PCR-heterodúplex por agrupamiento: Implementación de un método de identificación de portadores de la mutación más común causal de fibrosis quística
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RESUMEN: Introducción: La fibrosis
quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva frecuente, con una
incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos. La causan
más de 1,300 mutaciones distintas en el gen regulador de
la conductancia transmembranal de la fibrosis quística
(CFTR). Sin embargo, la mutación F508del es la más
común en la mayoría de las poblaciones.
Objetivos: Desarrollo de una técnica
rápida, de bajo costo y confiable
que permita filtrar con rapidez a los portadores o afectados por
esta mutación que mediante el asesoramiento
genético, contribuya a disminuir la aparición de
nuevos casos y a un diagnóstico temprano de los enfermos y
así lograr un descenso en la morbilidad y la mortalidad
asociadas con la fibrosis quística en Colombia.
Metodología: En el presente estudio se
aplicó la técnica PCR-heterodúplex por
agrupamientos, gracias al análisis de 400 muestras de sangre en papel
filtro obtenidas de individuos asintomáticos para la
FQ.
Resultados: En las pruebas de
validación de la técnica PCR-heterodúplex
por agrupamiento se obtuvo una eficiencia,
reproducibilidad y especificidad de 100% y una sensibilidad de
92%.
Conclusiones: Se demostró la sensibilidad
y reproducibilidad de la técnica PCR
Directa-heterodúplex por agrupamientos de hasta 10
muestras, que se pueden emplear en programas para
filtrar heterocigotos y afectados de F508del.
Palabras clave: Fibrosis quística; CFTR;
Análisis heterodúplex; Mutación; Filtrado
genético; Colombia.
PCR-heteroduplex by grouping: Rapid screening carrier
method for cystic fibrosis F508del mutation in
Colombia
SUMMARY: Background: Cystic fibrosis (CF) is the
most frequent autosomal recessive disorder in the Caucasian
population with an incidence of 1 in 2,500 newborns. More than
1,300 mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator (CFTR) gene that causes CF have been described.
However, mutation F508del is the most common mutation in
different populations around the world.
Objective: To develop a fast, reliable and
low-cost technique to screen carriers and affected individuals
for the F508del mutation. This kind of analysis will have an
impact on genetic counselling to decrease the incidence of new
cases, in the early diagnosis and instauration of appropriate
treatment to decrease morbidity and mortality associated to CF in
Colombia.
Methods: The reliability of the PCR-heteroduplex
by grouping technique by analysis of 400 blood spot samples from
asymptomatic CF patients was defined.
Results: Using PCR-heteroduplex by grouping
technique 100% efficiency, reproducibility and specificity and
92%sensitivity were found.
Conclusions: The sensitivity and reproducibility
of the PCR-heteroduplex by grouping technique up to pooling of 10
samples were demonstrated. This kind of analysis could be used in
heterozygotes and affected screening programs.
Key words: Cystic fibrosis; CFTR; Heteroduplex
analysis; Genetic screening; Colombia.
La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad
genética
autosómica recesiva de mayor frecuencia en la población caucásica, con una
incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos vivos. Los
afectados con FQ presentan enfermedad pulmonar crónica,
alteraciones digestivas como insuficiencia pancreática y
elevación de los electrólitos en el sudor. La FQ se
debe a mutaciones en el gen regulador de la conductancia
transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) (1),
localizado en el cromosoma 7q31.2, del que se conocen hasta la
fecha más de 1,300 mutaciones o polimorfismos en este gen
(2); la mutación F508del es la más frecuente y se
observa en 66% de los afectados a nivel mundial (3). La
frecuencia de portadores sanos (heterocigotos) en la
población caucásica se ha estimado en 1 de cada 25
personas (4).
En América
Latina pocos países han informado estudios sobre el
tema. Cuba es el
país con la mayor incidencia de FQ (1/3,862) (5) y en
México se
presenta en 1/9,000 nacimientos (6); Costa Rica es el
de menor frecuencia de la mutación F508del con 22.9% (7) y
Argentina el de mayor frecuencia (59.5%) (8). En un estudio en
hispanos de los Estados Unidos,
que agrupa personas de casi toda América
Latina, esta mutación se encontró en 48% de los
afectados (9).
En Colombia hasta el momento no se conoce la incidencia
real de la enfermedad ni la frecuencia de portadores; algunos
estudios previos hallaron en la mutación F508del una cifra
cercana a 40%, con amplias variaciones regionales (25%-60%)
(10,11) y una frecuencia de portadores de 1 en 65, que se debe
tomar a título indicativo, pues los estudios se hicieron
en un pequeño número de controles sanos
(11,12).
La mutación F508del se encuentra en el exon 10
del gen CFTR y se produce por la deleción de tres pares de
bases que llevan a la pérdida de un codon de fenilalanina
en la proteína. Como es alta su prevalencia, es importante
realizar estudios de portadores que permitan identificar las
personas en riesgo de tener
un hijo afectado por la enfermedad. Esta mutación
convencionalmente se había diagnosticado mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplificando la
región específica del exon 10 donde esta se
encuentra. Sin embargo, como la mutación I507del, se
encuentra muy cercana a la F508del y corresponde también a
la deleción de tres pares de bases, este abordaje
metodológico no permitiría diferenciar estas dos
mutaciones, lo que puede llevar a errores diagnósticos. La
PCR seguida del análisis de heterodúplex permite
distinguir estas mutaciones, gracias a la formación, por
complementariedad de las cadenas de ADN, de bandas
específicas para cada una ellas. La ejecución de
esta metodología ha permitido el estudio
individual de portadores en otras poblaciones. Para llevar a cabo
estudios poblacionales exhaustivos en personas sanas que permitan
conocer indicadores
epidemiológicos de una enfermedad que se presume
común en el medio colombiano, se hace necesario poner en
funcionamiento una técnica rápida, de bajo costo,
eficiente y confiable que permita identificar los portadores o
los afectados por la mutación F508del. En el presente
estudio se practicó la técnica de
PCR-heterodúplex, aplicada en el análisis
simultáneo de varias muestras de sangre, para descubrir la
mutación F508del en especímenes tomados sobre papel
de filtro S&S903, a fin de ser utilizada en estudios
poblacionales futuros y determinar la frecuencia de la
mutación en el país o en pruebas
diagnósticas de portadores y afectados por tal
mutación.
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