Uso de marcadores bioquímicos y moleculares en estudios de diversidad genética (página 2)

I. MARCADORES
BIOQUÍMICOS.

a) Proteínas
de reserva en semilla.

En la actualidad existen diversos métodos
analíticos para el estudio de las proteínas de
reserva tales como: centrifugación, cromatografía, análisis de amino ácidos y
electroforesis. A su vez, la electroforesis ha sido desarrollada
en geles de almidón de una dimensión, en geles de
poliacrilamida con o sin Sodium Dodecil Sulfate (PAGE), punto
isoeléctrico (IEF) y poliacrilamida de dos dimensiones.
Entre estas formas, la de mayor uso en estudios de diversidad ha
sido la electroforesis en poliacrilamida vertical (PAGE- SDS) por
presentar una buena resolución de las
proteínas.

El uso de proteínas de almacenamiento en
sistemática y diversidad genética
se basa en el hecho que las proteínas de diferentes
individuos, poblaciones y especies son homólogas, y que al
separarse en un gel producirán bandas similares o
diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen
de actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel
por medio de técnicas
generales de teñido.

Estudios genéticos han demostrado que los
patrones de bandas de las proteínas de reserva son
heredados como características discretas y en forma
codominante, observándose en algunos casos un efecto
maternal (Leonard et al., 1988). El número de genes que
controlan estas características es reducido y varía
de acuerdo a la especie (Gepts, 1990). Como marcador
bioquímico las proteínas de reserva tienen una baja
influencia ambiental, aunque se han reportado algunas excepciones
(Gayler y Sykes, 1985) además, permite un análisis
rápido de decenas de muestras por ser un método
simple y de bajo costo comparado
con otras técnicas.

Sin embargo, los distintos patrones
electroforéticos detectados pueden tener una base
molecular compleja que puede incluir sustituciones, inserciones y
pérdidas nucleotídicas. También las
diferencias pueden ser causadas por modificaciones pre y post
transcripción y/o traducción. Hasta ahora ha sido
difícil relacionar los cambios fenotípicos de los
patrones de bandas con el tipo de cambio
a nivel molecular. Por otro lado, la cantidad de diversidad
genética mediante polimorfismo proteico puede ser
subestimada por la no detección de mutaciones
silenciosas.

El polimorfismo de las proteínas de reserva en
semillas ha sido utilizado para identificar y distinguir
genotipos cultivados y silvestres en numerosas especies, tales
como: frejoles (Phaseolus vulgaris) (Gepts y Bliss, 1986),
trigo (Triticum aestivum) (Meachman et al, 1978), cebada
(Hordeum vulgare) (Nebo et al, 1983), arveja (Pisum
sativum)(Casey et al, 1986) y maíz
(Zea mays) (Wilson, 1985). En algunas especies, como es el
caso del frejol, esta técnica fue tan eficaz que mediante
el estudio de un locus fue posible determinar por primera
vez la
organización de la diversidad genética de la
especie (Gepts, 1990), situación que ha sido comprobada
más tarde con el uso de isoenzimas y Fragmentos de
Restricción polimórficos (RFLP) (Koenig y Gepts,
1989; Becerrra y Gepts, 1994).

b) Isoenzimas.

Con el avance tecnológico ocurrido en los
años 70, el uso de geles de almidón y la
tinción histoquímica de las proteínas, se
demostró dentro de un organismo la existencia de las
isoenzimas, formas moleculares múltiples dentro de un
organismo que catalizan una misma reacción. El efecto de
una modificación alélica puede ser detectado con
certeza, debido a un cambio de
movilidad electroforética. Esta sensibilidad
electroforética hizo que la técnica haya
revolucionado los estudios de diversidad genética en
diversas especies.

Para estos estudios se han utilizado varias estructuras de
la planta, tales como hojas, raíces o botones florales, de
las cuales se obtiene un extracto crudo proteico. La
técnica consiste en la separación de las enzimas del
extracto crudo, en un soporte permeable (almidón, PAGE)
bajo la acción
de un campo
eléctrico y seguido de un teñido
histoquímico. La separación se realiza mediante la
carga eléctrica neta, peso molecular, punto
isoeléctrico y/o combinación de estos criterios
(separación multidimensional). De este modo se separan
enzimas codificadas por genes diferentes o productos de
diferentes alelos de un mismo gen.

Las principales características de las isoenzimas
incluyen la simplicidad, mínima cantidad del material en
estudio, bajo costo y una cobertura del genoma de 10-20
loci por especie, ausencia de epistasis e influencias
ambientales. La expresión alélica es de tipo
codominante, lo que permite establecer comparaciones entre
especies, poblaciones de una misma especie, y detectar la
presencia de híbridos e introgresión de genes
(Paredes y Gepts, 1995).

Entre sus desventajas se incluye un nivel bajo de
polimorfismo al presentar pocos alelos por locus,
especialmente cuando la base genética es estrecha. Por
ejemplo, en lechuga (Lactuca sp) el número de
polimorfismos fue tan bajo que no permitió diferenciar
entre cultivares (Kesseli et al., 1991). Otro aspecto a
considerar es que las proteínas, siendo un producto del
ADN, pueden
ser afectadas cualitativa y cuantitativamente en su nivel de
expresión por factores ambientales. Para aumentar la
eficiencia de
la técnica ante este factor, deben ser identificados los
estados de desarrollo de
la planta durante los cuales la proteína es estable.
Además, al igual que con las proteínas de reserva,
las isoenzimas pueden o no reflejar los cambios genéticos
que ocurren en el ADN, además sólo un set de genes
estructurales están representados en estas
proteínas, vale decir, sólo parte del genoma se
puede evaluar.

Las isoenzimas han sido a menudo usadas para investigar
problemas de
sistemática, evolución o para medir los niveles de
variación genética entre y dentro de las
poblaciones (Paredes y Gepts, 1995), en la identificación
de cultivares (Arulsekar et al., 1985). Varios estudios de
diversidad genética se han realizado en diferentes
especies de cultivos anuales y perennes, tales como lentejas
(Lens culinaris) (Rodríguez et al., 1999), frejoles
(P. vulgaris) (Paredes y Gepts, 1995), nogal (Junglans
regia) (Arulzekar et al., 1985) y vid (Vitis sp.)
(Arulsekar y Parfitt, 1986).

II. MARCADORES MOLECULARES

El polimorfismo basado en proteínas ha sido de
gran utilidad en las
investigaciones realizadas en plantas, pero con
el desarrollo de las tecnologías basadas en ADN, la
investigación en esta área se ha
visto favorecida con la disponibilidad de una mayor cantidad de
marcadores, aquellos basados en Fragmentos de Restricción
Polimórficos (RFLP) y en la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR). Ambas técnicas han derivado en
múltiples técnicas como son la Amplificación
de ADN al Azar (RAPD), Fragmentos Polimórficos de ADN
Amplificados (AFLP), minisatélites (VNTR) y
microsatélites (SSR), entre otros.

a) Fragmentos de Restricción
Polimórficos (RFLP)

Los RFLPs permiten estudiar el genoma con una mayor
cobertura al incluir secuencias codificadoras y no-codificadoras
del ADN (exones e intrones). Esto permite detectar con mayor
eficiencia cambios genéticos puntuales, comparado con las
proteínas (Wang et al., 1992). Las principales ventajas de
los RFLPs radican en la presencia de un número ilimitado
de ellos, no son afectados por el medio
ambiente, no presentan efectos pleiotrópicos y pueden
ser evaluados en cualquier etapa de desarrollo de la
planta.

La técnica está basada en la
digestión del ADN total de un individuo con
diferentes enzimas de restricción. Esta restricción
produce cantidades equimolares de fragmentos para una
molécula de ADN dada. Los fragmentos resultantes son
separados por electroforesis en geles de agarosa y transferidos
por capilaridad a una membrana de nylon (Southern Blot). Esta
membrana es hibridada con una sonda (radioactiva o no). El
producto de la hibridación es visualizado por medio de una
autoradiografía de rayos-X, de acuerdo al peso molecular
de la banda.

Básicamente, los RFLPs son causados por
rearreglos del ADN, tales como pérdidas, inserciones o
sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos,
lo que significa la ganancia o pérdida de sitios de
restricción. Esto es detectado a través de
diferencias en el peso molecular de los fragmentos
homólogos de restricción del ADN genómico al
hibridar con la sonda seleccionada.

Los RFLPs se heredan en forma Mendeliana simple, y si la
sonda empleada representa una copia única, ella es
considerada como un locus y las variaciones en patrones
son analizados como alelos (bialélicos o
multialélicos) (Doebley y Wendel, 1989). La
expresión de estos marcadores es codominante, vale decir,
todas las formas alélicas del gen son distinguibles,
permitiendo detectar los híbridos y estudiar el flujo de
genes entre poblaciones. El nivel de polimorfismo que esta
técnica puede detectar depende en gran medida de la
naturaleza de
las sondas empleadas, enzimas de restricción utilizadas y
de la complejidad en cuanto al tamaño del genoma de la
especie en estudio.

Dentro de las principales desventajas de los RFLP
están la
clonación de las sondas, detección de RFLP en
las membranas y el uso de radioactividad; tareas consideradas
laboriosas, lentas y caras. Aunque últimamente, el
desarrollo de la técnica no-radioactiva ha simplificado
esta metodología (Foolad et al.,
1995).

El uso de los RFLP en plantas representa una buena
alternativa para realizar diversos estudios relacionados con los
tres genomas que existen en ellas, el nuclear (ADNn),
mitocondrial (ADNmt) y el de cloroplasto (ADNcp). La
aplicación de esta técnica ha sido de gran utilidad
en estudios filogenéticos, diversidad genética
(Becerra y Gepts, 1994) e identificación de cultivares con
propósitos de protección varietal.

El uso de uno u otro genoma dependerá de los
propósitos del estudio. El ADN nuclear ha sido mayormente
usado para estudios de diversidad genética de individuos
emparentados por su mayor tasa de mutación en
comparación al ADN mitocondrial y el de
cloroplasto.

Es así como el ADNmt ha sido usado mayormente en
estudios de filogenia en animales. En
plantas, el uso de este genoma en estudios filogenéticos
es discutido debido a la presencia de rearreglos del ADN y a la
detección de ADN foráneo dentro de sus secuencias
nucleotídicas (Palmer, 1992). Sin embargo, en maíz
este ADN ha sido usado, detectándose una variabilidad
considerable (Weissinger et al., 1983). Debido a su alta tasa de
rearreglos este organelo pareciera ser más útil que
el uso del cloroplasto para estudiar diversidad en las
especies.

Por otro lado, se ha detectado diversidad de ADNcp entre
especies, por lo que el uso de este organelo es importante en
estudios de filogenia (Palmer et al., 1983). Durante la
evolución del cloroplasto han ocurrido considerables
sustituciones de bases, lo que ha producido cambios en los sitios
de restricción, en lugar de rearreglos dentro del genoma
como ha ocurrido con las mitocondrias. Dentro de las especies el
ADNcp ha sido usado principalmente para comparar entre genotipos
cultivados y silvestres. En algunos casos, el uso de este ADN ha
sido bastante exitoso, como es el caso de la cebada (Hordeum
vulgare) (Clegg et al., 1984), maíz (Zea mays)
(Doebley, 1992) y cebolla (Allium sativum) (Havey, 1991).
Sin embargo, en otras especies no ha sido eficiente, como es en
el caso del sorgo (Sorghum sp.).

b) Fragmentos polimórficos de ADN Amplificados
al Azar (RAPD).

Recientemente, se ha desarrollado una serie de
técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) (White et al., 1989). El principio de esta
técnica se basa en la amplificación al azar de
fragmentos de ADN usando un partidor, ADN genómico molde,
nucleótidos, cloruro de magnesio y Taq ADN
polimerasa. Esta reacción es sometida a diferentes
condiciones cíclicas de temperatura,
lo que permite la amplificación in vitro de
múltiples fragmentos de ADN a partir de una cadena molde.
Estos productos son polimorficos cuando se ha producido una
pérdida, inserción o cambio de un solo
nucleótido en la cadena molde (ADN
genómico).

A partir del PCR se han generado una serie de
técnicas, tales como la de Fragmentos Polimórficos
de ADN Amplificado al Azar (RAPD). Esta técnica usa
partidores aleatorios de 10 mers (Williams et al., 1990) para
amplificar el ADN. Los productos de la amplificación son
separados mediante electroforesis y las bandas visualizadas, de
diferente peso molecular representan diferentes loci. En
algunas especies, la técnica da la opción de usar
dos o más partidores dentro de la misma reacción
para aumentar el número de bandas, logrando una mayor
cantidad de información por reacción.

Los productos de la reacción dependerán
del genoma en estudio, del partidor y de las condiciones de la
reacción. Los resultados de RAPD obtenidos en plantas
indican su herencia
dominante, su habilidad para detectar regiones de ADN altamente
variables
(5-10 loci por partidor), su tremenda potencialidad en el
mapeo de genes, identificación de razas, estudios de
hibridación inter e intraespecífica y en el estudio
de la variación genética en poblaciones altamente
emparentadas.

Las principales ventajas de esta técnica son la
rapidez en la obtención de resultados, el costo, el no uso
de radioactividad, menor inversión en equipos y la cantidad reducida
de ADN requerida. Sin embargo como desventaja aparece la
inconsistencia de los datos. Diferentes
condiciones de laboratorios con pequeñas alteraciones en
los parámetros de amplificación, pueden dar origen
a resultados diferentes. Esta desventaja se puede reducir
logrando un alto grado de estandarización de las
condiciones de reacción y de amplificación, usando
un control
interno para asegurar la reproducibilidad de los productos de
la amplificación, además del registro de las
bandas nítidas y consistentes.

La técnica del PCR también ha sido
ampliamente usada para estudiar diversidad genética de
cultivares y su relación con sus ancestros silvestres
(Demeke et al., 1992; Vierling y Nguyen, 1992; Sharma et al.,
1995).

c) Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados
(AFLP)

Recientemente otra técnica basada en el
método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
ha sido desarrollada (Vos et al., 1995). En esta técnica
se combinan los principios de los
RFLP y PCR, donde una submuestra de fragmentos producidos por la
restricción del ADN bajo estudio son amplificados
selectivamente en cascada. Los AFLPs usan como partidores
oligonucleótidos complementarios a las secuencias que han
sido ligadas a cada extremo del ADN digerido. El polimorfismo es
detectado por la presencia o ausencia de fragmentos y son
normalmente, al igual que RAPD, de herencia dominante.

Con esta técnica se puede detectar una
variación considerable del genoma, lo cual se refleja en
el número de productos amplificados con una sola
combinación de partidores. La eficiencia en detectar
polimorfismo puede ser varias veces mayor que la obtenida con
RAPD y RFLP. Esta metodología ha sido ampliamente usada en
diversas especies para medir diversidad genética, tales
como: lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al., 1996) y
lenteja (Lens culinaris) (Sharma et al., 1996) entre
otras. En el futuro esta técnica tendrá una gran
utilización en la saturación de mapas
genómicos y en la identificación de fragmentos
ligados a genes de interés
comercial (Colwin et al., 1995).

El procedimiento
comienza con la digestión del ADN genómico de los
individuos con enzimas de restricción que reconocen 4 y 6
bases de reconocimiento, lo cual genera fragmentos de
tamaño preferentemente pequeño. Luego se ligan
adaptadores de secuencia conocida a cada extremo y para el
proceso de
amplificación se usan partidores complementarios a estos
adaptadores, manteniendo el sitio de restricción
más un cierto número de nucleótidos (3
generalmente) que deben agregarse al extremo 3’.
Finalmente, el proceso implica dos alternativas de
detección de las bandas, la primera es la marcación
radioactiva de los productos amplificados en la última
etapa de amplificación, su separación en geles de
poliacrilamida, secado del gel y su visualización en
autoradiografías. La segunda alternativa usa la
tinción directa del gel con nitrato de plata. Los
resultados entre ambas alternativas son comparables, siendo esta
última de menor costo y fácil aplicación.
Una de las mayores ventajas de esta técnica es que en una
sola reacción se puede identificar alrededor de 50
loci en un tiempo corto
(Tohme et al., 1996).

Se han realizado comparaciones de los diversos
marcadores utilizados a medida que se han ido desarrollando. Por
ejemplo: al comparar resultados de este marcador con RFLPs y
otros marcadores en lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al.,
1996) los genotipos fueron agrupados en forma similar. En soya
(Glycine max) los AFLPs detectaron alrededor de 12 veces
el número de loci polimórficos (Voguel et
al., 1994) comparados con RAPDs. Es así como en el caso
puntual de estudios de diversidad genética del frejol, la
técnica de AFLP detectó una diversidad de 0,31 (1=
igualdad
genética) entre genotipos silvestres y cultivados (Tohme
et al., 1996), mayor a la detectada por isoenzimas en los mismos
genotipos (Singh et al., 1991). Sin embargo, los resultados de
diversidad genética obtenidos fueron similares con los
AFLP y RFLP.

Una de las desventajas para la interpretación de los datos es el tiempo
necesario para el análisis cuando se realiza en forma no
automatizada (visual). Por otro lado, los loci de AFLP son
tan reproducibles como los RFLPs, pues son prácticamente
insensibles a las condiciones de la reacción (Tohme et
al., 1996), aunque ambas técnicas requieren de una buena
calidad de ADN
para el proceso de digestión con enzimas de
restricción. Comparativamente, estas dos técnicas
son de mayor precisión que los RAPDs, susceptibles a una
falta de estandarización del proceso de
amplificación.

d) Minisatélites y
Microsatélites.

Las secuencias de ADN de mini (VNTR) y
microsatélites (SSR) son dos categorías de
secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se
encuentran repetidas en tandem y dispersas a través del
genoma representando muchos loci. Cada locus tiene
distinto número de repeticiones variable,
asociándose de esta manera a alelos específicos de
alta variabilidad. A través del uso de estos marcadores se
han obtenido patrones complejos de ADN en animales, plantas, y
microorganismos.

Dentro de la primera categoría, los
minisatélites son usados como sondas de secuencias simples
repetidas. Las secuencias repetidas de estos minisatélites
son monómeros que generalmente tienen 15-35 pares de
bases, y han sido aislados de mamíferos, plantas y del genoma del
bacteriófago M13. Una combinación de una enzima de
restricción con la sonda de M13 puede generar un alto
número de bandas, lo cual produce una gran
información, comparada con los RFLPs. Al igual que
éstos, la técnica es de alta reproducibilidad,
aunque requiere de un proceso de clonación previo de la sonda hipervariable,
además de un ADN de alta calidad para el proceso de
restricción y transferencia (Southern blot), e
hibridación con la sonda, generalmente marcada
radioactivamente, y finalmente de la exposición
a una película de rayos-X. Actualmente este polimorfismo
puede ser detectado mediante PCR, mediante el uso de partidores
que reconocen secuencias externas que rodean a las secuencias
repetidas (Heat et al., 1993). Este polimorfismo identifica un
locus que resulta ser multialélico debido a un elevado
número de unidades repetidas, que corresponden a muchos
alelos.

Los minisatélites han sido usados para estudiar
diversidad genética y realizar la identificación de
individuos ("fingerprinting") en diversas especies (Stockton et
al., 1990; Ramakrishna et al., 1995).

La segunda categoría de secuencias repetidas son
los microsatélites, ellos son secuencias de 1 a 5
nucleótidos repetidas en tandem y existen en forma
abundante en plantas (Condit y Hubbell, 1991). Mediante los
microsatélites se puede medir la diversidad entre
genotipos amplificando mediante PCR la región del ADN
genómico que contiene estas secuencias repetidas. El uso
de microsatélites ha ido aumentando mediante la producción de bibliotecas de
partidores y la secuenciación automática
fluorescente que permiten el diseño
de los partidores que rodean los microsatélites (Brondani
et al., 1998). Los fragmentos generados son separados en geles
denaturantes de poliacrilamida y visualizados radioactivamente o
por tinción con nitrato de plata.

Los microsatélites son muy atractivos para los
genetistas pues combinan varias ventajas como son su
codominancia, multialelismo y su alta heterocigosidad. El alto
nivel de polimorfismo que detecta permite una discriminación precisa entre individuos
altamente emparentados. Además de ser altamente
polimórficos, los microsatélites usan cantidades
mínimas de ADN, equivalentes a las que se usan en RAPD.
Las condiciones de amplificación y de reacción son
especie-específicos y la variación en el largo de
los productos amplificados mediante PCR es función
del número de unidades repetidas.

En general, la amplificación de
microsatélites ha demostrado que éstos son
más variables que isoenzimas, RFLP, AFLP y RAPD. Por
ejemplo, en Cucumis 29 isoenzimas no mostraron
polimorfismo entre dos genotipos comerciales (Perl-Treves et al.,
1985). Dentro del mismo género
RAPD detectó un 38% de polimorfismo, mientras que los
microsatélites detectaron un 71%, e incluso detectaron
diferencias genéticas entre cultivares altamente
emparentados que mediante otras técnicas no habían
podido ser distinguidos (Katzir et al., 1996). Es así como
se ha comprobado, en diversas especies, la complementariedad de
todas las técnicas mencionadas anteriormente en el estudio
global de la organización genética del
germoplasma.

Una de las desventajas de los microsatélites es
el tiempo y costo involucrado en el proceso del diseño de
cada partidor, sin embargo existe la posibilidad de usar los
mismos partidores en más de una especie. Esto es debido, a
que existe un grado de conservación de los
microsatélites entre genomas de especies tan distantes
como son algunos mamíferos, plantas anuales y perennes.
Esto no es generalizado en todas las especies, puesto que al
comparar entre cereales de grano pequeño como trigo,
cebada y centeno, se ha detectado una limitada
conservación de las secuencias
microsatelitales.

Los microsatélites han sido también
utilizados para medir diversidad genética de diversas
especies anuales como: soya (Glycine max) (Akkaya et al.,
1992), arroz (Oryza sativa) (Wu y Tanskley, 1993),
maíz (Zea mays) (Senior y Heum, 1995), cebada
(Hordeum vulgare) (Becker y Heun, 1995), trigo
(Triticum aestivum) (Röder et al., 1995) y raps
(Brassica sp.) (Lagercrantz et al., 1993).

Hasta ahora también se han desarrollado
microsatélites en especies perennes, aunque el
número de ellos ha sido escaso (Brondani et al., 1998). En
el caso de Eucaliptus los microsatélites han sido
transferidos entre poblaciones y especies del mismo
género. En forma adicional, la estimación de
heterocigosidad que este marcador pueden entregar presenta una
gran ventaja en el mapeo de características cuantitativas
(QTLs), comparación de mapas que incluyen QTL y estudios
de flujo genético en árboles.

Aunque el uso de marcadores bioquímicos y
moleculares en estudios de germoplasma y diversidad
genética es limitado por el costo de los reactivos, y en
algunos casos por el elevado costo de los equipos, los avances
técnicos que estas tecnologías han alcanzado en los
últimos años, los hacen más accesibles a los
genetistas y a los programas de
mejoramiento. Ambos tipos de análisis son complementarios
en la caracterización morfológica y
agronómica del germoplasma y en el entendimiento de la
diversidad y estructura
genética de las poblaciones, especies y taxas.

La elección del marcador a usar dependerá
de los objetivos del
estudio, del costo y de las características que cada uno
de ellos presentan (Cuadro 1).

Cuadro 1. Características
generales de los marcadores genéticos.
Table 1. General characteristics of genetic
markers.

RFLP : Fragmentos de restricción
polimórficos
RAPD : Amplificación de ADN al azar
VNTR : Número variable de repeticiones en tandem
AFLP : Amplificación de fragmentos polimórficos
SSR : Secuencias simples repetidas

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Viviana Becerra V. 2 y Mario Paredes C.
2
2. Instituto de investigaciones Agropecuarias, Centro
Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426,
Chillán, Chile.