Producción in vitro de embriones bovinos: suplementación de los medios de cultivo con suero (página 2)

CULTIVO EMBRIONARIO

Componentes de los medios de
cultivo: parámetros biofísicos y elementos
inorgánicos. Varios autores (Menezo y Khatchadourian
1991, Palasz 1996) coinciden en que los parámetros
biofísicos y los elementos inorgánicos más
importantes a controlar en los medios de cultivo embrionario son
los siguientes:

• Osmolaridad. Teniendo en cuenta los valores
observados en las secreciones uterinas, podría asumirse
que lo óptimo sería 280 ± 20 mOsm/Kg. Sin
embargo, existe evidencia que indica que valores de
alrededor de 245 mOsm/Kg favorecerían el desarrollo
embrionario (Duque y col 2003)b.

• pH. La
mayoría de los embriones de mamíferos cultivados in vitro
desarrollan en pH neutro o ligeramente alcalino,
encontrándose los mejores resultados entre 7,2 y
7,6.

• CO2 y O2. La fase gaseosa
más utilizada es aquella compuesta por 5% CO2
en aire para la
maduración ovocitaria y fertilización, y 5%
O2, 90% N2 y 5% CO2 para el desarrollo
embrionario. Estas son similares a las registradas en el oviducto
de algunas hembras mamíferas.

• El fluido oviductal bovino y ovino se caracteriza
por bajos niveles de Na y altos niveles de K, comparados con los
niveles plasmáticos. Estos dos elementos son
cuidadosamente balanceados al formular los medios de cultivo,
así como: magnesio, calcio, bicarbonato, sulfatos y
fosfatos.

• El agua es el
componente que participa en mayor proporción en la
formulación de cualquier medio de cultivo y su grado de
pureza está fuertemente relacionado con el desarrollo
embrionario (Marquant- Leguienne y Humblot 1998). Las fuentes de
agua
utilizadas han sido el agua de lluvia, la obtenida por sucesivas
destilaciones (Boone y Shapiro 1990), o actualmente la producida
por sistemas de
purificación que utilizan el principio de ósmosis
reversa. En estos últimos equipos, el grado de pureza del
agua puede ser controlado mediante la determinación de su
resistencia al
paso de la corriente
eléctrica (cuanto mayor sea esta, mayor será su
pureza). La mayor resistencia ofrecida es 18,3 megaohms-cm a
25°C.

Elementos orgánicos. Actualmente, existe
una gran cantidad de información, no siempre coincidente,
referida al efecto de ciertas hormonas,
factores de crecimiento y compuestos macromoleculares, sobre el
desarrollo embrionario. Sin embargo, dos componentes son
constantes en las formulaciones finales de los medios de cultivo
utilizados corrientemente en la producción in vitro de embriones.
Estos son:

I. FUENTE DE ENERGIA

Las fuentes de energía más utilizadas en
los medios de cultivo de embriones son, en general, el lactato,
el piruvato y la glucosa
(Palasz 1996).

Se ha demostrado que durante los primeros estadios,
antes de la activación del genoma embrionario, los
embriones utilizan preferentemente piruvato, lactato y glutamina
como fuente de energía, aumentando considerablemente la
utilización de glucosa en estadios más avanzados de
desarrollo (Reiger y col 1992, Gardner 1998, Krisher y Bavister
1998, Lane y Gardner 2000, Thompson, 2000).

La falta de utilización de la glucosa durante los
primeros estadios estaría dada por la falta de actividad
de la enzima fosfofructoquinasa (Gardner 1998). Esta enzima
acelera la glucólisis catalizando la formación de
fructosa 1-6 bifosfato a partir de fructosa 6 fosfato, y se
encuentra controlada alostéricamente por el cociente
ATP-ADP, particularmente alto en este período (Gardner
1998). En esta etapa, la adición de glucosa a los medios
de cultivos no solamente no sería aprovechada, sino que, a
su vez, generaría un efecto inhibitorio sobre el
desarrollo embrionario (Takahashi y First 1992). Sin embargo, en
embriones bovinos a partir del estadio de 8-16 células
(Rieger y col 1992) y en respuesta a una alta demanda de
energía necesaria para la compactación, y la
formación y expansión del blastocele (Gardner
1998), el cociente ATP-ADP podría disminuir, y con ello,
la inhibición ejercida sobre la enzima mencionada, con lo
cual aumentaría el consumo de
glucosa. Este metabolito también participa en la síntesis
de precursores de ácidos
nucleicos y de lípidos
(Gardner y Lane 1998) y su disponibilidad sería importante
durante la eclosión fuera de la zona pelúcida
(Menezo y Khatchadourian 1991).

Con respecto a los lípidos, poco se sabe acerca
de la importancia que tendrían en la producción de
energía durante el desarrollo embrionario temprano
(Thompson 2000). Sin embargo, en los últimos años
se ha debatido la posibilidad de mejorar la viabilidad de los
embriones criopreservados a través de la adición de
ciertos componentes lipídicos a los medios de cultivo,
específicamente ácido linoleico no como fuente
energética, sino como fluidificador de las membranas
plasmáticas (Imai y col 1997, Hochi y col
1999).

II. FUENTE DE PROTEINA

Aminoácidos. Varios autores (Gardner y
Lane 1998, Lee y col 2004) indicaron que los aminoácidos
se encuentran dentro de los elementos más importantes como
participantes de la regulación del desarrollo embrionario.
Estos elementos serían utilizados como fuente de
energía, como buffer intracelular (Edwars y col 1998) y
para la síntesis de proteínas,
siendo incorporados por transportadores de membrana
específicos regulados en función
del estadio de desarrollo o en respuesta a señales
externas (Van Winkle 2001).

Se ha demostrado que los aminoácidos no
esenciales favorecerían el desarrollo en estadios
tempranos, mientras que los esenciales harían lo mismo en
embriones de más de ocho células (Gardner 1998,
Thompson 2000, Van Winkle 2001). Este cambio en la
utilización de aminoácidos, pareciera deberse a
requerimientos específicos de las células
embrionarias, en donde las células trofoblásticas,
que dan origen a la placenta fetal, utilizarían
aminoácidos no esenciales y glutamina, mientras que las de
la masa celular interna, que originan al feto,
tendrían preferencia por los esenciales (Gardner y Lane
1998).

Macromoléculas. Usualmente se agrega
suero bovino y/o albúmina sérica bovina (BSA) como
fuente de proteínas a los medios de cultivo embrionario
(Wang y col 1997), aunque los resultados obtenidos tanto en
producción como en sobrevida poscriopreservación
tras su inclusión son contradictorios y motivo de
numerosos estudios. El suero constituye la fracción
líquida resultante del proceso de
coagulación sanguínea, tanto in vivo como
in vitro, y su calidad, en
términos de composición química, depende
usualmente del tipo y estado del
donante (suero fetal bovino (SFB), suero de ternero recién
nacido, suero de novillo o vaca, suero de vaca en celo (SVC)), y
de la partida o lote de formulación (Pinyopummintr y
Bavister 1994) (cuadro 1).

La albúmina es una proteína
plasmática de carácter ácido, soluble en agua, con
un peso molecular aproximado de 69.000, y constituye uno de los
componentes más importantes del suero sanguíneo.
Debido a la presencia de grupos reactivos
en su molécula, puede unirse a diferentes sustancias
(ácidos grasos, hormonas, etc.) y transportarlas en
sangre hasta
sus órganos blanco. Junto con la inmunoglobulina G, son
las proteínas más abundantes del fluido oviductal
(Leese 1988), y su pureza puede variar entre lotes (Kane y Headon
1980, Rorie y col 1994).

Algunos de los efectos benéficos que justifican
la utilización del suero y la albúmina
son:

• Proteger a los embriones en cultivo de sustancias
tóxicas (ej. metales
pesados).
• Aportar factores de crecimiento y ciertas hormonas.
• Reducir la tensión superficial del medio, evitando
que los embriones se adhieran al instrumental (placas de cultivo,
pipetas, tubos, etc.).

Tanto el suero como la BSA tienen un rol similar como
suplemento proteico. Sin embargo, la posible presencia de
elementos no identificados ligados a ambos determinan que algunos
aspectos de su función no sean aún completamente
comprendidos.

Efecto de la suplementación con suero sobre
la cantidad y calidad de los embriones producidos in vitro.
En los últimos años, el suero ha sido objeto de
numerosos estudios, tendientes a definir si su adición es
definitivamente necesaria para mejorar los resultados de
producción in vitro, en función de la
cantidad y calidad de los embriones obtenidos.

Se ha observado que la adición de suero a los
medios de cultivo tiene un efecto bifásico sobre el
desarrollo embrionario, inhibiendo los primeros estadios y
estimulando el desarrollo de mórulas y blastocistos
(Pinyopummintr y Bavister 1994, Thompson y col 1998). Al mismo
tiempo, su
empleo
también se ha visto relacionado con una aceleración
del desarrollo embrionario (Gómez y Diez 2000, Holm y col
2002), asociado a un número mayor de células
embrionarias (Fouladi-Nashta y col 2005) y a una mejora en la
tasa de producción y eclosión (Wang y col 1997,
Gómez y Diez 2000). Sin embargo, otros autores observaron
que, tanto la tasa de producción (Rorie y col 1994, Mucci
y col 2003) como el número de células embrionarias
(Thompson y col 1998, Gómez y Diez 2000, Sung y col 2004)
no fueron afectados por la presencia o ausencia de suero.
Contrariamente, Byrne y col (1999) y Ferguson y Leese (1999)
encontraron una disminución en esta última variable
cuando adicionaron suero en los medios de cultivo.

El suero es considerado un compuesto variable e
indefinido (Gardner y Lane 1998), lo cual genera variaciones en
la composición de los medios utilizados e interfiere con
la repetibilidad de los resultados obtenidos. En este sentido se
han observado diferencias en cuanto a la tasa de
producción entre distintos ensayos
publicados en los cuales se utilizó suero como suplemento
proteico, y esto podría deberse a:

• Utilización o no de cocultivo: Rorie y col
(1994) observaron que el suero producía un efecto positivo
sobre la tasa de producción de embriones sólo si el
cultivo se efectuaba en cocultivo con células
somáticas. Teniendo en cuenta el impacto positivo del
suero sobre el cultivo de células somáticas
(Gardner 1999), puede suponerse que el efecto benéfico de
esta suplementación se ve potenciado a través de su
acción
sobre las células del cocultivo.

• Tipo de suero y momento de su inclusión:
el suero más utilizado es el SFB. Si bien es
difícil concluir acerca de cuáles son los
constituyentes del suero que presentan actividad
embriotrófica, las diferencias mostradas en el cuadro 1
entre dos tipos de suero, en términos de
composición química, pueden determinar una fuente
de variación capaz de tener un impacto significativo en la
producción in vitro de embriones. Puede
observarse que la concentración de glucosa es 6 veces
superior en el suero fetal respecto al del bovino adulto.
Teniendo en cuenta que la utilización de este elemento
aumenta notablemente luego de los primeros 3-4 ciclos de
división celular embrionaria (Rieger y col 1992, Lane y
Gardner 2000, Thompson 2000), estas diferencias podrían
contribuir a las variaciones observadas entre los ensayos. Con
respecto a las proteínas, puede observarse también
que sus concentraciones son superiores en un 85% en el caso del
suero adulto respecto del fetal, y aunque poco se conoce acerca
de la función de proteínas no específicas en
el desarrollo embrionario, su metabolismo
podría producir amoníaco, el cual, dependiendo de
su concentración y del estadio embrionario que afecte,
puede generar diferencias en cuanto a la producción total
de embriones (Hammond y col 2000). En ambos tipos de suero, la
relación proteína/glucosa es distinta y
notablemente superior para el caso del bovino adulto, aunque no
se dispone de información acerca de su posible impacto
sobre el desarrollo embrionario.

• Variaciones en la concentración de
factores embriotróficos: el factor transformante de
crecimiento a (TGF, transforming growth factor) (Brison y Shultz
1997) y el factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF1,
insulin-like growth factor) reducen la incidencia de apoptosis y
aumentan el número de células embrionarias
(Makarevich y Markkula 2002), mientras que el factor de necrosis
tumoral a (TNF, tumor necrosis factor) induce apoptosis y
fragmentación de ácidos nucleicos (Betts y King
2001). Según Byrne y col (1999), la utilización de
suero en los medios de cultivo podría introducir
cantidades variables de
estos factores con efectos positivos y negativos sobre el
desarrollo embrionario y esto podría depender de la
partida, tipo de donante y del procedimiento de
preparación, entre otros (Pinyopummintr y Bavister, 1994).
Todos estos elementos podrían explicar la falta de
consistencia en los resultados de los distintos autores que
utilizaron suero, por lo que Byrne y col (1999) concluyeron que
el efecto embriotrófico del suero es complejo y que son
necesarios más experimentos para
clarificar los componentes específicos que lo
producen.

Algunos efectos negativos que han sido atribuidos al uso
de suero en los medios de cultivo son: alteraciones
mitocondriales (Dorland y col 1994, Abe y col 1999b, Farin y col
2001), excesiva producción de lactato, presencia de
células oscuras y granuladas en la masa celular interna
(Bavister y col 1992, Krisher y col 1999), aumento de
células apoptóticas (Byrne y col 1999), menor
síntesis proteica (Kuran y col 2001) y disminución
de la relación células de la masa celular interna:
células trofoblásticas (Fouladi-Nashta y col 2005)
y del número de complejos de unión entre las
células embrionarias (Shamsuddin y
Rodríguez-Martínez 1994). Además, se
observaron alteraciones durante la preñez en hembras
gestantes de embriones producidos con suero, tales como
alargamiento del período de gestación (Thompson y
col 1995) y nacimiento de crías con peso superior a lo
normal (large offspring syndrome) (Farin y col, 2001).

Los embriones cultivados en presencia de suero presentan
una morfología
diferente comparados con los producidos sin suero (Shamsuddin y
Rodríguez-Martínez, 1994, Gardner, 1999). Algunos
autores observaron que, la suplementación con suero se
encuentra asociada a un menor grado de compactación de las
mórulas (Abe y col 1999b), y que tanto éstas como
los blastocistos adquieren características similares a los
obtenidos in vivo cuando son producidos en medios sin
suero (Thompson 1997, Crosier y col 2001). Esto podría
deberse a alteraciones a nivel de los complejos de unión
intercelulares en respuesta a la suplementación con suero
(Shamsuddin y Rodríguez-Martínez, 1994). Boni y col
(1999) postularon que variaciones en la expresión de ARNm
para la Connexina 43 (Cx43), una proteína que participa en
la formación de las uniones de tipo gap en las
células de los embriones en estadios de
preimplantación, podría explicar algunas de las
diferencias encontradas entre los embriones producidos in
vitro y los obtenidos in vivo o, incluso,
producidos en diferentes medios de cultivo incluyendo la
presencia o ausencia de suero en los mismos. Cada estadio
embrionario se caracteriza por la activación de conjuntos
específicos de genes (Mohan y col 2002). Es así
como, Lazzari y col (2002) y Rizos y col (2003) demostraron que
los embriones producidos in vitro en cultivos
suplementados con suero presentaron alteraciones en la
expresión de genes que desempeñan un rol de
particular importancia durante el desarrollo embrionario
temprano. Una de estas fue precisamente la disminución de
la transcripción del gen que codifica para Cx43, comparada
con los embriones cultivados en un medio libre de
suero.

Efecto del suero sobre la viabilidad de los
embriones criopreservados. ‘Los embriones producidos
in vitro presentan una alta sensibilidad a los procesos de
criopreservación (Leibo y Loskutoff 1993, Pollard y Leibo
1994), siendo las diferencias morfológicas y/o
metabólicas observadas respecto a los obtenidos in
vivo las que parecerían ser las responsables (Massip
y col, 1995). Leibo y Loskutoff (1993) determinaron que la
densidad de
los embriones producidos in vitro es menor que la de los
obtenidos in vivo, y concluyeron que esto se
debería a una mayor relación de lípidos:
proteínas en el caso de los primeros.

La suplementación de los medios de cultivo con
suero se ha relacionado con la acumulación anormal de
gotas lipídicas intracitoplasmáticas (Shamsuddin y
Rodríguez-Martínez 1994, Dorland y col 1994,
Thompson y col 1995, Abe y col 1999ab). La presencia de estas
estructuras en
los embriones bovinos producidos in vitro se ha asociado
a su alta sensibilidad a los procesos de criopreservación
en general, y en los desarrollados en medios de cultivo
suplementados con suero en particular (Abe y col 2002). Basados
en los experimentos de Nagashima y col (1995) efectuados en
embriones porcinos, distintos autores (Murakami y col 1998,
Ushijima y col 1999, Diez y col 2001) reprodujeron la
extracción de lípidos en embriones bovinos
producidos in vitro mediante incubación con
citocalasina (estabilizador del citoesqueleto por
inhibición de la polimerización de filamentos de
actina), centrifugación y remoción por
microcirugía, observando un mayor porcentaje de sobrevida
poscriopreservación en los embriones libres de gotas
lipídicas.

Se ha demostrado que la acumulación de
lípidos intracitoplasmáticos comienza a disminuir a
partir del estadio de mórula, coincidiendo con la
aparición de mitocondrias maduras (Abe y col 1999b),
pudiendo cumplir, de este modo, la función de reserva para
momentos de gran demanda energética, como lo es la
formación del blastocele. Por el contrario, en presencia
de suero, la acumulación lipídica aumenta a partir
del mencionado estadio (Ferguson y Leese 1999). Estos resultados
plantean un interrogante acerca de cuál es el rol de las
gotas lipídicas en el citoplasma de las células
embrionarias, ya que su eliminación no resulta en una
disminución en la tasa de producción, sino que,
además, mejora su calidad en términos de
criorresistencia.

El origen de la acumulación de gotas
lipídicas intracitoplasmáticas en los embriones
producidos in vitro, cultivados en medios suplementados
con suero, actualmente es desconocido, aunque existen dos
teorías
que podrían explicarlo:

• La presencia de suero genera un efecto
deletéreo sobre la estructura
mitocondrial, lo cual, al producir alteraciones
morfológicas y funcionales en esta organela
provocaría una acumulación anormal de gotas
lipídicas producto de
alteraciones en su metabolismo (Dorland y col 1994).

• Teniendo en cuenta la capacidad de
captación de ácidos grasos, fosfolípidos y
triglicéridos por parte de las células
somáticas en cultivo, podría inferirse que la
acumulación de lípidos intracitoplásmicos
por parte de los blastómeros se debería a la
incorporación de lipoproteínas presentes en el
suero adicionado a los medios de cultivo (Thompson y col 1995,
Abe y col 1999b).

Sata y col (1999) refuerzan la segunda hipótesis, al informar que el perfil de
ácidos grasos contenidos en los embriones desarrollados en
medios suplementados con suero fetal bovino es similar al que
caracteriza al suero utilizado, diferenciándose,
además, de los encontrados en los embriones producidos en
medios de cultivo libres de suero. Estos autores concluyeron que
la acumulación de ácidos grasos saturados de cadena
larga e insaturados son de origen sérico.

Diversos autores (Yamashita y col 1999, Cho y col 2001,
Abe y col 2002, Cho y col 2002) obtuvieron mejores tasas de
sobrevida poscriopreservación en embriones producidos en
medios suplementados con BSA y libres de suero,
independientemente del sistema de
criopreservación empleado. De acuerdo con Enright y col
(2000), Massip (2001) y Lonergan y col (2003), la
criopreservación representa un desafío para los
embriones producidos in vitro, capaz de detectar
diferencias de calidad embrionaria que no son evidenciadas
mediante otras evaluaciones.

Si bien no está totalmente claro cuál es
el rol endocelular por el que actuarían la albúmina
y el suero, algunas de sus propiedades físicas
podrían ser reemplazadas mediante la utilización de
sustancias definidas. El uso de polímeros
sintéticos, como el alcohol
polivinílico y la polivinilpirrolidona, es frecuente desde
hace varios años en la producción in vitro
de embriones (Ectors y col 1992, Gardner y Lane 1998). Estos
compuestos han demostrado proveer una buena actividad
surfactante, similar a la albúmina, aunque se ha
encontrado una menor tasa de producción de embriones y
diferencias metabólicas importantes entre embriones
cultivados con o sin estos componentes (Thompson 2000, Orsi y
Leese 2004). Finalmente, se ha observado un menor porcentaje de
gestación logrado con embriones producidos en medios
suplementados con estos compuestos comparado con los obtenidos
con embriones cultivados con suero (Jakobsen y col 1999). Otro
compuesto utilizado con el fin de reemplazar la albúmina o
el suero ha sido el hialuronato, con el cual se han informado
resultados muy alentadores en cuanto a tasa de producción
y sobrevida poscriopreservación (Gardner 1998, Stojkovic y
col 2002).

Actualmente existen en el mercado
compuestos formulados con el fin de remplazar el suero en los
medios de cultivo de distintas líneas de células
somáticas. Entre estos se encuentran el Ultroser
G® (Invitrogen), un sustituto del SFB, y
CPSR-3® (Controlled Process Serum Replacement,
SIGMA), el cual se obtiene por dializado del plasma bovino. Duque
y col (2003a) demostraron que es posible producir
embriones in vitro utilizando estos compuestos, y
observaron que el reemplazo del suero por
Ultroser® disminuyó significativamente la
producción in vitro de embriones bovinos,
mientras que utilizando CPSR-3® no obtuvieron
diferencias en esta variable como tampoco en el número
total de células embrionarias.

Finalmente, los conceptos presentados en esta
revisión sugieren que el empleo de medios de cultivo
libres de suero podría ser beneficioso para mejorar la
calidad de los embriones producidos in vitro. Esto
permitiría progresar en el entendimiento de los
requerimientos embrionarios durante los estadios de
preimplantación, ya que la eliminación de un
compuesto altamente variable e indefinido, como lo es el suero,
posibilitaría comprender la función que
desempeña cada componente incluido en los medios de
cultivo. Además, permitiría evitar las alteraciones
embrionarias (morfológicas y fisiológicas) y
durante la gestación, atribuidas a la utilización
de suero en los medios de cultivo. Por último, una mejora
en la calidad de los embriones producidos permitiría
obtener mejores tasas de gestación, producidas
principalmente por la transferencia de embriones criopreservados,
posibilitando la aplicación comercial en gran escala de esta
biotecnología.

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N Mucci1, J F
Aller1, G G Kaiser1, F
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Alberio1
1 Instituto Nacional de
Tecnología
Agropecuaria, Estación Experimental Balcarce, Laboratorio de
Biotecnología de la Reproducción. Fax:
02266-439101. Casilla de correo 276 (7620) Balcarce,
Argentina.