Efecto de la glucosa sobre la expresión aeróbica de una fusión de operón genómica moa::lac en Escherichia coli K12 (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa bacteriana. Se utilizó
un derivado de la CSH41 de E. coli K 12, identificado como
OM86: NitGas- Lac+ y contiene la fusión de
operón genómica [moa::Mu (lac)) MA25 (Ortega
de L. 1982; Ortega de L. 1985). Los genes lac fusionados al
promotor pmoa es una estrategia que
permite estudiar el control
transcripcional del operón moa, cuantificando los
niveles de expresión del gen lacZ que codifica para la
enzima βgalactosidasa
(βGal) (Casadaban y Cohen
1979).

Medios y condiciones de cultivo. La
composición del medio mínimo fue descrita por
Miller (1972). Las concentraciones de galactosa (Gal), glucosa (Glu)
y AMPc (3 '-5' AMP cíclico) (Sigma A-6885) se
indicaron en las cinéticas. Las bacterias se
incubaron a 300 C. Los cultivos aeróbicos crecieron con
agitación fuerte, en fiolas de 250 ml conteniendo 10 ml de
medio.

Ensayos enzimáticos. Se utilizaron
cultivos aeróbicos, porque muestran los mayores niveles de
expresión del gen lacZ fusionado al promotor pmoa (Ortega
de L. 1985) y la represión por glucosa es más
severa (Dobrogosz 1965, Lee y Dobrogosz 1983, Okinaka y Dobrogosz
1967). La actividad BGal se determinó
colorimétricamente siguiendo la hidrólisis del ONPG
en células
permeabilizadas con tolueno (Miller 1972) que fueron tratadas con
cloranfenicol (50 ug/ml) y mantenidas en frío; se
utilizó medio mínimo en un lugar del tampón
Z y la densidad celular
se medió a una absorbancia A550.

Los valores fueron
reproducibles en al menos tres experimentos
independientes, con un porcentaje de desviación cercano a
10.

RESULTADOS

Cinética de represión transitoria por
glucosa en la expresión aeróbica de la
fusión moa::lac Previamente se
observó que el crecimiento en medio mínimo a
expensas de glucosa reduce los niveles de expresión de la
fusión de operón genómica moa::lac
(Ortega de L. 1985). Por lo tanto, fue de interés
estudiar el fenómeno de represión transitoria por
glucosa a través de cinéticas aeróbicas e
incremento al doble la concentración final de dicho
azúcar.

La expresión de la fusión fue estimada
considerando la biosíntesis acumulativa de
βGal y, a diferencia del cultivo control
que se mantuvo creciendo con galactosa, la adición de
glucosa disminuyó la expresión durante un tiempo
prolongado de la fase exponencial (Fig. 1).

También se ensayaron cuatro concentraciones
crecientes de glucosa y las cinéticas se siguieron durante
un tiempo más prolongado (Fig. 2A y 2B).

Una curva de crecimiento diáuxico (crecimiento
bifásico) fue observada claramente en los cuatro cultivos
paralelos y es atribuible al crecimiento en presencia de glucosa
y galactosa (Epstein 1966), debido a la exclusión del
inductor (la galactosa) más que a la represión
catabólica del operón gal (Joseph et al.
1981). El período transitorio de suspensión del
incremento en la densidad celular, intermedio entre las dos fases
de crecimiento exponencial (período de latencia), es una
etapa adaptativa (Epstein 1966) que refleja la síntesis
de las enzimas
requeridas para utilizar la galactosa, una vez que la
concentración de glucosa es limitante (Monod
1949).

En esos cultivos paralelos la expresión de la
fusión fue estimada considerando la biosíntesis
diferencial de la βGal y la misma se mantuvo en un nivel
basal durante el crecimiento exponencial con glucosa,
indistintamente de su concentración. Sin embargo, justo al
iniciarse el período de latencia, se disparó una
etapa de expresión máxima y, de allí en
adelante, cuando las células iniciaron su crecimiento
exponencial a expensas de galactosa (segunda fase del crecimiento
diaúxico), la cinética fue modulada
diferencialmente de tal forma que los mayores niveles alcanzados
se correspondieron con las menores concentraciones ensayadas de
glucosa (Fig. 2A).

Represión permanente y efecto
antagónico del AMPc en la expresión aeróbica
de la fusión moa::lac.

Una vez demostrada la represión transitoria
mediada por glucosa, la etapa subsiguiente fue evaluar la
represión permanente. La cinética de
expresión aeróbica de la fusión bajo estudio
fue estimada considerando los valores
relativos de biosíntesis acumulativa de βGal, respecto al control (Fig.
3).

Pudo observarse que, aún en presencia del AMPc
exógeno, la glucosa ejerció un efecto negativo y
prolongado durante el crecimiento exponencial, ya que los valores
relativos fueron inferiores a la unidad. El efecto resultó
fuertemente severo durante los primeros 90 minutos, pero a partir
de entonces, los niveles comenzaron a incrementar y los valores
máximos se alcanzaron cercano a la fase estacionaria (A550
= 0,9).

El AMPc ocasionó una disminución muy
ligera en el incremento celular durante el crecimiento
exponencial, tal como se ha reportado en otros sistemas (Ralph
1983). El efecto antagónico se manifestó
tardíamente después de una noche de
incubación aeróbica (fase estacionaria prolongada)
(Tabla 1), cuando el cultivo mostró un valor
acumulativo cercano a 53% respecto al control, y el mismo
correspondió a un 60% (0,28/0,47x 100) de antagonismo
frente a la represión mediada por la glucosa.

Las bacterias fueron crecidas a expensas del GLU
(2mg/ml), en presencia y ausencia del AMPc (5mM). El cultivo
control fue crecido con Gal (2 mg/ml).

Crecimiento celular Nivel acumulado durante una noche de
crecimiento aeróbico.

Variación relativa respecto al control, calculada
como unidades acumulativas / 500 Porcentaje del efecto respecto
al control, calculado como porcentaje de unidades menos
100.

DISCUSIÓN

La sensibilidad a la represión catabólica
se ha reportado para diferentes sistemas respiratorios
relacionados con la reducción de aceptores finales de
electrones como hidrógeno (Jamieson et al. 1986),
oxigeno y
nitrato (Dobrogosz 1965, Lee y Dobrogosz 1983), asparagina
y aspartato (Winkelman y Clark 1986).

Asimismo, la sensibilidad al efecto negativo mediada por
glucosa se reportó para el operón moa que participa
en la reducción anaeróbica del nitrato y el
hidrogeno, a
través de la biosíntesis del molibdocofactor, MoCo
(Stewart 1988). Este efecto ocurre bajo condiciones
aeróbicas y anaeróbicas de crecimiento,
según estudios realizados con una fusión
transcripcional genómica moa::lac, donde el gen
lacZ se expresa bajo el control del promotor pmoa (Ortega deL.
1985).

Con el propósito de caracterizar el efecto
glucosa sobre la expresión del operón moa,
se realizaron cinéticas aeróbicas estudiando el
comportamiento
de la referida fusión transcripcional. La expresión
aeróbica transcurrió según un proceso
bifásico (Ortega de L. 1985), cuyo desarrollo
normal estuvo influenciado por el crecimiento a expensas de la
glucosa y respondió diferencialmente a los
fenómenos de represión transitoria y permanente;
también se evidenció un papel medianamente
antagonista y tardío por parte del AMPc
exógeno.

Cuando se ensayaron concentraciones decrecientes de
glucosa, la aparición de los niveles máximos de
expresión estuvo asociada con la limitación de
glucosa en el medio de cultivo y el tiempo de latencia. Las
condiciones fisiológicas que le permitieron a las
bacterias recuperarse más rápidamente del efecto
glucosa, disminuyeron la eficiencia de la
expresión máxima de la fusión bajo
estudio.

La represión por glucosa no llegó a
bloquear totalmente la expresión, similar a lo reportado
para otros genes (de Crombrugghe 1984; Monod 1949), y
resultó ligeramente menos severa que cuando las
células provenían de un subcultivo crecido
aeróbicamente durante una noche (fase estacionaria
prolongada) (Ortega de L. 1985). Por lo tanto, el estado
fisiológico del cultivo parece desempeñar un papel
de control sobre la expresión aeróbica de moa y la
capacidad de las células bacterianas para recuperarse
eficientemente de la represión mediada por el metabolismo de
la glucosa.

No obstante, el efecto represor de la glucosa se
manifestó con menor severidad respecto al reportado para
el gen lacZ, cuando se expresa a partir de su promotor nativo
plac (Monod 1949, Magasanik 1970). También fue diferente
al reportado para otros genes procariotas no relacionados
funcionalmente con el metabolismo del MoCo y que son sensibles a
la represión catabólica; por ejemplo el gen cia que
codifica para la colicina Ib, lo cual fue evidenciado estudiando
la expresión de la fusión cia::lac (Pugsley
1981).

Las condiciones ensayadas durante la presente investigación permiten inferir que la
expresión transcripcional de moa en una cepa silvestre de
E.

coli no depende totalmente del control positivo
mediado por el complejo AMPc-CAP y posiblemente estaría
controlada por más de un proceso distinto. Por ejemplo,
podrían participar dos mecanismos de control positivo,
autorregulación e inducción por el complejo AMPc-CAP, como
fue propuesto para el gen luxR de V. Harveyi (Meighen 1988) y el
gen represor cytR de E. coli (Gerlach et al. 1990).
Otra alternativa a considerar, es que el complejo AMPc- CAP
funcione en forma dual como activador y correpresor, así
reportado para el gen tsx de E. coli (Gerlach et
al. 1991).

Evidencias acumuladas estudiando diferentes operones
parecen indicar que la represión catabólica
normalmente puede ser ejercida por controles complejos que
implican otros mediadores distintos al AMPc. Así, por
ejemplo, cada vez es mayor el número de genes reportados
donde el efecto del AMPc es reducido y posiblemente la glucosa
actúe indirectamente sobre su expresión
transcripcional, como es el caso del fnr y los genes sometidos a
su regulación (Spiro y Guest 1990). En la represión
por glucosa de genes anaeróbicos pudieran estar
participando coefectores nucletídicos potenciales, como el
NaDh o la acetil-coenzima A; además fue propuesto un
balance comprometedor entre los sistemas metabólicos de
oxidorreducción y el flujo reducido de metabolitos
(Dobrogosz 1965, Stewart 1988, Spiro y Guest
1990).

AGRADECIMIENTOS

Me complace agradecer al Dr. J. DeMoss (Universidad de
Texas, Dpto. de Bioquímica
y Biología
Molecular, Houston, USA) sus valorables comentarios sobre esta
investigación. Al CDCHTULA (Consejo de Desarrollo
Científico, Humanístico y Tecnológico de la
Universidad de Los Andes) por el soporte financiero.

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