Efecto de una dieta con bajo aporte de selenio sobre la respuesta inmune a la vacuna Brucella abortus Cepa RB51 en vacas lecheras (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales y grupos
experimentales. Se utilizaron 12 vacas Frisón Negro
entre 4 y 9 años de edad con 7-8 meses de
gestación, provenientes de un predio lechero libre de
tuberculosis,
leucosis y brucelosis. Los animales fueron
asignados al azar a dos grupos de 6 vacas cada uno,
homogéneo en edad (6,5 ± 0,9 años),
número de partos (3,5 ± 1,4), peso corporal (594
± 69,7 kg), tiempo de
gestación (230 días), producción de leche en la
última lactación (6406 ± 852,6 l) y
alimentados con una dieta de bajo contenido de Se. Un grupo fue
alimentado sólo con la dieta pobre en Se (Se-D), mientras
que al otro grupo se les restituyó el balance nutricional
normal de Se mediante la suplementación con Se
(Se-S).

Alimentación y manejo. Los animales
fueron mantenidos durante todo el experimento en
estabulación permanente (piso de hormigón con cama
de paja y comederos individuales) y agua ad
libitum. A partir de aproximadamente 45 días antes
del parto los
animales fueron alimentados con 9,5 kg de heno de pradera natural
(Se=0,02 ppm de materia seca
(MS)), más 1 kg de concentrado comercial (Se=0,12 ppm de
MS). Posterior al parto, los animales fueron mantenidos en
similares condiciones, con dos ordeñas al día (14
L/día) y una ración diaria de 11,5 kg de heno
(Se=0,02 ppm), concentrado (Se=0,12 ppm) hasta 5 kg, según
requerimientos por producción, 0,5 kg de afrecho de soya
(Se=0.17 ppm de MS), 0,5 kg de sebo para alimentación animal
(Se<0,01 ppm de MS), urea 0,12 kg (Se < 0,01 ppm de MS) y
0,15 kg de mezcla mineral sin Se.

El contenido de Se de la ración fue medido
mediante espectroscopia de plasma acoplado inductivamente con
detector de masa (ICP-MS), en muestras digeridas en ácido
nítrico y perclórico1. El aporte de Se
en la ración fue de 0,048 ppm de MS (equivalente al 16% de
los requerimientos según NRC 2001). En el transcurso del
período de estudio se registró la condición
corporal de todos los animales utilizando la escala de 1 a 5
según Edmonson y col (1989).

Suplementación con selenio. El grupo
Se-S fue suplementado con 1 mg de Se/kilo de peso vivo (pv)
usando selenato de bario2 en dosis única de 1
ml/50 kg/pv subcutáneo, administrado aproximadamente 45
días antes del comienzo de los partos. De cada vaca se
tomaron dos muestras de sangre (con y sin
heparina), por venopunción coccígea previo a la
suplementación y luego cada 15 días durante todo el
experimento, el suero obtenido fue guardado a –20°C
hasta su posterior análisis.

Evaluación de la actividad sanguínea
de glutatión peroxidasa (GSH-Px). La actividad
sanguínea de GSHPx se evaluó quincenalmente en
hemolizados de las muestras de sangre con heparina. Su
determinación se realizó empleando reactivos
comerciales3 basados en la técnica
cinética compuesta NADPH-dependiente descrita por Paglia y
Valentine (1967) modificada según Ceballos y col (1998).
Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro Hitachi
40204 y la actividad fue expresada en U/g
Hb.

Inmunización con la vacuna RB51. Todos
los animales fueron inmunizados con una dosis completa (1-3,4 x
1010) de la vacuna Brucella abortus Cepa
RB515, 100 días posteriores a la
administración de Se.

Preparación antigénica del extracto
total de RB51. Para las pruebas de
intradermorreacción se preparó antígeno de Brucella abortus Cepa
RB51 de acuerdo al protocolo
descrito por Leyán y
col (2005). La concentración de proteínas
se determinó por el método de
Bradford utilizando un kit comercial6.

Determinación de la concentración de
inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA en suero. Se cuantificaron
mediante el método de inmunodifusión
radial7. La determinación se realizó
previo a la administración de Se (día 0) y
posterior a la administración de Se, los días 30,
60 y 90.

Determinación de la respuesta inmune humoral
específica a la vacuna RB51. La respuesta humoral se
determinó por el método de ELISA indirecto en
muestras de suero (1:2000) obtenidas los días 0, 15, 30,
45 y 60 desde la vacunación. En resumen, la placa de
poliestireno se sensibilizó con 0,5 µg de
proteína del extracto total de RB51 por pocillo, se
adicionó el suero y fueron incubadas a 4°C durante 18
horas. Para detectar los anticuerpos anti Brucella
abortus, se utilizaron anticuerpos anti IgG de bovino unidos
a peroxidasa8. Posteriormente la reacción fue
revelada con o-Phenylenediamine9 y peróxido de
hidrógeno como sustrato. La lectura se
realizó en un lector de ELISA ElX 800
automático10.

Determinación de la respuesta inmune celular
específica a la vacuna RB51. La respuesta inmune
celular se evaluó mediante pruebas de
intradermorreacción y análisis
histológico:

Intradermo reacción. Se efectuó
en los dos grupos de animales previamente sensibilizados con la
administración de la vacuna RB51. La respuesta se
determinó 60 días después de la
vacunación mediante inyección intradérmica
del extracto de Brucella abortus Cepa RB 51 en la
región cervical, en dosis de 16 µg y 32 µg. La lectura se
realizó a las 72 h con un cutímetro de resorte.
Como control de la
reacción se utilizó Tuberculina PPD
bovino11 en los mismos animales. Como control de la
especificidad del antígeno se realizó la prueba de
intradermo reacción a terneras no inmunizadas con
RB51.

Estudio histológico. Se realizó
en muestras de tejido obtenidas mediante biopsia del área
de reacción de la piel. Las
muestras fueron fijadas en formalina tamponada al 3,9% y
procesadas de acuerdo a las técnicas
histológicas convencionales. Los cortes
histológicos fueron teñidos con hematoxilina y
eosina para su estudio.

Análisis estadístico. Se
determinaron las medias, desvíos y error estándar
por grupo y período de muestreo para
cada variable. Posterior a evaluar la normalidad de la distribución de los datos
(Kolmogorov-Smirnov) y su homosedastisidad (Bartlett’s),
las diferencias entre períodos se evaluaron mediante
ANDEVA y la prueba de comparación múltiple de
Tukey. Las diferencia entre grupos se evaluaron mediante la
prueba de "t" de Student. Los análisis se realizaron con
el programa Prism
3.0 y se empleó un nivel de significancia del
95%.

RESULTADOS

El ensayo
comprendió el período preparto, parto y lactancia de
las vacas, tiempo en el cual los animales de ambos grupos
presentaron variaciones en su condición corporal propias a
su estado
fisiológico, sin mostrar diferencias entre los grupos
(P>0,05). El preparto fue de 3,3 para descender a 2,3 al mes
de lactancia y recuperar a 3,0 a los 180 días de
lactancia.

Los animales mantenidos sólo con la ración
con bajo contenido de Se presentaron una disminución
(P<0,05) en la actividad de GSH-Px hasta valores
considerados bajos (<100 U/g Hb) a los 30 días y
deficientes (<60 U/g Hb) a los 150 días. La
suplementación con selenato de bario aumentó
significativamente (P<0,05) la actividad GSH-Px desde
118,5±29 U/g Hb (previo a la suplementación) a
valores mayores de 300 U/g Hb al final del período
experimental (figura 1).

Las concentraciones de IgG, IgM e IgA de ambos grupos de
animales fueron similares (P>0,05) (cuadro 1). Por otra parte,
entre los días 30 y 60 postsuplementación,
correspondiente con el período de partos, se
observó una disminución significativa (P<0,05)
de la concentración de inmunoglobulinas IgG en ambos
grupos (cuadro 1).

La inducción de respuesta inmune humoral
específica a la vacuna RB51 en ambos grupos de animales
desarrolló similar cinética de producción de
anticuerpos, con un aumento (P<0.05) en el día 15
postinmunización (figura 2). Aun cuando no se presentaron
diferencias entre grupos (P>0.05), se observó una
tendencia a títulos de anticuerpos más alto en el
grupo Se-S (figura 2).

A las 72 h de iniciadas las pruebas de intradermo
reacción, se observó aumento de volumen e
induración local en ambos grupos de animales. Las
respuestas, tanto al usar 16 µg como 32µg de
proteína total de Brucella abortus (figura 3), fueron
similares para ambos grupos, con una tendencia a ser mayor en el
grupo Se-S, sin llegar a ser estadísticamente
significativa. El análisis histológico de la
reacción inflamatoria en el sitio de estimulación
en ambos grupos de animales demostró infiltrado
inflamatorio mononuclear con presencia de eosinófilos
(figura 4). Por otra parte, las pruebas de intradermo
reacción realizadas con tuberculina en los mismos animales
y las realizadas con extracto de RB51 en terneras no vacunadas
contra brucelosis fueron negativas.  

DISCUSIÓN

La condición corporal de los animales de ambos
grupos disminuyó progresivamente durante el período
experimental, como consecuencia de la producción
láctea y el estricto control en la alimentación. El
efecto de la dieta con bajo contenido de Se se tradujo en una
disminución lenta y progresiva de la actividad de la
enzima GSH-Px en los eritrocitos, que se hizo mínima a los
150 días. Por otra parte, la suplementación con Se
aumentó la actividad de GSH-Px desde los 45 días
con respecto al valor basal,
tiempo que guarda relación con la incorporación del
Se a las seleno enzimas en el
glóbulo rojo durante la eritrogénesis (Grace 1994).
El efecto del selenato de bario se mantuvo durante los 6 meses de
estudio debido a la lenta liberación del Se (Lee y col
1999), de manera similar a lo observado por Leyán y col
(2005) al utilizarlo en vaquillas con mismos
propósitos.

La disminución de IgG en ambos grupos, entre los
días 30 y 60 con respecto al valor basal del día 0
coincide con el período periparto, en el cual se produce
el transporte
activo de inmunoglobulina IgG1 desde la circulación
sanguínea a la glándula mamaria (Larson y col
1980). Aun cuando no se presentan diferencias significativas en
la concentración de IgG entre ambos grupos, permanece la
duda si la eficiencia del
transporte activo a la glándula mamaria fue mayor en los
animales suplementados, como ha sido sugerido por Swecker y col
(1995). En este mismo sentido Leyán y col (2004)
señalaron que el uso de selenato de bario en vacas
gestantes selenio-deficientes disminuye la concentración
de IgG1 sin afectar los niveles de IgG total en el
calostro.

Si bien los anticuerpos inducidos por la vacuna RB51
contra Brucella abortus no son detectados con la prueba
de aglutinación rápida usada como prueba de campo,
estos sí son detectados mediante ELISA (Schurig y col
1991, Cheville y col 1993, Jiménez de Bagues y col 1994).
Al respecto, los resultados demostraron que la deficiencia de Se
no alteró cualitativamente la respuesta de anticuerpos
durante todo el experimento; sin embargo, durante todo el
período de estudio se observó una tendencia
levemente mayor en los animales suplementados. En ambos grupos el
aumento del día 15 corresponde a la respuesta secundaria a
la revacunación, ya que estos animales provenían de
un predio libre de brucelosis y habían sido vacunados
entre los 3 y 8 meses de edad con la vacuna Cepa 19. Es
interesante señalar que aun cuando las diferencias entre
grupos no son significativas durante el período
experimental, la persistencia de los títulos es levemente
mayor en los animales suplementados con Se. Estudios previos
también señalan que la suplementación con Se
no tiene efecto significativo sobre la respuesta inmune humoral a
Brucella abortus en vaquillas (Nemec y col 1990,
Leyán y col 2005).

La respuesta cutánea al antígeno total de
Brucella demostró ser especifica, ya que el grupo
de animales no vacunados usados como control no presentó
reacción local ni alteraciones microscópicas en el
tejido. La reacción en los animales vacunados indica
desarrollo de
la inmunidad celular, la cual es importante para la
protección contra la enfermedad natural (Oliveira y col
2002, Wyckoff 2002). Un aspecto importante de considerar es la
relación entre la actividad de GSH-Px y la reacción
intradérmica; al respecto, los animales suplementados
tenían una actividad de GSH-Px de 280 U/g Hb en el momento
de realizar la prueba. En este mismo sentido, los resultados
informados por Leyán y col (2005), utilizando similares
condiciones experimentales en vaquillas, señalan que en
animales con 400 U/g Hb se produjo una disminución de la
respuesta inmune celular. Esta diferencia sugiere que en los
animales deficientes de Se la suplementación con selenato
de bario no afectaría o tiende a mejorar la respuesta,
pero en animales con estatus normal de Se su
suplementación eleva la actividad de GSH-Px a valores que
coinciden con una disminución de la respuesta celular
(Leyán y col 2005).

La ausencia de diferencias en los valores
obtenidos, tanto en la respuesta inmune específica como en
la concentración de inmunoglobulinas séricas, no se
relaciona con las marcadas diferencias entre grupos que establece
la medición de la actividad enzimática
de GSH-Px. Este hecho nos estaría revelando que otros
mecanismos que son independientes de la actividad de GSH-Px
podrían intervenir en la modulación
de la capacidad antioxidante, dando lugar a una respuesta
biológica compensatoria en la red antioxidante destinada a
minimizar los efectos de la deficiencia nutricional, lo que
otorgaría protección a las células
involucradas en la respuesta inmune. En este sentido, se ha visto
que algunas isoformas de glutatión transferasa, no
dependientes de Se, pueden ser inducidas en situaciones de
deficiencia de Se, incrementando su actividad y contribuyendo a
la eliminación de peróxidos orgánicos (Chang
y col 1990). Por otra parte, también se ha señalado
que la disminución de la actividad de GSHPx parece ser
compensada con un incremento en la actividad de la catalasa
(Himeno y col 1993). Estos mecanismos contribuirían a
mantener la capacidad de respuesta frente a una agresión
oxidativa. También es necesario considerar que el rol que
desempeña GSH-Px sería secundario en la
protección y estabilidad de los lípidos de
membrana, pudiendo ser más importante el estatus de
vitamina E que el de Se (Gutzwiller 1998). Desde otro punto de
vista, se ha sugerido que el rol de GSH-Px como enzima
antioxidante in vivo podría ser menor que su
función
homeostática, como una forma de almacenamiento de
Se (Nève 2000). Por otra parte, un factor importante que
se debe considerar al momento de explicar la ausencia de
diferencias entre grupos Se-S y Se-D proviene de los estudios
desarrollados por Weitzel y col (1990) y Guan y col (1995),
quienes encontraron que la isoforma GSH-Px fosfolípido
hidroperóxido disminuye su actividad más lentamente
que la celular. El rol biológico que desempeña es
sinérgico a la vitamina E y consiste en remover los
fosfolípidos hidroperóxidados a nivel de membranas
y que no constituyen sustrato para la GSH-Px celular. Esto
determina que en situaciones de deficiencia de Se, en donde la
actividad de GSH-Px celular se ve fuertemente deprimida, la
actividad enzimática de GSH-Px fosfolípido
hidroperóxido continúe expresándose por un
lapso más prolongado permitiendo a la célula
soportar una agresión oxidativa.

Evaluar la influencia de la nutrición sobre la
respuesta inmune es compleja, especialmente en vacas en
producción, ya que los animales se encuentran
influenciados por el estrés
ambiental, condiciones reproductivas como la gestación y
el parto, las exigencias de producción de leche y
distintos desafíos antigénicos ambientales. Aun
así, los resultados preliminares obtenidos en este estudio
de diseño
experimental de alimentación controlada permiten concluir
que un bajo aporte nutricional de Se no afecta en forma
significativa la inmunocompetencia en vacas de lechería.
Sin embargo, se requieren mayores estudios tendientes a
establecer con mayor precisión el efecto del estatus de Se
(GSH-Px) sobre la respuesta inmune.

Notas

1 Hill Laboratories, N
Z.

2 Deposel‚ Young Animal Health Ltd.,
NZ.

3 RANSEL®. Laboratorios Randox, Crumlin,
UK.

4 Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim.

5 Professional Biological Company, Denver,
Co, USA.

6 Bio-Rad, Hercules CA.

7 BINDARID®. The Binding Site,
UK.

8 Capel, ICN Pharmaceuticals, Inc.
USA.

9 Sigma, USA.

10 Bio-Tek Instruments Inc. USA.

11 Intervet Chile Ltda. Chile.

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