Efecto de la glucosa sobre la expresión aeróbica de una fusión de operón genómica moa::lac en Escherichia coli K12
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Resumen: Los operones moa y moe de
Escherichia coli determinan la biosíntesis de la molibdopterina, en las
primeras etapas del metabolismo
del molibdocofactor, MoCo. En estudios previos usando una
fusión
transcripcional, las condiciones de cultivo modularon el nivel de
expresión del operón moa y el crecimiento a
expensas de glucosa lo
redujeron. Este último efecto se investigó en el
presente trabajo,
realizando cinéticas aeróbicas de crecimiento y
actividad enzimática βGal. La glucosa ejerció una
represión transitoria que se acentuó con el
tiempo de
cultivo y retardó el comienzo de la expresión
máxima; además el nivel de expresión
disminuía al aumentar la concentración de ese
azúcar.
La represión permanente fue severa durante los primeros 90
minutos, pero disminuyó a lo largo del crecimiento
exponencial; en presencia de AMPc exógeno, el nivel de
expresión alcanzado incrementó parcial y
tardíamente. Los resultados demostraron que la glucosa
reprime la expresión transcripcional de a fusión
moa::lac. Además, permiten proponer un circuito de
control positivo,
cuya eficiencia
incrementa con el crecimiento del cultivo donde el complejo
regulador AMPc-CAP actuaría cuando se alcanza la fase
estacionaria.
Palabras clave: Regulación MoCo;
expresión moa::lac; represión
catabólica moa; glucosa moa.
Abstract: Glucose effect on the
aerobic expression of a genomic moa::lac
operon fusion in Escherichia
coli K12.
In Escherichia coli, the moa and
moe operons determine the molybdopterin biosynthesis
during the first stages of the molybdocofactor metabolism, MoCo.
In previous studies by using a transcriptional fusion, the
expression level of the moa operon was modulated by the culture
conditions and reduced by growing at the expense of glucose. In
the present work, this later effect was researched by monitoring
aerobic kinetics of both: growth and enzimatic βGal activity. The glucose carried out a
transient repression which was prominent with the culture time
and delayed the start of the maximum expression; in addition, by
increasing that the sugar concentration the expression level was
decreased. During the first 90 minutes, the permanent repression
was strong but decreased along the exponential growth; in the
presence of cAMP exogenous, the expression level was partial and
lately increased. The results demostrated that glucose repress
the moa::lac fusion transcriptional expression. In
addition, they allow to propose a positive control circuit which
efficence is increased with the culture growth, and where the
CAP-cAMP regulatory complex could act when the stationary phase
is reached.
Key words: MoCo regulation; moa::lac expression;
moa catabolic repression; moa glucose.
INTRODUCCIÓN
El efecto represor de la glucosa en Escherichia
coli K12 fue reportado originalmente sobre la
biosíntesis de la 13galactosidasa ('3Gal.) por Monod
(1949). Recibió el nombre de represión
catabólica por Magasanik (1961), quien posteriormente lo
explicó a través de tres mecanismos distintos: i.
Exclusión del inductor desde el interior celular, u.
Represión fuerte pero transitoria, cuando la glucosa es
añadida a células
creciendo con una fuente de carbono
diferente (represión transitoria) y iii. Represión
débil pero permanente, durante el crecimiento prolongado
con glucosa (represión catabólica).
La adición de AMPc (5mM) puede antagonizar
en su totalidad los efectos medido por las represiones
transitoria y permanente (Kaalyuzhnaya y Koribov 1991, Ullman y
Monod 1968). Bajo condiciones fisiológicas, el AMPc es
sintetizado por la célula
y modula directamente la actividad de la proteína CAP
(proteína activadora del catabolito) (Brown y Crothers
1989). El complejo AMPc-CAP generalmente actúa como
elemento de control positivo favoreciendo la expresión
transcripcional (deCrombrugghe 1984, Utsumi 1989), pero
alternativamente puede ejercer un efecto negativo (Adhya y Garges
1982, Moore y Boyle 1991) o ambos (Gerlach et al. 1991,
Huang et al. 1992).
En ciertos casos, se ha evidenciado un efecto indirecto
ejercido por la glucosa y que puede enmascararse
fisiológicamente al cambiar las condiciones
específicas de cultivo (Dobrogosz 1965, Lee y
Dobrogosz 1983, Okinaka y Dobrogosz 1967, Warnes et al.
1991). Además, el AMPc puede actuar parcialmente (Roy
1983) y no parece ser el único efector que participa en la
liberación de la represión catabólica (Lee y
Dobrogosz 1983).
La represión por glucosa está asociada con
el metabolismo de diferentes azúcares (Irani et al.
1989, Magasanik 1970) y con procesos
celulares muy diversos (Dobrogosz 1965, Evasn 1991; Gerlach et
al. 1991, Jamieson 1986, Lee y Dobrogosz 1983, Meighen 1988,
Moore y Boyle 1991, Okinaka y Dobrogosz 1967, Pugsley 1981, Ralph
1983, Scnetz y Rak 1990, Utsumi 1989, Winkelman y Clark
1986).
Estudios realizados con una fusión
transcripcional, evidenciaron que la expresión del
operón moa en E. coli es susceptible al
efecto negativo de la glucosa (Ortega de L. 1985), sugirieron que
el metabolismo del molibdocofactor, MoCo, también
podía responder a ese mismo control (Ortega de L. 1985),
ya que los operones moa y moe (Rivers et al.
1993, Shanmugan et al. 1992) determinan la síntesis
de la pterina, durante las etapas iniciales de su metabolismo
(Johnson y Rajagopaln 1987). El MoCo está presente en
especies bacterianas (Stewart 1988) y en organismos eucariotas
(Johnson 1989); en el primer caso es requerido para la
activación de diferentes apomolibdoenzimas de
oxidorreducción (Giordano 1990) y una de ellas es la
nitrato reductasa A (NRA) que actúa como aceptor final de
electrones en la respiración anaeróbica del nitrato
(Stewart 1988).
La expresión de la fusión transcripcional
antes referida también es susceptible a la
concentración incrementada de ciertos efectores que
controlan la biosíntesis de la NRA (Ortega de L. y
Díaz 1995).
Los niveles de expresión máxima son
alcanzados durante el crecimiento aeróbico (Ortega de L.
1985), contrario a lo reportado para una fusión
traduccional (Baker y Boxer 1991), y pudiera atribuirse a la
participación de controles a nivel transcripcional y
traduccional (Ortega de L. 1994).
En el presente trabajo se caracterizó el control
negativo mediado por la glucosa sobre la expresión de la
fusión moa::lac, realizando cinéticas
aeróbicas. La represión transitoria fue evaluada
cuantitativamente ensayando además diferentes
concentraciones de glucosa y la represión permanente, en
presencia y ausencia de AMPc exógeno.
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