Mejoramiento de trigos harineros (Triticum aestivum L.) en la zona Centro Sur de Chile. IV (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

El nombre comercial de los cultivares estudiados, su
hábito de crecimiento, el año de registro y su
genealogía se indican en el Cuadro 1. Las semillas para
este estudio provinieron de espigas individuales típicas
de cada cultivar, seleccionadas de ensayos
realizados en el Instituto de Investigaciones
Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Campo Experimental
Santa Rosa (36°31’ lat. Sur, 71°54’ long.
Oeste y alt. 220 m.s.n.m.), Chillán, Chile.

Cuadro 1. Cultivares de
trigo harinero liberados por el Instituto de Investigaciones
Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu,
entre los años 1968 y 1996.
Table 1. Bread wheat cultivars released by the National
Agricultural Research Institute, Quilamapu Research Center,
between 1968 and 1996.

1A
= Hábito alternativo; P = Hábito primaveral; I =
Hábito invernal.

Electroforesis de gluteninas.

Se describe a continuación la técnica
citada por Hewstone e Hinrichsen (1994), que incluye una
modificación del método
descrito por Ng y Bushuk (1987) para la extracción de
proteínas. Se molió un grano por
variedad del cual se pesaron 12 mg de harina pura y se
disolvieron en 600 m L de una solución tampón
compuesta por 0,05 M de Tris-HCl (pH 8,0), 5M de
urea, 0,2% de SDS, 3% de 2-mercaptoetanol y 0,003% de azul de
bromofenol, con agitación vigorosa e incubación por
20 min a temperatura
ambiente. Se
analizaron las muestras por electroforesis vertical en geles de
poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) de 9 x 8 x 0,1 cm, según la
técnica descrita por Laemmli (1970). Cada gel
contenía 12 carriles y se cargaron 15 m L de la muestra en cada
uno. De cada cultivar se analizaron al menos dos granos,
separadamente. Se usó un gel concentrador que
contenía 4,5% de acrilamida, 0,06% de bisacrilamida, 0,05%
de SDS, 0,125 M de Tris-HCl (pH 6,8), y un gel separador que
contenía 9% de acrilamida, 0,12% de bisacrilamida, 0,05%
de SDS, 0,38 M de Tris-HCl (pH 8,8). En ambos casos la
polimerización se comenzó agregando 0,044% de
persulfato de amonio y 0,043% de N, N, N’, N’
tetrametiletilendiamina (TEMED). Las electroforesis se corrieron
a 15 mA por gel, a temperatura ambiente. El tampón de
electroforesis usado contenía 0,191 M de glicina, 24,7 mM
de Tris-HCl (pH 8,3) y 0,13% de SDS. Los geles fueron
teñidos durante toda la noche en una solución al
44% de metanol, 6% de ácido acético y 0,25 g
L-1 de azul de Coomassie R-250, y desteñidos en
una solución al 20% de metanol y 5% de ácido
acético.

Electroforesis de gliadinas.

Se usó la técnica usada por Hinrichsen et
al. (1997). Las gliadinas se extrajeron del endosperma de la
semilla, triturando un grano de cada cultivar y separando la
harina del pericarpio. En un microtubo de 1,5 mL se pesaron 20 mg
de esta harina y se agregaron 240 m L de etanol al 70%,
agitándose ocasionalmente y manteniéndose durante 2
h a temperatura ambiente. La extracción se prolongó
toda la noche y la mezcla resultante se centrifugó a
15.000 x g durante 25 min. Después de separar el
sobrenadante, cuidando de no arrastrar harina, se agregó
un volumen igual de
sacarosa al 60% preparada en lactato de aluminio 0,25%
(solución llevada a pH 3,1 con ácido
láctico), conteniendo un 1% (v/v) del indicador de
migración Rojo de Pironina B
(solución patrón de 20 mg de colorante en 1 mL de
agua
destilada). Las proteínas extraídas se separaron
por electroforesis vertical en geles de poliacrilamida en medio
ácido (A-PAGE), compuestos de una fase superior
(concentradora) y una fase inferior (resolutiva o separadora). En
este tipo de geles, la migración de las bandas a
través del gel resolutivo es proporcional al tamaño
y carga de cada polipéptido. El gel resolutivo estuvo
compuesto de acrilamida 9,5%, N,N’-metilen-bisacrilamida
0,5%, ácido ascórbico 0,024% y sulfato ferroso
0,0002%, tamponados con lactato de aluminio 0,25% llevado a pH
3,1 con ácido láctico (Clements, 1987). Como
catalizador de la reacción de polimerización se
usó peróxido de hidrógeno de 30 vols. (11 m L para 100 mL
de gel). Para la parte concentradora del gel se preparó
una matriz de
poliacrilamida al 4,5%, en las mismas condiciones del gel
separador. El amortiguador de corrida fue también lactato
de aluminio 0,25% llevado a pH 3,1 con ácido
láctico. La corrida electroforética se
realizó a temperatura ambiente, por el tiempo
necesario para que el indicador de migración (Rojo de
pironina B) recorriera entre dos y tres veces el largo del gel.
Posteriormente, se fijó y tiñó en una
solución de ácido tricloroacético 12% y azul
de Coomassie R-250, al 0,05% (preparado al 1% en etanol 95%).
Finalmente, el gel fue lavado en metanol 20% y ácido
acético 5% para eliminar el exceso de tinción. Los
geles fueron registrados digitalmente con un sistema Agfa
Snapscan 1212.

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

Patrones de gluteninas de alto peso molecular
(G-APM)

En el Cuadro 2 se indican las bandas de G-APM de cada
cultivar y sus respectivos alelos. Se identificaron 14 bandas
diferentes, representadas en 12 combinaciones alélicas.
Los cultivares se agruparon según su similitud en el
patrón de G-APM en seis grupos de dos o
más genotipos cada uno, habiendo otros seis genotipos que
presentaron una combinación de bandas única,
diferente a cualquiera de los 22 genotipos considerados en este
estudio. En general, los cultivares de un mismo grupo no
presentaron progenitores comunes, con la sola excepción de
Andifén y Labriego, que son cultivares hermanos. Esta
falta de asociación no debiera sorprender, dado que
después del cruzamiento se produce segregación de
los alelos de cada loci en forma aleatoria, y la selección
durante los primeros ciclos reproductivos está dirigida a
muchas características agronómicas,
fisiológicas y de resistencia a
enfermedades, las
que pueden o no estar relacionadas con la calidad del grano, o
con selección por algún alelo específico de
G-APM. La presencia de las mismas bandas de G-APM en cultivares
con distintos progenitores, como ocurre con los grupos de
cultivares Andifén, Lucero y Lancero; Lilifén,
Mexifén y Candela; Lautaro, Ovación y Cisne;
Quelén y Ciko; Sipa y Saeta; y Onda y Tamoi, inhabilita la
metodología de G-APM para diferenciar, con
rigurosidad, los cultivares de trigo harinero analizados en este
trabajo, y no
permite usar esta técnica como único criterio de
decisión para proteger la propiedad
intelectual (derechos de obtentor) sobre
dichos cultivares. A pesar de ello, estos marcadores pueden
resultar una buena herramienta para diferenciar cultivares
conocidamente divergentes en sus perfiles de G-APM, ya sea como
único criterio o combinado con otro marcador proteico,
como los perfiles de gliadinas.

Cuadro 2. Subunidades de
gluteninas de alto peso molecular y alelos asociados en
cultivares de trigos harineros.
Table 2. High molecular weight glutenin sub-units and associated
alleles of bread wheat cultivars.

2*: Indica que no fue
posible diferenciar esta banda de aquella del alelo 2+12 del
locus gluD1.
** Las combinaciones alélicas
están representadas, para cada locus, por una letra
diferente.

Se encontró una buena reproducibilidad al
comparar los resultados de G-APM del presente trabajo con los
indicados por Hewstone e Hinrichsen (1994), lo que
apoyaría la tesis que las
G-APM no son influenciadas por el medio
ambiente. En efecto, las bandas proteicas de 13 cultivares
incluidos en ambos estudios, señalaron que ocho de ellos
presentaron los mismos patrones de G-APM, mientras que tres
cultivares presentaron diferencias en un único
locus y dos difirieron en las bandas correspondientes a
dos loci de G-APM. En este último grupo se
encuentra el cultivar Sipa, el que, adicionalmente, ha presentado
siempre un cierto grado de segregación para el color del grano,
sugiriendo ambos hechos que es un material con un insuficiente
nivel de homocigosis. Por otra parte, las pocas diferencias
encontradas entre ambos trabajos podrían explicarse por la
aplicación de distintos criterios en la interpretación de los perfiles de bandas
proteicas, dado que se trata de bandas correspondientes a
diferentes loci con alelos de tamaños muy
similares, como el alelo 2* (locus GluA1) y el alelo 2+12
(correspondiente al locus GluD1), o bandas de
tamaño muy similar de un mismo locus, como 7+9 y
17+18 (locus GluB1).

De acuerdo con la nomenclatura de
Payne et al. (1980), en los 22 cultivares analizados se
identificaron 14 bandas: 1, 2, 2*, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16,
17, 18 y 20, a lo que se debe agregar el alelo nulo para el
locus Glu-A1. Estos cultivares se muestran en la
electroforesis de las Figuras 1a y 1b, donde se señalan
sus respectivas subunidades.  

Figura 1a. Subunidades de gluteninas
de alto peso molecular de 10 cultivares de trigo del Instituto de
Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de
Investigación Quilamapu, creados entre 1968 y 1996,
separados por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
(PAGE-SDS) al 9%. En el carril de la derecha se incluye el
patrón del cv. de referencia, Marquis.
Figure 1a. High molecular weight glutenin sub-units of 10 wheat
cultivars created by the National Agricultural Research
Institute, Quilamapu Regional Research Center, during the period
1968 to 1996, separated by electrophoresis in 9% PAGE-SDS. The
rightmost lane contains the reference cv. Marquis.

Figura 1b. Subunidades de gluteninas
de alto peso molecular de 12 cultivares de trigo del Instituto de
Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de
Investigación Quilamapu, creados entre 1968 y 1996,
separados por PAGE-SDS al 9%.
Figure 1b. High molecular weight glutenin sub-units of 12 wheat
cultivars created by the National Agricultural Research
Institute, Quilamapu Regional Research Center, during the period
1968 to 1996, separated by 9% PAGE-SDS gel
electrophoresis.

Según Branlard y Dardevet (1985), la subunidad 2*
codificada en el cromosoma 1A, las subunidades 7, 8 y 9 (en sus
correspondientes combinaciones alélicas 7+8 y 7+9),
codificadas en el cromosoma 1B, y las subunidades 5+10,
codificadas en el cromosoma 1D, están relacionadas con una
alta sedimentación; por el contrario, las subunidades 6+8
y 2+12 corresponden, según estos autores, a una baja
sedimentación. Payne et al. (1987) y Carrillo et al.
(1990) complementaron la información anterior al señalar que
en el cromosoma 1A se ubican los genes correspondientes a las
subunidades 1 y 2*, consideradas favorables para la calidad,
especialmente la 2*, en contraposición al alelo nulo (o
banda 0), que está asociado a un bajo volumen de
sedimentación. De acuerdo a lo anterior, los alelos de los
trigos de Quilamapu (Cuadro 2) sugieren que los cultivares de
mayor calidad serían Lilifén, Mexifén,
Candela, Lautaro, Laurel, Ovación y Cisne; sin embargo, en
este grupo sólo el cultivar Mexifén presentó
un elevado índice de sedimentación (Mellado, 2001).
El cultivar Onda, con la mayor sedimentación de los 22
trigos analizados, presenta coincidentemente alelos que
conferirían buena calidad.

Es interesante considerar el caso de los cultivares
Candela y Lucero, que tuvieron los índices más
bajos de sedimentación (Mellado, 2001); sin embargo,
sólo el cultivar Lucero presentó alelos de mala
calidad, en tanto que Candela se ubicó entre los mejor
evaluados, coincidiendo con resultados anteriores (Hewstone e
Hinrichsen, 1994). De este modo, se confirma que si bien las
G-APM son factores considerados importantes en la
determinación de calidad, existen otros factores no
estudiados en este trabajo que estarían presentes en
variedades como Candela, que explicarían esta
inconsistencia entre valores de
sedimentación y alelos asociados con buena calidad
(Zawistowska et al., 1985).

Dentro de los trigos precoces estudiados se
determinó que los cultivares con el menor índice de
sedimentación fueron Ancoa y Antufén (Mellado,
2001), y ello, según el presente trabajo, sí estuvo
asociado con alelos que pueden conferir mala calidad. En resumen,
de los 22 trigos analizados, únicamente los cultivares
Mexifén y Onda presentaron alelos relacionados a buena
calidad, con un elevado volumen de sedimentación, y
solamente en los cultivares Lucero, Ancoa y Antufén, se
asociaron los alelos de mala calidad con valores bajos de
sedimentación.

Patrones de gliadinas

Los patrones de gliadinas de los 22 trigos
extraídas en medio alcohólico, y separadas en
electroforesis en medio ácido (A-PAGE, Figura 2),
señalan que hay diferencias entre los cultivares, aunque
hubo grupos de genotipos muy similares entre sí,
difíciles de diferenciar. El alto grado de pureza del
material biológico usado en el presente trabajo,
determinado mediante el análisis separado de 10 semillas por cada
cultivar, contrasta con aquel material usado en trabajos
anteriores de Hinrichsen et al. (1997), donde se encontró
que un porcentaje de las muestras presentaba grados variables de
heterogeneidad en una o más bandas. El nivel de pureza es
un requisito esencial si se pretende comparar patrones de
gliadinas, especialmente cuando se trata de cultivares
emparentados, es decir, que tengan algunos progenitores
comunes.

Figura 2. Perfiles de gliadinas de 22
cultivares de trigo del Instituto de Investigaciones
Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu,
analizados mediante geles de poliacrilamida en medio ácido
(A-PAGE). Las letras griegas de la derecha indican los cuatro
grupos de gliadinas de trigo (ver texto).
Figure 2. Gliadin profiles corresponding to 22 wheat cultivars
released by National Agricultural Research Institute, Quilamapu
Regional Research Center, analyzed by A-PAGE. Greek letters on
the right indicate the four gliadin wheat groups (see the
text).

Las separaciones electroforéticas permitieron
observar los cuatro grupos de proteínas descritos en esta
familia
(Bushuk y Zillman, 1978), es decir, gliadinas tipo a , b , d y w
, como se aprecia en la Figura 2. Se diferenciaron grupos de
cultivares de mayor similitud, con la excepción del
cultivar Labriego que presenta una banda d de alto peso
molecular, diferente a todos los otros cultivares analizados,
incluido Andifén que tiene los mismos progenitores (Cuadro
1).

Un primer grupo de genotipos, separados en base a
diferencias en los péptidos w , incluye a los cultivares
Cisne, Saeta, Nobo, Ovación y Lautaro. Cisne tiene un
péptido adicional en la región w , que lo
diferencia fácilmente. Los patrones de los otros cuatro
cultivares son parecidos, y sólo unas bandas de la
región a diferencian a Saeta y Ovación de Nobo y
Lautaro. Estos dos pares de genotipos tienen patrones de
gliadinas idénticos, aunque presentan algunas diferencias
en los patrones de G-APM (Cuadro 2). Esta similitud en sus
perfiles de gliadinas no guarda relación con la
genealogía de estos cultivares, ya que si bien uno de los
padres de Saeta tiene los mismos progenitores que Ovación,
en el caso de Nobo y Lautaro no comparten progenitores. En otras
palabras, el hecho que dos o más cultivares tengan
similitud en sus patrones de gliadinas no implica necesariamente
una relación de parentesco directo entre ellas, ni
viceversa, esto es, que cultivares provenientes de los mismos
progenitores pueden presentar patrones muy diferentes. Lo que
debiera evaluarse más adelante es si las diferentes bandas
de gliadinas identificadas en cada cultivar tienen un correlato
en sus progenitores, comportándose como marcadores
genéticos simples.

El primer grupo analizado, así como un segundo
grupo compuesto por los cvs. Tamoi, Domo, Sipa, Ciko y Onda,
tienen bandas de la región d menores a la banda 42 del
cultivar de referencia Marquis, según la nomenclatura de
Bushuk y Zillman (1978). En este segundo grupo, Domo y Ciko son
muy semejantes en sus patrones de gliadinas, excepto por una
banda de la región w . De los otros tres cultivares de
este grupo, Tamoi tiene una banda en la región b que no
está presente en Sipa y Onda, mientras que estos dos
últimos trigos difieren entre sí en algunos
péptidos de la zona a . En este segundo grupo, sólo
los dos últimos cultivares están estrechamente
relacionados a nivel de pedigrí, ya que los mismos
progenitores de Onda corresponden a uno de los padres de Sipa
(Cuadro 2).

Los otros 12 genotipos estudiados (mitad derecha de la
Figura 2) mostraron patrones de gliadinas relativamente
similares; su diferenciación se dificultó por no
haber estandarizado la carga de cantidades equivalentes de
proteína total en cada carril. Al respecto, se ha
observado con cierta frecuencia, y en algunas muestras con mayor
incidencia, algún grado de inestabilidad o
degradación peptídica, lo que podría deberse
a particularidades de determinados genotipos o a la
antigüedad de los granos analizados; esto último no
es aplicable a esta investigación ya que siempre se
trabajó con semillas del año y obtenidas de un
mismo ensayo.
Respecto a este problema de inestabilidad, el extracto proteico
del cv. Laurel siempre tuvo un "chorreado" que se interpreta como
degradación peptídica, por lo que no ha sido
considerado en el análisis de gliadinas. Tres de los once
cultivares restantes (Lucero, Quelén y Andifén), se
diferenciaron de los demás por carecer de un
péptido en la zona baja del grupo w . También se
debe destacar la diferencia en los patrones de gliadinas de
Andifén y Labriego, a pesar de ser cultivares hermanos;
esta diferencia prácticamente no se observó cuando
se compararon los patrones de gluteninas de estos
cultivares.

Dadas las dificultades para diferenciar trigos a
través de patrones de gluteninas y gliadinas, se
deberá recurrir a otras metodologías para un
análisis más detallado de las diferencias
genéticas entre cultivares, como marcadores de AFLP (Law
et al., 1998), cromatografía líquida de alta
resolución o HPLC (Lookhart et al., 1986) o electroforesis
capilar (Werner et al., 1994). Otra alternativa sería el
estudio directo de secuencias genómicas hipervariables,
como los marcadores de microsatélites (Plaschke et al.,
1995; Zerené et al., 1999) de los cuales existen
más de 200 descritos en trigo (Röder et al., 1995,
1998). Estos marcadores han sido postulados en numerosas especies
como los más versátiles y apropiados para la
identificación de genotipos (Morgante y Olivieri, 1993),
lo que permite postular que en el futuro serán la
metodología de elección para caracterizar
cultivares de trigo.

CONCLUSIONES

1. Se encontró un adecuado nivel de
   reproducibilidad al comparar los resultados de G-APM del
   presente trabajo con resultados publicados anteriormente, lo
   que refuerza la hipótesis de que son marcadores que no
   son influenciados por el medio ambiente.
2. Cultivares como Candela, que muestran inconsistencia
   entre los alelos asociados a calidad y sus valores de
   sedimentación, refuerzan la noción de que hay
   factores adicionales a las G-APM involucrados en la
   determinación de calidad.
3. El análisis electroforético
   permitió separar los cuatro grupos de gliadinas
   descritos por Bushuk y Zillman en 1978, pero la alta similitud
   de los 22 cultivares estudiados no permitió diferenciar
   varios subgrupos integrados por diverso número de
   cultivares.
4. La similitud entre algunos cultivares, en cuanto a
   presentar idénticos patrones de bandas de G-APM o
   gliadinas, no tuvo un correlato en cuanto a tener progenitores
   comunes o coincidir en sus pedigríes.
   Complementariamente, tampoco aquellos cultivares que comparten
   progenitores muestran una mayor similitud en sus patrones de
   bandas.
5. Dado que existen varios grupos de cultivares que
   comparten los mismos patrones de G-APM y/o de gliadinas,
   ninguna de estas técnicas
   puede ser usada como único criterio para identificar
   cultivares; la combinación de ambas técnicas
   aumenta la probabilidad de
   diferenciar cultivares genéticamente muy similares. En
   este mismo sentido, la implementación de técnicas
   basadas en el uso de ADN, como los
   marcadores de microsatélites, representa una mejor
   opción que está siendo actualmente
   evaluada.

LITERATURA CITADA

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2 Instituto de Investigaciones
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