Contenido de glicosaminoglicanos del líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica de caballos castrados y yeguas de diferentes edades (página 2)

El agrecán se organiza en la MEC del
cartílago articular formando grandes estructuras
macromoleculares a través de la unión no covalente
del extremo N-terminal de la cadena polipeptídica del
proteoglicano con una cadena de ácido hialurónico,
un GAG no sulfatado, de alto peso molecular que se encuentra en
baja concentración en el cartílago articular
(Roughley y Lee, 1994; Tulamo y col., 1996; Maroudas y col.,
1998). Cada cadena de ácido hialurónico se une
generalmente a aproximadamente 20 moléculas de
agrecán, pero se describe que es capaz de unir hasta 100
unidades originando agregados macromoleculares de masa molecular
aproximada de 2 – 5 x 108 Da (Hardingham y Bayliss, 1990; Alberts
y col., 1994). La formación de estos agregados es muy
importante desde el punto de vista fisiológico, ya que
asegura la retención del agrecán y por ende de
agua, dentro
de la MEC del cartílago (Maroudas y col.,
1998).

El recambio de la MEC del cartílago está
regulado por una serie de factores como son la distribución de la carga mecánica y el efecto de citoquinas, tales
como interleuquina y el factor de necrosis tumoral a, que son
producidos por sinoviocitos y condrocitos. Estos factores
estimulan en estas células la
síntesis y activación de enzimas
denominadas metaloproteinasas (MMPs) que degradan los componentes
de la matriz
extracelular del cartílago (Yoshihara y col., 2000). La
hidrólisis de la proteína central en sitios
específicos por acción
de las MMPs, provoca la liberación de grandes fragmentos
de proteoglicanos que difunden fuera del tejido hacia la cavidad
sinovial (Hardingham y Bayliss, 1990; Todhunter,
1996).

Existen trabajos cuyo objetivo ha
sido relacionar la concentración de GAGs totales y de
queratán sulfato del líquido sinovial con el
daño
del cartílago en las patologías articulares
(Todhunter y col., 1997; Okumura y Fujinaga, 1998). Se ha medido
la concentración de queratán sulfato debido a que
representa mejor a los componentes propios de la matriz
extracelular del cartílago (Todhunter y col.,
1997).

En otros trabajos con articulaciones
normales de equinos, no se ha encontrado una correlación
significativa entre las concentraciones de GAGs totales y de
queratán sulfato del líquido sinovial con la edad
(Fuller y col., 1996). Se ha descrito que a mayor edad, disminuye
el número de condrocitos (Adams y Horton, 1998) y aparece
una población heterogénea de
proteoglicanos unidos al ácido hialurónico
(Maroudas y col., 1998). En el cartílago articular humano
se ha observado que el envejecimiento provoca la
disminución, tanto del tamaño como del
número de las cadenas de condroitín sulfato,
mientras que la proteína central también presenta
un menor tamaño, lo que se traduce en una
disminución del peso molecular del proteoglicano
(Hardingham y Bayliss, 1990; Maroudas y col., 1998).

Por otro lado, existen antecedentes del efecto
condroprotector de los esteroides sexuales y de su acción
sobre el desarrollo de
los cartílagos y la formación de los huesos
(Räsänen y Messner, 1999). Se ha demostrado que la
castración de ratones provoca la degradación
acelerada del cartílago articular, efecto que se revierte
por la
administración de andrógenos a niveles
fisiológicos. También se ha observado, in vitro,
que las hormonas
sexuales reducen la pérdida espontánea de
proteoglicanos, pero no interfieren con los efectos de
interleuquina – 1 (IL- 1) en cultivos de cartílago (Da
Silva y col., 1993). Se describe que el mecanismo de
acción de las hormonas sexuales sobre los
cartílagos se debería a la combinación de
efectos directos e indirectos. El efecto directo se
relacionaría con la detección de receptores para
17-ß estradiol en el cartílago de diferentes
especies animales (Sylvia
y col., 1998, Räsänen y Messner, 1999), mientras que el
efecto indirecto se debería a que las hormonas sexuales
regulan la secreción de la hormona de crecimiento y del
factor de crecimiento tipo insulínico tipo I (IGF-I)
(Nasatzky y col., 1993).

En este trabajo se
plantea medir la concentración de GAGs distintos del
ácido hialurónico (condroitín y
queratán sulfato) del líquido sinovial de la
articulación metacarpofalángica equina normal como
una forma de evaluar la pérdida de componentes de la MEC
del cartílago a través de la edad y considerando
caballos castrados y yeguas.

MATERIAL Y METODOS

Se seleccionaron 78 articulaciones
metacarpo-falángicas de igual número de equinos
mestizos de un matadero de la región Metropolitana (Comuna
de La Pintana), cuyas edades se determinaron por
cronometría dentaria. Para realizar este trabajo se
escogieron los siguientes grupos etarios
indicándose el número de caballos castrados y de
yeguas:

El criterio utilizado para escoger estos grupos etarios
fue el de establecer un paralelo con edades importantes en los
caballos fina sangre de
carrera. Así, el primer grupo
representa el inicio de la actividad deportiva; el segundo,
corresponde al término de la madurez fisiológica
del sistema
músculo–esquelético; el tercero, el retiro de
la actividad deportiva, mientras que el cuarto grupo tiene por
finalidad evaluar lo que sucede en etapas más avanzadas.
Debido al escaso número de machos enteros encontrados en
matadero, se descartó su utilización en este
trabajo.

De cada articulación se obtuvo líquido
sinovial mediante artrocéntesis utilizando material
estéril y luego se realizó la disección con
la finalidad de seleccionar las articulaciones. Se clasificaron
como normales aquellas articulaciones cuyo cartílago era
de color blanco
nacarado, con su superficie lisa y brillante, sin líneas
de roce o zonas de erosión.
Además, la membrana sinovial no debía presentar
signos de
congestión, mientras que el líquido sinovial
debía ser de color amarillo claro, transparente, sin
flóculos ni trazas de material sanguinolento,
descartándose los líquidos sinoviales con alguna
alteración visible.

El líquido sinovial obtenido se mantuvo en hielo
y luego se realizó su procesamiento en el laboratorio,
para lo cual, se centrifugó a 950 x g durante 20 minutos a
4 ºC. Con los sobrenadantes obtenidos se realizaron las
siguientes pruebas,
destinadas a evaluar la normalidad del líquido sinovial:
la prueba del coágulo de mucina que es cualitativa (Van
Pelt, 1974; Croxatto, 1993) y la determinación de la
concentración de proteínas
Lowry y col., 1951). Se consideraron normales aquellos
líquidos sinoviales con un mayor grado de
compactación del coágulo de mucina y con una
concentración de proteínas inferior a 15 mg/ ml
(Croxatto,1993; Plaza de los Reyes, 1997). Finalmente, los
sobrenadantes se conservaron congelados a – 20ºC hasta las
determinaciones de GAGs.

La medición de GAGs totales (GAGsT) y de GAGs
distintos del ácido hialurónico (GAGsS) se
realizó por el método
colorimétrico de Bartold y Page (1985), modificado por
Croxatto (1993). La curva estándar se realizó
utilizando soluciones de
condroitín sulfato, queratán sulfato y ácido
hialurónico al 0.1%, determinándose la absorbancia
a 678 nm. La determinación se realizó en
triplicado, aplicando 20 µl de líquido sinovial
diluído 1:10 en superficies similares (5 cm2)
de membranas de acetato de celulosa
(Sepraphore III, Gelman). Después de secar a temperatura
ambiente, se
incubó durante 30 minutos en solución colorante de
Alcian Blue que contiene MgCl2 0.05 M para la
determinación de GAGsT y de 0.3 M para la
determinación de GAGsS. En esta última
condición se impide la tinción del ácido
hialurónico, pero se conserva la afinidad de Alcian Blue
por condroitín y queratán sulfato. Después
se eliminó el exceso de colorante de la membrana no fijado
a los GAGs y, finalmente, se separaron los trozos de membrana
correspondientes a cada muestra, que
fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) para liberar
el complejo GAG – cromóforo. Como blanco se
utilizó el mismo procedimiento con
una porción de membrana de igual superficie, pero sin
muestra. Una vez disuelta la membrana se determinó su
absorbancia a 678 nm, expresándose los resultados como mg
de GAGsT o de GAGsS/ ml de líquido sinovial. Para
determinar las concentraciones de GAGs, se utilizó una
curva estándar en un rango de concentraciones de 5 a 15
µg de condroitín y queratán
sulfato.

Finalmente se realizó la estimación del
contenido de ácido hialurónico al calcular la
diferencia entre GAGsT y GAGsS. Los resultados se expresaron como
la media ± la desviación estándar,
realizando un análisis estadístico que
utilizó un experimento factorial de 4 x 2 usando un p <
0.05, para determinar la influencia de los factores edad y sexo
sobre las variables en
estudio. El modelo
estadístico fue el siguiente (Snedecor,1964):

Xijk = µ + Ei +Sj
+ (ES)ij + ijk

• µ = media poblacional
• Ei = efecto edad
• Sj = efecto sexo
• (ES)ij = interacción de los efectos sexo y edad
• ijk = error aleatorio

RESULTADOS

El contenido de GAGsT del líquido sinovial
(cuadro 2) corresponde a los GAGs liberados desde la MEC del
cartílago articular y al ácido hialurónico
sintetizado por los sinoviocitos de la membrana sinovial, que
constituye a su vez, el componente cuantitativamente más
importante entre los diferentes GAGs del líquido sinovial.
No se detectaron diferencias (p > 0.05) entre caballos
castrados y yeguas en cada grupo de edad. Sin embargo, al
analizar sólo el factor edad, se encontró una
disminución en el grupo de mayor edad (1.71 ± 0.79
mg/ml), que fue menor (p< 0.05) comparada con el grupo de 6 a
8 años de edad (3.39 ± 1.93 mg/ml), que presenta la
mayor concentración de GAGsT.

Respecto a los GAGsS (cuadro 3), que corresponden
basicamente a condroitín sulfato y queratán
sulfato, no se encontraron diferencias (p > 0.05) entre
caballos castrados y yeguas en cada grupo de edad. Sin embargo,
al comparar el promedio final de caballos castrados (0.48
± 0.28 mg/ml) y de yeguas (0.34 ± 0.15 mg/ml), se
encontró una diferencia (p < 0.05), que se
podría relacionar con una mayor actividad
catabólica de la MEC del cartílago articular en los
caballos castrados. Además, al considerar el factor edad,
se encontró una tendencia a la disminución de estos
GAGs en el líquido sinovial del grupo de mayor edad, lo
que se podría asociar a una menor velocidad de
recambio molecular de la MEC del cartílago
articular.

Finalmente, en el cuadro 4 se muestra la
estimación del contenido de ácido
hialurónico del líquido sinovial:

(a) y (b) representan diferencias
estadísticamente significativas (p < 0.05).

(a) y (b) representan diferencias
estadísticamente significativas (p < 0.05).

(a)y (b) representan diferencias
estadísticamente significativas (p < 0.05).

El contenido de ácido hialurónico
mostró una tendencia similar a la concentración de
GAGs totales, no detectándose diferencias entre caballos
castrados y yeguas en cada grupo de edad (p > 0.05). Sin
embargo, al comparar el promedio por edad se encontró una
diferencia (p < 0.05) entre los grupos de mayor edad, con una
disminución de la concentración de ácido
hialurónico en el grupo mayor de 10
años.

DISCUSIÓN

La mayor parte de los trabajos que relacionan la
detección de moléculas de la MEC del
cartílago articular, ya sea en el líquido sinovial,
en el plasma sanguíneo o en la orina, tienen como objetivo
la caracterización de la patología articular. En
este trabajo se ha planteado caracterizar la pérdida de
estos componentes en articulaciones metacarpofalángicas
normales a través de la edad e incluyendo las diferencias
entre caballos castrados y yeguas, dados los antecedentes de la
participación de las hormonas sexuales sobre el metabolismo
del cartílago (Bai y col.,1976; Thonar y col., 1985; Da
Silva y col., 1993; Nasatzky y col, 1993; Da Silva y Willoughby,
1994).

El contenido de GAGsT del líquido sinovial,
constituído básicamente por condroitín
sulfato, queratán sulfato y ácido
hialurónico, fue similar para caballos castrados y yeguas.
Sin embargo, se encontró una disminución (p
<0.05) en el grupo de mayor edad comparada con el grupo de 6 a
8 años. Además, al comparar el perfil de GAGsT con
el de ácido hialurónico, se aprecia que son muy
semejantes, debido a la importante contribución del
contenido de ácido hialurónico sobre la
concentración de GAGs totales. Se desprende de esta
comparación que el contenido de GAGsT y de ácido
hialurónico es menor en el grupo de mayor edad, lo que
podría relacionar el aumento de la edad con una menor
capacidad para sintetizar ácido hialurónico por los
sinoviocitos de la membrana sinovial, o bien, a una mayor
actividad de enzimas hialuronidasas, que son fenómenos
descritos en procesos
patológicos (Tulamo y col., 1996), lo que podría
predisponer finalmente a un mayor daño del
cartílago articular.

Con respecto a los GAGsS, que corresponden
principalmente a moléculas propias de la MEC del
cartílago y cuyo contenido en el líquido sinovial
puede reflejar el recambio molecular de esta matriz, no se
encontraron diferencias por edad. Sin embargo, se encontró
diferencia (p< 0.05) entre caballos castrados y yeguas, que se
podría relacionar con el mayor catabolismo de la MEC del
cartílago articular asociado a la castración y a la
consiguiente ausencia de esteroides sexuales. Este resultado es
coincidente con lo descrito por Da Silva y col. (1993), que
indica que la castración de ratones aumenta la velocidad
de degradación del cartílago articular.
También se ha demostrado, que en los conejos castrados
disminuye la síntesis de las enzimas involucradas en la
síntesis de GAGs y que la administración de testosterona produce un
incremento de la actividad de esas enzimas. Por el contrario, las
enzimas involucradas en la degradación de GAGs como son
catepsina y hialuronidasa se incrementan en los conejos castrados
y se disminuyen con la administración de testosterona (Bai y col.,
1976). Además, se ha descrito el efecto condroprotector de
los esteroides sexuales en las hembras. Así, en cultivos
de condrocitos de ratón la administración de 17
-ß estradiol estimula la diferenciación de
condrocitos (Nasatzky y col., 1993). Por otro lado, existen
antecedentes de que la artritis aumenta su incidencia en mujeres
en el período de la menopausia, cuando disminuyen los
niveles de estrógenos (Da Silva y Willoughby,
1994).

En los caballos castrados, así como en las
yeguas, se encontró una tendencia a la disminución
de los GAGsS en los grupos de mayor edad, lo que se podría
asociar con una menor velocidad de degradación de la
matriz extracelular del cartílago articular a
través de la edad y, por ende, con una menor
liberación de estos componentes hacia el líquido
sinovial (Platt, 1996; Todhunter, 1996; Brama y col., 1998) o
bien, con una síntesis de moléculas de
proteoglicanos de menor peso molecular en los individuos de mayor
edad (Hadingham y Bayliss, 1990; Maroudas y col.,
1998).

Con el objetivo de caracterizar el recambio de la MEC
del cartílago, se han realizado otros estudios que han
utilizado anticuerpos monoclonales para detectar la
concentración de queratán sulfato en el
líquido sinovial y en el plasma sanguíneo,
encontrándose valores de
0.02 mg/ml (20.6 µg/ml) en el líquido sinovial
(Fuller y col., 1996) y de 200 ng/ml (0.2 µg/ml) en el
plasma sanguíneo de equinos clínicamente normales
(Todhunter y col., 1997). En este último caso, se
observó que las concentraciones plasmáticas de
queratán sulfato eran más altas en cuadros de
sinovitis y fractura en chip, mientras que en los casos de
enfermedad degenerativa articular no se apreciaron diferencias
con respecto a los equinos normales, a pesar de que se ha
sugerido por Thonar y col., (1985) la posible utilidad de esta
técnica para el diagnóstico de la enfermedad degenerativa
articular generalizada. En estos trabajos se ha escogido la
detección del contenido de queratán sulfato, debido
a que sería un mejor marcador de la destrucción del
cartílago articular ya que el condroitín sulfato se
encuentra en otros tejidos
además del cartílago, como es la cápsula
articular (Todhunter y col., 1997). Sin embargo, dado que las
concentraciones de queratán sulfato son muy bajas en los
fluidos biológicos, se requiere de anticuerpos de mayor
sensibilidad y especificidad para este GAG (Okumura y Fujinaga,
1998).

Se hace necesario comparar estos resultados con los de
machos enteros para conocer mejor el efecto de los esteroides
sexuales sobre este recambio. Los resultados apoyan la idea de
evaluar todos los factores que están comprometidos en este
proceso
fisiológico, con el objetivo de que esta metodología pueda ser de utilidad en el
futuro, para el diagnóstico y pronóstico de los
procesos articulares.

CONCLUSIONES

La concentración de GAGsT y por ende de
ácido hialurónico del líquido sinovial, es
menor en los equinos mayores de 10 años, tanto en caballos
castrados como en yeguas.

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