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PCR-heterodúplex por agrupamiento: Implementación de un método de identificación de portadores de la mutación más común causal de fibrosis quística


Partes: 1, 2

    Publicación original:
    Colombia Médica, VOLUMEN 37
    N° 3, 2006 (Julio-Septiembre) – ISSN
    1657-9534,
    Reproducción autorizada por:
    Corporación Editora Médica del Valle,
    Universidad del Valle, Cali,
    Colombia

    RESUMEN: Introducción: La fibrosis
    quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva frecuente, con una
    incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos. La causan
    más de 1,300 mutaciones distintas en el gen regulador de
    la conductancia transmembranal de la fibrosis quística
    (CFTR). Sin embargo, la mutación F508del es la más
    común en la mayoría de las poblaciones.

    Objetivos: Desarrollo de una técnica
    rápida, de bajo costo y confiable
    que permita filtrar con rapidez a los portadores o afectados por
    esta mutación que mediante el asesoramiento
    genético, contribuya a disminuir la aparición de
    nuevos casos y a un diagnóstico temprano de los enfermos y
    así lograr un descenso en la morbilidad y la mortalidad
    asociadas con la fibrosis quística en Colombia.

    Metodología: En el presente estudio se
    aplicó la técnica PCR-heterodúplex por
    agrupamientos, gracias al análisis de 400 muestras de sangre en papel
    filtro obtenidas de individuos asintomáticos para la
    FQ.

    Resultados: En las pruebas de
    validación de la técnica PCR-heterodúplex
    por agrupamiento se obtuvo una eficiencia,
    reproducibilidad y especificidad de 100% y una sensibilidad de
    92%.

    Conclusiones: Se demostró la sensibilidad
    y reproducibilidad de la técnica PCR
    Directa-heterodúplex por agrupamientos de hasta 10
    muestras, que se pueden emplear en programas para
    filtrar heterocigotos y afectados de F508del.

    Palabras clave: Fibrosis quística; CFTR;
    Análisis heterodúplex; Mutación; Filtrado
    genético; Colombia.

    PCR-heteroduplex by grouping: Rapid screening carrier
    method for cystic fibrosis F508del mutation in
    Colombia

    SUMMARY: Background: Cystic fibrosis (CF) is the
    most frequent autosomal recessive disorder in the Caucasian
    population with an incidence of 1 in 2,500 newborns. More than
    1,300 mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance
    regulator (CFTR) gene that causes CF have been described.
    However, mutation F508del is the most common mutation in
    different populations around the world.

    Objective: To develop a fast, reliable and
    low-cost technique to screen carriers and affected individuals
    for the F508del mutation. This kind of analysis will have an
    impact on genetic counselling to decrease the incidence of new
    cases, in the early diagnosis and instauration of appropriate
    treatment to decrease morbidity and mortality associated to CF in
    Colombia.

    Methods: The reliability of the PCR-heteroduplex
    by grouping technique by analysis of 400 blood spot samples from
    asymptomatic CF patients was defined.

    Results: Using PCR-heteroduplex by grouping
    technique 100% efficiency, reproducibility and specificity and
    92%sensitivity were found.

    Conclusions: The sensitivity and reproducibility
    of the PCR-heteroduplex by grouping technique up to pooling of 10
    samples were demonstrated. This kind of analysis could be used in
    heterozygotes and affected screening programs.

    Key words: Cystic fibrosis; CFTR; Heteroduplex
    analysis; Genetic screening; Colombia.

    La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad
    genética
    autosómica recesiva de mayor frecuencia en la población caucásica, con una
    incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos vivos. Los
    afectados con FQ presentan enfermedad pulmonar crónica,
    alteraciones digestivas como insuficiencia pancreática y
    elevación de los electrólitos en el sudor. La FQ se
    debe a mutaciones en el gen regulador de la conductancia
    transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) (1),
    localizado en el cromosoma 7q31.2, del que se conocen hasta la
    fecha más de 1,300 mutaciones o polimorfismos en este gen
    (2); la mutación F508del es la más frecuente y se
    observa en 66% de los afectados a nivel mundial (3). La
    frecuencia de portadores sanos (heterocigotos) en la
    población caucásica se ha estimado en 1 de cada 25
    personas (4).

    En América
    Latina pocos países han informado estudios sobre el
    tema. Cuba es el
    país con la mayor incidencia de FQ (1/3,862) (5) y en
    México se
    presenta en 1/9,000 nacimientos (6); Costa Rica es el
    de menor frecuencia de la mutación F508del con 22.9% (7) y
    Argentina el de mayor frecuencia (59.5%) (8). En un estudio en
    hispanos de los Estados Unidos,
    que agrupa personas de casi toda América
    Latina, esta mutación se encontró en 48% de los
    afectados (9).

    En Colombia hasta el momento no se conoce la incidencia
    real de la enfermedad ni la frecuencia de portadores; algunos
    estudios previos hallaron en la mutación F508del una cifra
    cercana a 40%, con amplias variaciones regionales (25%-60%)
    (10,11) y una frecuencia de portadores de 1 en 65, que se debe
    tomar a título indicativo, pues los estudios se hicieron
    en un pequeño número de controles sanos
    (11,12).

    La mutación F508del se encuentra en el exon 10
    del gen CFTR y se produce por la deleción de tres pares de
    bases que llevan a la pérdida de un codon de fenilalanina
    en la proteína. Como es alta su prevalencia, es importante
    realizar estudios de portadores que permitan identificar las
    personas en riesgo de tener
    un hijo afectado por la enfermedad. Esta mutación
    convencionalmente se había diagnosticado mediante la
    reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplificando la
    región específica del exon 10 donde esta se
    encuentra. Sin embargo, como la mutación I507del, se
    encuentra muy cercana a la F508del y corresponde también a
    la deleción de tres pares de bases, este abordaje
    metodológico no permitiría diferenciar estas dos
    mutaciones, lo que puede llevar a errores diagnósticos. La
    PCR seguida del análisis de heterodúplex permite
    distinguir estas mutaciones, gracias a la formación, por
    complementariedad de las cadenas de ADN, de bandas
    específicas para cada una ellas. La ejecución de
    esta metodología ha permitido el estudio
    individual de portadores en otras poblaciones. Para llevar a cabo
    estudios poblacionales exhaustivos en personas sanas que permitan
    conocer indicadores
    epidemiológicos de una enfermedad que se presume
    común en el medio colombiano, se hace necesario poner en
    funcionamiento una técnica rápida, de bajo costo,
    eficiente y confiable que permita identificar los portadores o
    los afectados por la mutación F508del. En el presente
    estudio se practicó la técnica de
    PCR-heterodúplex, aplicada en el análisis
    simultáneo de varias muestras de sangre, para descubrir la
    mutación F508del en especímenes tomados sobre papel
    de filtro S&S903, a fin de ser utilizada en estudios
    poblacionales futuros y determinar la frecuencia de la
    mutación en el país o en pruebas
    diagnósticas de portadores y afectados por tal
    mutación.

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