Un método nuevo para aislar e identificar directamente mutantes Nit- en Escherichia coli K12
Reproducción autorizada |
Resumen: Los métodos
para aislar e identificar mutantes defectivos en la respiración anaeróbica del nitrato
(Nit-) tienden a ser más específicos para ciertos
genes mutados. En el presente trabajo se
desarrolló un método
denominado TNC, basado en una modificación del publicado
por Fimmel y Haddock (1979), pero con mayores ventajas: no fue
necesario incubar en anaerobiosis estricta, permitió
ampliar el espectro de genes mutados (incluyendo mol y
fnr) y detectar la aparición de colonias rojas muy
rápidamente, en sólo 24 horas de crecimiento. La
frecuencia de mutantes Nit- y la distribución de genes mutados fueron
superiores, al usarlo comparativamente con el método de
selección por resistencia al
clorato.
El TNC resultó muy sensible y con
reproducibilidad para identificar diferencialmente clones
mutantes Nit- (TNC+) y silvestres Nit+ (TNC-); además fue
eficiente para caracterizar cepas bacterianas y en los análisis genéticos. En el presente
trabajo también se estableció y evaluó un
criterio de clasificación fisiológica para agrupar
preliminarmente a los mutantes pleiotrópicos Nit- Gas– en cuatro
subclases genotípicas, al observar que las mutaciones en
moe revertían fenotípicamente con molibdato,
en forma tardía.
Palabras claves: Nit- Gas- identificación; Nit-
Gas- aislamiento; molibdato reversión; mol;
fnr; narC.
Abstract: A new method for the direct isolation and
identification of nit-mutants in Escherichia coli
K12.
The methods to isolate and to identify defective mutants
in the nitrate anaerobic respiration (Nit-) tend to be
preferential for certain mutated genes. This work presents a
method denominated TNC, based in a modification of Fimmel and
Haddock published in1979, but with highest advantages: it was not
necessary to incubate with strict anaerobiosis, permitted both to
amplify the spectre of mutated genes (including mol y
fnr) and to detect very quickly the appearing red colonies, in only 24
hours of growth. Using it comparatively with the method of
selection for chlorate resistance, the frequency of Nit- mutants
and the distribution of genes mutated were higher. The TNC showed
to be very sensitive and with reproducibility to identify
differently Nit- mutants (TNC+) and Nit+ wild type (TNC-) clones;
furthermore, it was efficient for the characterisation of
bacteria strains and the genetic analysis. In the present work it
was also established and evaluated a criteria of physiologic
classification for preliminary grouping pleiotropic Nit- Gas-
mutants in four genotypic subclass, by observing that moe
mutations could be reverted phenotypically in late form with
molybdate.
Key words: Nit- Gas- identification; Nit- Gas-
isolation; molybdate reversion; mol ; fnr ;
narC
INTRODUCCIÓN
Los estudios con cepas mutantes han representado un gran
aporte para el
conocimiento de los fenómenos biológicos, de
allí la importancia de contar con métodos
eficientes que permitan el aislamiento e identificación de
las mismas. En el caso de E. coli, la pérdida de
actividad Nitrato Reductasa A (NRA) ocasiona la aparición
de mutantes defectivos en la respiración anaeróbica
del nitrato (fenotipo Nit-) (Showe y Demoss1968, Piéchaud
et al. 1969). La NRA es una molibdoenzima (apoNRA +
molibdocofactor MoCo); su actividad respiratoria puede ser
afectada por mutaciones que mapean en al menos tres clases
distintas de genes, y sus efectos son diversos.
Mutaciones en los operones nar C (narGHJI)
y narXL, afectan particularmente la biosíntesis de la apoNRA (Bonnefoy-Orth et
al. 1981, Stewart y MacGregor 1982, Edwards et al. 1983,
Sodergren y Demos 1988, Stewart 1988, Bachman 1990, Stewart
1993). Por su parte, las mutaciones mol (anteriormente
chl) (Piéchaud et al. 1969; Shanmugan et al 1992)
incluyen los operones moa, mob, mod, moe, los genes
mog y molR, y afectan pleiotrópicamente la
activación de diferentes molibdoenzimas, reductasas y
deshidrogenasas, que comparten el mismo MoCo, como ejemplos la
NRA y la FDH-L (fenotipo Nit- Gas-) (Johnson y Rajagopalan 1987,
Bachman 1990, Lee et al. 1990, Baker y Boxer 1991, Rivers et al.
1993, Iobbi-Nivol et al. 1995, Maupin-Furlow et al. 1995).
Mutaciones en el gen fnr también ocasionan
pleiotropía, al afectar la biosíntesis de las
molibdoenzimas NRA y trimetil amino N-óxido reductasa
(TMAO), además de las no molibdoenzimas fumarato y nitrito
reductasas (fenotipo Nit- Tor- Frd- Nir-) (Lambden y Guest1976,
Stewart y MacGregor 1982, Stewart 1988, Spiro y Guest 1990,
Takahashi et al. 1994).
Los métodos desarrollados para aislar e
identificar mutantes Nit- de E. coli, tienden a ser
preferenciales para ciertos genes mutados, tal como se indica a
continuación:
1. Selección directa por resistencia al clorato
(Piéchaud et al. 1969). Se basa en la sobrevivencia
frente a la toxicidad que conlleva la reducción
anaeróbica de este compuesto.
Fue el primer método desarrollado y es el
más extensamente utilizado; la gran mayoría de
los mutantes ChlR (98%) están afectados en
los genes mol, particularmente en los operones
moa (chlA) y mob (chlB) (Puig et
al. 1969, Case 1970, Glaser y Demos 1972).
2. Identificación por incapacidad de crecer
anaeróbicamente con nitrato como aceptor final. Se
utilizan los medios
sintéticos:
i. Lactato-Nitrato, diseñado
específicamente para mutaciones en el operón
narC (Venables y Guest 1968) y
ii. Glicerol-Nitrato, se usa para los Nit- en general
(Lambden y Guest 1976).
3. Identificación por incapacidad de reducir
anaeróbicamente el nitrato a nitrito. Utilizando la
glucosa, se
identifican los mutantes Nit- en general (Showe y Demos 1968,
Piéchaud e al. 1969), pero el formiato tiende a ser
preferencial para los afectados en el operón narC
(Glaser y Demos 1972).
4. Identificación por coloración roja de
las colonias, durante el crecimiento anaeróbico estricto
en medio sintético suplementado con nitrato y
tetrazolio. Fue diseñado específicamente para
mutaciones en el operón narC (Fimmel y Haddock
1980), pero usando cepas merodiploides homocigotas para
mog+ (chlG+) se obtienen mutantes afectados en
este gen (Jenkins y Haddock 1980).
Considerando las restricciones de los métodos
arriba escritos, el presente trabajo estuvo dirigido a
desarrollar un método nuevo que, permitiera incrementar la
posibilidad de aislar e identificar la gran diversidad de genes
mutados, responsables del fenotipo Nit-. Este método fue
denominado TNC y tuvo como base el reportado por Fimmel y Haddock
(1979). Se ensayó comparativamente con el de resistencia
al clorato, para evaluar su capacidad de ampliar la frecuencia y
diversidad de genes mutados.
También se evaluó su confiabilidad como un
método sencillo y rápido para distinguir
eficientemente entre cepas Nit+ (TNC-) y Nit-
(TNC+).
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