Identificación de Pseudocercosporella herpotrichoides (fron) deighton, agente causal de la mancha ocular del trigo en la zona sur de Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta y observación macro y microscópica de
plantas
afectadas, y aislamiento del agente causal

Plantas de trigo de las variedades SNA 400 y Francia
afectadas por la sintomatología descrita, se colectaron a
fines del año 1994 en la localidad de Quilquén, a
12 km al noroeste de la ciudad de Traiguén (IX
Región). El examen macro y microscópico
consistió en la observación de las plantas, del
tejido afectado, y en el raspado superficial de la zona afectada
con el extremo de un bisturí sobre una gota de agua destilada
estéril depositada sobre un portaobjeto limpio. Trozos de
2-3 cm de la zona basal de cañas afectadas se
desinfectaron superficialmente en una solución de
hipoclorito de sodio al 2% + etanol al 20% por 2 min, seguidos de
dos lavados consecutivos en agua destilada estéril , y
secados sobre papel filtro estéril bajo campana de
aire de flujo
laminar. Secciones del tejido afectado de 2-3 mm se sembraron en
medio agar-agua (AA) + sulfato de estreptomicina (SE) (150 mg
mL-1) y mantenidos por 10 días a temperatura
ambiente,
seguido de 20 días a 10-12ºC.

La identificación del hongo se basó en la
observación y medición bajo microscopio
óptico (Carl Zeiss, Mod. Standard) con contraste de fases,
de las características morfológicas de las conidias
desarrolladas en medio de cultivo.

Pruebas de patogenicidad

Se realizaron pruebas de
patogenicidad con el hongo multiplicado en AA, en
plántulas de trigo de la var. Otto-Baer de 12 días
de crecimiento. Para esto, se desarrollaron primeramente cultivos
monospóricos en medio AA + SE, colectando conidias con
micropipeta accionada repetidamente sobre una gota de agua
destilada estéril depositada sobre los
conidióforos. Luego, la suspensión obtenida se
distribuyó con rastrillo de vidrio
estéril en un nuevo medio AA + SE. Las placas se
mantuvieron a temperatura de laboratorio
(15-20ºC) por 7 días. Posteriormente, se repicaron
individualmente las conidias germinadas visualizadas bajo
microscopio óptico, a medio AA, incubando las placas por
20 días a temperatura de laboratorio.

Se realizaron dos pruebas de patogenicidad: una de ellas
consistió en la inoculación directa de trozos de
agar con crecimiento del hongo, en la base de plántulas
desarrolladas en mezcla 1:1 de suelo y arena
esterilizada contenida en tubos de ensayo de 25 x
190 mm, incubadas en condiciones de laboratorio a 15-20ºC
por 25 a 30 días. Un total de 12 plantas se inocularon de
esta forma, y otras 6 se inocularon con agar sin el hongo para
emplearlas como testigos. Las plantas se regaron con agua
destilada estéril cada 3-4 días. La segunda prueba
consistió en la colocación en forma de anillo de
cilindros de cañas de trigo maduras y sanas de 1 cm de
largo, en la base de plantas de trigo var. Otto-Baer (Macer,
1966, citado por Murray, 1992), los cuales se esterilizaron
previamente en matraces de vidrio en autoclave, inoculados con
trozos de agar con crecimiento del hongo y dejados colonizar por
el microorganismo
por 35-45 días bajo temperatura de laboratorio. Se
inocularon un total de 5 macetas con 4 plantas cada una,
desarrolladas en mezcla 1:1 de suelo y arena esterilizada
contenida en macetas de plástico
desechables de 150 mL de capacidad. Otras dos macetas, con 4
plantas cada una, se dejaron como testigos, inoculando con
cilindros de cañas esterilizados, pero sin el hongo. Todas
las macetas se incubaron en invernadero por 50 días,
regándolas cada 4 días con agua destilada hasta la
evaluación.

La evaluación de las plantas inoculadas se
realizó a través del examen visual de lesiones en
el tejido de la zona inoculada, la observación bajo
microscopio óptico de las vainas foliares desprendidas de
la zona de inoculación, y la tinción del hipocotilo
con una solución al 10% de tinta azul Pelikan en 25% de
ácido acético, para detectar la presencia de placas
de infección del hongo y sitios de penetración de
las hifas. Estos últimos presentan la
característica de pequeños collares o anillos de
material mucilaginoso extracelular, alrededor del sitio de
penetración de las hifas bajo las placas de
infección en las vainas foliares internas (Daniels, 1993).
Inmediatamente después de la evaluación, tejido
proveniente de las plantas inoculadas se desinfectó
superficialmente con hipoclorito de sodio al 1,5% por 2 min,
separando posteriormente las láminas, cortándolas
en pequeños trozos y sembrando estos últimos en AA
+ SE con el propósito de reaislar el agente
causal.

Prospección de sementeras de
trigo

Durante las temporadas agrícolas 1994/95 a
1996/97 se revisaron sementeras de trigo ubicadas preferentemente
en zonas de suelos
rojo-arcillosos a transicionales de la VIII y IX regiones, que
presentaban "espigas blancas" y/o tendedura de plantas.
Además se examinaron en laboratorio plantas de trigo
traídas por agricultores de la X Región. La
identificación se basó en la detección de
síntomas típicos de la enfermedad.

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

Observación macro y microscópica de
plantas afectadas, y aislamiento del agente causal

El examen macro y microscópico de las plantas
afectadas permitió observar los síntomas
característicos de la mancha ocular, esto es, lesiones
ovaladas en sentido longitudinal de las cañas, con bordes
más oscuros y centro grisáceo, y masas
estromáticas de color negro en el
centro de la lesión (Figura 1). Además, micelio
grisáceo en el tejido interno de las cañas,
pudrición de la base y quiebre de éstas en esta
misma zona, "espigas blancas" sin granos o con granos "chupados",
y ausencia de pudrición de raíces. El raspado
superficial de la zona afectada permitió observar la
presencia de esporas hialinas, filiformes, aciculares, con 4 a 7
septos, de longitud variable entre 50 y 70 m m y diámetro entre 1,8 y
2,8 m m (Figura
2).

Figura 1. Cañas de trigo var.
SNA 400 con lesiones elípticas, típicas de la
mancha ocular.
Figure 1. Stems of wheat cv. SNA 400 with elliptical "eye"
lesions, typical of eyespot.

Figura 2. Conidias de
Pseudo-cercosporella herpotrichoides obtenidas por raspado
de tejido desde plantas de trigo infectadas (40X).
Figure 2. Conidia of Pseudo-cercosporella
herpotrichoides obtained from infected
wheat plants by seraping the affected tissue (40X).
 

Figura 3.
Desarrollo de
Pseudo-cercosporella herpotrichoides en medio AA +
estreptomicina (40X).
Figure 3. Growth of Pseudo-cercosporella herpotrichoides
on AA +streptomycin medium (40X).

Figura 4. Plantas de trigo var.
Otto-Baer inoculadas con Pseudocercosporella
herpotrichoides aislado de la zona de Traiguén. Una
planta testigo (izq.) y tres plantas inoculadas mostrando las
zonas afectadas (flechas).
Figure 4. Wheat plants cv. Otto Baer inoculated with
Pseudocercosporella herpotrichoides isolated from the
Traiguén farmland area. One check plant (left) and three
inoculated ones showing the affected zones (arrows).
 

Figura 5. Placas de infección
observ adas en las vainas foliares inernas de las plantas de
trigo inoculadas (25X).
Figure
5. Infection pllaques observed in the internal leaf
sheaths of inoculated wheat plants (25 X).

Figura 6. Sitios de penetración
de hifas de Peseudocercosporella herpotrichoides
observadas en las vainas foliares internas de plantas de trigo
inoculads, con la formación de anillos o collares de
mucílago extracelular(flecha) (40X).
Figure 6. Penetration sites of Peseudocercosporella
herpotrichoides hypae observed in the internal leaf sheaths
of inoculated wheat plants, with the formation of extrecellular
mucilage collars (arrow) (40X).

En la siembra en medio AA + SE, al cabo de 20
días se observaron colonias de desarrollo lento con 0,7 cm
de diámetro en promedio, de color gris verdoso muy claro,
de bordes enteros, y que produjeron conidias hialinas,
filiformes, rectas a curvadas, con 3-6 septas, mayoritariamente
con 4-5 y ocasionalmente con 7 septas, aciculares, y una longitud
promedio determinada en 87 conidias elegidas al azar, de 63,5
µm (40,9-81,9 µm) (Cuadro 1), y un diámetro de
1,9 a 2,8 m m.
Las conidias se originaron agrupadas desde conidióforos
libres, cortos, con ninguna o escasa ramificación (Figura
3). La longitud de las conidias resultó similar a lo
señalado por Nicholson et al. (1991), para aislamientos de
P. herpotrichoides var. herpotrichoides de Inglaterra
(Cuadro 1).

Cuadro 1. Longitud de conidias
(µm) de Pseudocercosporella herpotrichoides
obtenidas desde aislamientos de la zona de Traiguén, IX
Región, Chile, comparadas con aislamientos de Inglaterra y
Alemania.
Table 1. Length of conidia (µm) of Pseudocercosporella
herpotrichoides obtained from isolates from Traiguén
locality, 9th Region, Chile, compared to isolates from
England and Germany.

a Nicholson et
al. (1991).
b Nirenberg, 1981 (citado por Daniels,
1993).

Pruebas de patogenicidad

En la prueba de patogenicidad efectuada en tubos de
ensayo, a los 30 días se observó en 10 de las 12
plantas la presencia de hojas amarillentas en los tubos
inoculados y un menor desarrollo de éstas. En la base de
las mismas se observó una coloración café
pálida a oscura, longitudinal, de 0,5 a 1,5 cm, en algunos
casos circundando el tallo (Figura 4). El examen de la zona
afectada bajo el microscopio óptico, permitió
observar masas estromáticas o placas de infección
(Figura 5) con hifas corredizas desarrollándose sobre el
tejido del hipocotilo y entre las láminas foliares
internas, además de sitios de penetración de hifas
que conforman una especie de anillo o collar (Figura 6). Todas
estas estructuras
corresponden a las descritas por Daniels (1993). Las plantas
testigo presentaron un mayor desarrollo que las inoculadas con el
patógeno, con hojas verdes y ausencia de síntomas
de la enfermedad en la base de las cañas. De la siembra
del tejido afectado proveniente de las plantas inoculadas con el
hongo patógeno, a los 25-30 días se obtuvo el
desarrollo de colonias características de P.
herpotrichoides.

En la prueba de patogenicidad efectuada en macetas
plásticas con la inoculación de anillos de
cañas de trigo colonizadas con el hongo patógeno, a
los 20-25 días se observó una notoria amarillez de
todas las plantas inoculadas y menor desarrollo de éstas.
La zona de inoculación presentó una evidente
coloración café a café oscuro, circundando
completamente el tallo en la mayoría de los casos, o con
el desarrollo de lesiones elípticas longitudinales
características de mancha ocular en 4 de 20 plantas. Al
observar la zona basal de las láminas foliares bajo el
microscopio óptico, se detectó la presencia de
placas de infección típicas del agente infeccioso,
y los sitios de penetración de las hifas con la
formación de collares o anillos de exudados mucilaginosos
alrededor de estos sitios. Las plantas testigo presentaron un
mayor desarrollo, con láminas foliares verdes y ausencia
de síntomas en la base de las cañas.

Prospección de sementeras de
trigo

Tanto la prospección de sementeras de trigo como
la evaluación de plantas en laboratorio, determinaron la
presencia de la enfermedad en las localidades de Mulchén y
Santa Bárbara en la VIII Región; Traiguén,
Quilquén, Quino, Galvarino, Lautaro y Perquenco en la IX
Región; y en los sectores de Cudico y el camino San Pablo
a Trumao, en la X Región.

CONCLUSIONES

La sintomatología observada en las plantas
afectadas provenientes de la zona de Traiguén, los
resultados obtenidos en las observaciones macro y
microscópicas del tejido afectado, las
características morfológicas del hongo aislado, la
forma y tamaño de las conidias, los resultados de las
pruebas de patogenicidad, la formación y
características de las placas de infección y sitios
de infección observadas en las láminas foliares
internas del hipocotilo de las plantas inoculadas, permiten
identificar la sintomatología descrita como la enfermedad
conocida como "mancha ocular del trigo", y al organismo aislado
como Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton,
hongo Deuteromycete causante de esta patología.
Además, de acuerdo a las características de las
conidias obtenidas de los aislamientos de la zona de
Traiguén, los resultados sugieren que se trataría
de P. herpotrichoides var.
herpotrichoides.

La enfermedad se encontró afectando con
particular intensidad a sementeras de trigo ubicadas en suelos
rojos-arcillosos y transicionales de la zona comprendida entre
Quilquén y Galvarino, en la IX Región.
También fue detectada en localidades de la VIII y X
regiones.

Esta corresponde a la primera detección de la
presencia de la mancha ocular y su agente causal afectando
sementeras de trigo en Chile.

LITERATURA CITADA

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Orlando Andrade V. 2
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Temuco, Chile.