLV,
GLRV, TomRSV y CLRV (SANOFI, Francia).
Asimismo, en los predios visitados se colectaron muestras de
plantas con síntomas atribuibles a una virosis, las que
fueron procesadas en forma similar a las anteriores. Cuando los
cuatro virus prospectados dieron resultados negativos, las mismas
muestras se sometieron a una batería de antisueros que
incluyeron a los siguientes virus reportados por Martelli (1993)
como presentes en vides en diferentes localidades del mundo:
Alfalfa Mosaic Virus (AMV) (Bercks et al., 1973), Apple Mosaic
Virus (ApMV), Arabis Mosaic Virus (ArMV), Carnation Mottle Virus
(CarMV), Cucumber Mosaic Virus (CMV), Potato Virus X (PVX),
Tomato Black Ring Virus (TBRV), Tobacco Streak Virus (TSV),
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) (Stobbs y Broadbent, 1993),
Raspberry Ringspot Virus (RRV), Strawberry Latent Ringspot Virus
(SLRV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) y Tobacco Ringspot Virus
(TRSV). Además, las muestras se estudiaron
serológicamente por ELISA con antisueros policlonales
específicos para la detección de la bacteria
Xillela fastidiosa, agente causal de la enfermedad de Pierce,
ausente aún en los viñedos chilenos.

La ejecución de la prueba ELISA se realizó
de la siguiente manera: con un rodillo manual se
trituró aproximadamente 1 g de hojas y brotes nuevos, se
diluyó (1/10 p/v) en tampón de extracción
(Na2CO3 1,5 mM, NaHCO3 3,5 mM,
pH 9,6).
Luego, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min. En
placas de poliestireno se adicionaron 100 m uL del sobrenadante
por muestra (antígeno) a cada celda, incluyendo siempre
una repetición (dos celdas), incubándose la placa
bajo condiciones de refrigeración, toda la noche. Enseguida,
las placas se lavaron con solución de lavado PBST (NaCl
137 mM, KH2PO4 1,47 mM
NaHPO4x12H20 8,09 mM, KCl 2,68 mM y 0,05 %
Tween-20) cinco veces, cada vez durante 5 min. Luego, se
adicionó solución de bloqueo albúmina de
huevo al 3% en PBS 1X (NaCl 137 mM, KH2PO4
1,47 mM, Na2HPO4x12H2O 8,09 mM,
KCl 2,68 mM) incubándose durante 2 h a 37 ºC.
Después de un lavado similar a los anteriores, se
agregaron las inmunoglobulinas policlonales diluidas en
tampón conjugado (albúmina de bovino 0,2%, PVP-40
0,5 M en PBS 1X), incubándose durante 3 h a 37 ºC.
Posteriormente, después de lavar se les incorporó
el segundo anticuerpo producido en cabra conjugado con la enzima
fosfatasa alcalina, incubándose las placas durante toda la
noche a 4ºC. Finalmente, la reacción se reveló
adicionando 1 mg mL-1 de p-nitrofenilfosfato en
tampón dietanolamina (9,7% v/v). Las reacciones
inmunológicas se evaluaron en un lector ELISA (modelo EL
312e, marca Bio
Kinetic, USA), considerando como muestras positivas, todas
aquellas superiores al doble del valor de
absorbancia de los controles sanos.

RESULTADOS

Considerando vides en producción, los resultados
indicaron que en los 33 predios prospectados con un total de
16974 muestras, se encontró una infección virosa
promedio de 9,8% (Cuadro 1). Sólo 5 de los 33 campos
estudiados no presentaron presencia de ninguno de los 4 virus
analizados, constituyendo el 15,1%. Otros 21 predios mostraron
infecciones totales inferiores a 10% y en 7 campos las
infecciones fluctuaron de entre 11 y 72%. Los virus que se
encontraron con mayor frecuencia, en términos de predios
infectados, fueron TomRSV y GLRV con 45,4 y 63,6%,
respectivamente. En niveles inferiores se presentaron GFLV y CLRV
con 30,3 y 27,2%, respectivamente.

Cuadro 1. Incidencia (%) de los
virus GFLV1, GLRV2,
TomRSV3 y CLRV4 en cultivos
de vid en la zona central de Chile.
Table 1. Incidence (%) of GFLV, GLRV, TomRSV and CLRV in
grapevine in the central zone of Chile.

1 Grape Fan Leaf Virus
2 Grape Leaf Roll
Virus
3 Tomato Ringspot
Virus
4 Cherry Leaf Roll
Virus
5 Región
Metropolitana

Un análisis individual de cada uno de los virus,
en relación al número total de muestras colectadas,
indicó que el virus de mayor incidencia fue TomRSV con un
8,7%. El resto de los virus no superó la barrera del 1%.
Sin embargo, cuando se analizaron los resultados de cada uno de
los virus en particular, dentro de cada predio, los resultados
fueron altamente variables. En
algunos campos, los niveles de incidencia, tanto de GLRV como de
TomRSV, alcanzaron el 20 ó 63% de plantas
infectadas.

Considerando las prospecciones de virus en material
madre para propagación, que incluyeron 6 viveros con un
total de 7963 muestras, mostraron una incidencia promedio de
infección virosa de 22,1% (Cuadro 2). Particularmente, en
cada vivero los niveles de incidencia fueron relativamente altos.
Por ejemplo, viveros ubicados en la VI Región presentaron
infecciones del orden del 25% en el material madre, llegando en
un caso al 42,2%. El análisis individual de cada virus
mostró que el virus prevalente en los viveros fue TomRSV.
Este virus mostró infecciones promedios para todos los
viveros de 14,4%, con un rango variable entre 0 y 30,7%. Otro
virus encontrado en niveles importantes fue GLRV, con una
incidencia de 7,5% y un rango de 2,0 a 21,4%. Con menor
incidencia se determinaron a GFLV y CLRV (Cuadro 2).

Cuadro 2.
Incidencia (%) de los virus GFLV1, GLRV2,
TomRSV3 y CLRV4 en viveros de vides en la
zona central de Chile.
Table 2. Incidence (%) of GFLV1, GLRV2,
TomRSV3 and CLRV4 in grapevine nurseries in
the central zone of Chile..

1 Grape Fan Leaf Virus.
2 Grape Leaf Roll
Virus.
3 Tomato Ringspot
Virus.
4 Cherry Leaf Roll
Virus.

En los distintos predios visitados se encontraron, en
forma esporádica, plantas con destacada disminución
de crecimiento, manchas cloróticas en las hojas, mosaico
leve en la lámina de las hojas, malformación de
sarmientos y/u hojas, diferencias en brotación dentro del
sarmiento, etc. Muestras de estas plantas, que fueron negativas a
reacciones con antisueros de los 4 virus utilizados en los
estudios de incidencia (14 muestras), se sometieron a prueba
ELISA con otros antisueros de virus detectados en vides en
diferentes partes del mundo. Así, en el Cuadro 3 se
indican las diferentes reacciones para estos antisueros. Se
obtuvieron reacciones positivas para los siguientes virus; ArMV,
RRV, SLRV, PVX, TSWV, TSV y TBRV. Por otro lado, todas las
reacciones fueron negativas para los virus AMV, ApMV, CarMV, CMV,
TMV, ToRSV y GFV. También los resultados fueron negativos
contra antisuero para la bacteria Xilella
fastidiosa..

Cuadro 3.
Reacción ELISA a antisueros de virus reportados en vides
de muestras de vides con síntomas virosos provenientes de
diferentes localidades.
Table 3. ELISA reaction to antisera of reported viruses in
grapevine samples with viral symptoms in grapevines coming from
different localities.

DISCUSIÓN

Se han identificado a nivel mundial, 44 virus
pertenecientes a 5 familias y 16 géneros en el cultivo de
la vid (Martelli, 1994). En Chile, la mayoría del material
de propagación disponible para la venta, tanto para
uva de mesa como vides para vinificación, se caracterizan
por ser plantas calificadas como corrientes. Esto significa que
los diferentes viveros sólo pueden acreditar que el
material es obtenido de plantas madres vigorosas y aparentemente
libres de enfermedades sobre la base
de una inspección visual. No existen entidades
públicas o privadas que tengan sistemas de
certificación de plantas o sistemas intermedios que
aseguren la ausencia de virus.

La consecuencia de esta situación se ha visto
reflejada en otros estudios, así por ejemplo, Herrera y
Madariaga (1994) indicaron infecciones de 16 y 22% en parronales
de la zona central para los virus GFLV y GLRV, respectivamente.
El presente estudio en viñas y/o parronales de las
regiones V, Región Metropolitana y VI, y que
incluyó 16.974 muestras tomadas al azar, indica
infecciones promedios de 9,8%. No obstante, se observó una
heterogeneidad en la incidencia de los virus en los distintos
predios estudiados. Esta heterogeneidad sugiere que, en aquellos
predios sin infección virosa, el material de
propagación provino de plantas madres sin estos virus,
contrastando con los predios de elevada infección, donde
probablemente el material provino de plantas madres infectadas.
Más preocupante es la situación de viveros de
producción de plantas de vides, en los cuales los
promedios de infección llegaron al 22,1%.

Cabe destacar, que de acuerdo a los resultados
expuestos, se observa una predominancia de la incidencia de
TomRSV en relación a los otros virus estudiados. TomRSV se
presenta en el Este de EE.UU. y Canadá, siendo de muy baja
incidencia en California (Gonzalves, 1988). Estos resultados
confirman la detección del virus en Chile por Herrera y
Madariaga (1994) y Herrera (1996), y sugieren que en ciertas
localidades podría constituirse en un factor detrimental
de los rendimientos. Se indica a TomRSV como el causante del
declinamiento progresivo de la vid. En los primeros años,
los síntomas pasan inadvertidos, excepto por
heterogeneidad en la brotación, especialmente en las
regiones más frías. Posteriormente, las plantas
infectadas muestran acortamiento de entrenudos, hojas
pequeñas, deformadas y disminuciones de crecimiento. Bajo
las condiciones de comercialización de plantas de vides en
Chile, en que predomina la venta de plantas corrientes, y las
características de este grupo de virus
(transmisión por nemátodos y material de
propagación), en el futuro podrían constituirse en
un serio problema para el cultivo de la vid en Chile.

La presente investigación también
demostró que los cultivos de vides en Chile, no
sólo están afectados por las enfermedades
más comunes a nivel mundial, sino también por otros
virus que se presentan en este cultivo. Así se
detectó la presencia de ArMV, PVX, TomBRV, RRV, SLRV, TSV
y TSWV. De estos virus, PVX y TSWV son patógenos
importantes en otros cultivos, pero en la vid tienen importancia
secundaria.

Los resultados expuestos en la presente
investigación permiten dimensionar la situación
virológica de la vid en Chile. Los virus más
importantes de la vid en el mundo están presentes en
nuestras condiciones, con mayor o menor incidencia, dependiendo
principalmente del origen del material propagado. Esto se ve
reflejado en los resultados de la incidencia virosa en viveros;
se observó una variación entre viveros y, dentro
del vivero, entre diferentes virus. Probablemente, las plantas de
vides en producción con baja incidencia virosa provienen
de viveros poco infectados, y viceversa. Aunque mayores y
más detalladas investigaciones son necesarias, los
resultados expuestos proveen de información necesaria para enfatizar el
establecimiento de programas
integrados de control de estas
enfermedades.

CONCLUSIONES

La incidencia promedio de infección virosa en
plantaciones de vides en producción, en un total de 16.974
muestras, fue de 9,8%. En plantas madres para propagación
se encontró un 22,1% en un total de 7.963 muestras.. En
los diferentes predios fluctuó entre 0 y 72%.

En 16.974 muestras colectadas en plantaciones de vides
en producción, se determinó una incidencia de 0,2%
para GFLV, 0,66% para GLRV, 8,6% para TomRSV y 0,28% para
CLRV.

En 7.963 muestras colectadas en viveros de vides se
determinó una incidencia de 0,2% para GFLV, 7,5% para
GLRV, 14,4% para TomRSV y 0,1% para CLRV.

El virus de mayor incidencia, tanto en plantaciones de
vides en producción como en material madre para
propagación, fue TomRSV.

Se detectaron mediante ELISA los siguientes virus de
importancia secundaria en el cultivo de la vid; ArMV, RRV, SLRV,
PVX, TSWV, TSV y TBRV. No se detectó la presencia de X.
fastidiosa.

LITERATURA CITADA

Arancibia, M.R.
1988. Identificación de los virus asociados al
enrollamiento de la hoja de la vid (V. vinifera L.)
presentes en el cv. Black seedless y la obtención de
plantas limpias mediante termoterapía y cultivo de
meristemas. 100 p. Tesis
Ingeniero Agrónomo.. Universidad de
Chile, Facultad de Agronomía, Santiago. Chile.

Auger, S.J., E. Aballay,
M. Pinto, y C. Pastenes. 1994. Efectos del virus de la hoja en
abanico VHA en el desarrollo y
productividad
de plantas de vid cv. Thompson seedless. ACONEX
46:20-23.

Bercks, R., D. Leseman, and G. Querfurth. 1973. On
detection of alfalfa mosaic virus in a grapevine. Phytopathology
76:166-171.

Cereceda,C., y J.
Auger. 1979. Aislamiento y caracterización del virus
Mosaico Amarillo de la vid (Vitis vinifera L. cv.
Semillón), presente en Chile. Investigación
Agrícola 5:83-88.

Goheen, A.C. 1977. The
California clean grape stock program. Calif. Agric.
34:15-16.

Gonsalves, D. 1988. Tomato Ringspot Virus decline. p.
49-50. In Compendium of grape diseases. The American
Phytopathological Society. APS Press, St. Paul, Minnesota,
USA.

Herrera, M.G. 1996. Panorama de
enfermedades causadas por virus en frutales de carozo
pomáceas y vides. Simiente 66: 35-36.

Herrera, M.G., y M. Madariaga. 1994. Detección de
los virus Tomato Ringspot Virus y Arabis Mosaic Virus en vides en
Chile. Fitopatología 44:42.

Hewitt, A.C. 1965. Las enfermedades y otros problemas de
los viñedos chilenos. 28 p. Informe al
Gobierno de
Chile. Organización de las Naciones Unidas
para la Agricultura y
la Alimentación (FAO). Roma, Italia.

Martelli, G. (ed.) 1993.
Graft-transmissible diseases of grapevines. 263 p. Handbook for
detection and diagnosis. Food and Agriculture Organization of the
United Nations (FAO), Rome, Italy.

Martelli, G. 1994.
Inquadramento sistematico dei virus delle vite. p. 245-254.
In Atti Giornate Fitopatologiche 1994. Vol. 2. Editrice
CLUEB, Bologna, Italia.

Martelli, G., and B Walter.
1998. Virus certification in grapevines. 684 p. In A.
Hadidi, R. Khetarpal and H. Koganezawa (eds.). Plant virus
disease control. APS Press, St. Paul, Minnesota. USA.

ODEPA, 1998. Cifras de
presentación de la agricultura chilena. 69 p. Oficina de
Estudios y Políticas
Agrarias (ODEPA), Santiago, Chile.

Sanchez, C. R. 1995.
Prospección de Nepovirus y Closterovirus en zonas
vitivinícolas de la VIII Región. 46 p. Tesis
Ingeniero Agrónomo. Universidad de Concepción,
Facultad de Agronomía, Chillán, Chile.

Sanchez, R., y R. Hepp. 1994.
Prospección de nepovirus y closterovirus en viñedos
de la VIII Región. Simiente 64:100 (Resumen).

Stobbs, L., and A.
Broadbent. 1993. Susceptibility of grapevine cultivars to Tomato
Spotted Wilt Virus in Southern Ontario Canada. Plant
Dis. 73:318.

Volosky, D. 1967.
Primera trasmisión de virosis de la vid en Chile.
Fitopatología 2:35-44.

Guido Herrera M. 2 y Mónica
Madariaga V. 2

2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro
Regional de Investigación La Platina, Casilla 439 Correo
3, Santiago, Chile.