Técnicas inmunohistoquímicas para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli enteropatógeno
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RESUMEN: Con el propósito de
evaluar dos técnicas
inmunohistoquímicas (IHQ), Inmunofluorescencia Indirecta
(IFI) y Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (LSAB) para la
identificación de antígenos fimbriales de E. coli y su
correlación con el Test de
Aglutinación, se realizó una inoculación
experimental con cepas enteropatógenas de E. coli
que expresaban antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 en
cerdos neonatos, los cuales no ingierieron calostro y se
mantuvieron aislados de sus madres.
El antígeno F4 se distribuyó en duodeno,
yeyuno e íleon, en cambio los
antígenos F5, F6 y F41 se visualizaron en íleon y
con menor frecuencia en yeyuno y duodeno. El Test de
Aglutinación fue eficaz en la identificación de
antígenos F4 y F5, no así para F6 y F41.
Los resultados del presente estudio demuestran que tanto
LSAB en tejidos embebidos
en parafina como IFI en secciones obtenidas en crióstato,
son igualmente efectivas para identificar antígenos
fimbriales de E. coli y pueden ser utilizadas como un
método
rápido de diagnóstico en cerdos lactantes con cuadro
de colibacilosis y en estudios epidemiológicos de diarreas
neonatales.
SUMMARY: A study to evaluate two
Inmunohistochemistry (IHC) techniques (Indirect
Immunoflourescense IFI and Streptavidina-Biotine-Peroxidase LSAB)
to identify the antigen fimbrial of different enteropathogenic
strains of E. coli was done, correlating the results with
the Aglutination test.
Newborn piglets without calostrum were innoculated with
enteropathogenic strains of E. coli which contained F4, F5, F6
and F41. Piglets were analysed to microbiologically isolate and
identify the antigen fimbrial in the small intestine with IHC and
Aglutination test.
The IHC techniques , identified F4 fimbriae was in the
three intestinal segments ; However, the Ag F5, F6 and F41 were
found in the ileon and jejunum with lesser frequency than in the
duodenum. The aglutination test identified antigen F4 and F5 but
was not able to identify F6 and F41.
These results suggest that IFI in cryostat-microtome
sections and LSAB in paraffin embedded tissues, are effective and
may be useful for a rapid analysis and for epidemiological
studies of suckling pigs with diahrroea for E. coli
.
Palabras claves: E. coli
enteropatógeno, fimbrias, inmunohistoquímica,
inoculación experimental, lechones.
Key words: Enteropathogenic E. coli,
fimbriae, inmunohistochemical, experimental inoculation, suckling
pigs.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad se considera a E. coli como el
agente etiológico de mayor importancia en la
presentación de cuadros diarreicos en cerdos lactantes.
Entre los factores de virulencia que son los responsables de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad, se encuentran
las fimbrias o pili, necesarios para permitir la adhesión
y colonización de cepas enteropatógenas (EPEC) y
enterotoxigénicas (ETEC) de E. coli a las células
epiteliales del intestino delgado del huésped, con
posterior elaboración de toxinas en caso de ETEC, las que
estimulan la secreción de fluídos
con producción de diarrea
(Fairbrother, 1994).
Las fimbrias corresponden a apéndices
proteinaceos no flagelares, fibrilares, de 0,2 µm de largo
por 2 – 7 nm de ancho, distribuidos en la superficie de la
bacteria, pudiendo variar su número desde unos pocos a
varios cientos. E. coli produce una o varias adhesinas
fimbriales: I, CFAI, CFAII, K88, K99, 987P, Att 25 o FY, F41,
F107, esta variedad de nomenclatura ha
creado confusión, por lo que en la actualidad se denomina
F1, F2, F3, F4, F5, F6, F17, F41, F107, respectivamente (Arp,
1988; Fairbrother, 1993; Nystrom, 1994), encontrándose en
cuadros de diarrea neonatal en porcinos asociados con (ETEC), los
antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 (Mainil y col.
1995).
Entre los método más utilizados para
realizar el diagnóstico de colibacilosis en cerdos
lactantes, se encuentra el aislamiento bacteriológico de
E. coli con posterior identificación de fimbrias y
toxinas presentes, metodología que requiere de cierto
período de tiempo para su
realización y está sujeto además a las
condiciones de cultivo. Sin embargo, en la actualidad, el
diagnóstico se ha facilitado mediante la
implementación de exámenes
inmunohistoquímicos (IHQ), los que son rápidos,
seguros y
simples.
Dada la importancia que tienen las fimbrias como factor
de virulencia de E. coli en la presentación de
diarrea en cerdos lactantes, se realizó el presente
estudio con el objetivo de
implementar dos técnicas IHQ para la identificación
y localización de fimbrias en los diferentes segmentos del
intestino delgado, en cerdos neonatos que no recibieron calostro
y quie fueron inoculados experimentalmente con diferentes cepas
de E. coli. Además se compararon dichas
técnicas con el Test de aglutinación, que se
realizó con las cepas de E. coli que se aislaron
por cultivo bacteriológico.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales de Experimentación:
se utilizaron 25 lechoes neonatos separados de sus madres
inmediatamente después del parto a fin de
evitar la ingestión de calostro, contacto con la cerda y
con el medio
ambiente.
Cepas de E. coli Utilizadas: las cepas
bacterianas utilizadas en la presente investigación (E. coli F4, F5, F6 y
F41) forman parte del cepario del Instituto de Microbiología de la Facultad de Ciencias, de
la Universidad
Austral de Chile. Dichas cepas se desarrollaron en medio agar CFA
(Colonization Factor Antigen) con el propósito de
favorecer y estimular la producción de fimbrias siguiendo
el procedimiento
descrito por Evans y col. (1979).
Una vez comprobada la presencia de fimbrias en las cepas
aisladas, por el método de aglutinación, se
prepararon inóculos suspendiendo la cepa de E. coli
en un tubo con solución buffer (108 –
109 bacterias/ml),
de acuerdo al procedimiento descrito por McFarland's (Mac Faddin,
1980).
Grupos Experimentales: se constituyeron cinco
grupos de 5
cerdos cada uno (cuadro 1), los cuales fueron mantenidos
a 25-30ºC, durante 24 horas, alimentados con
Glucosa al
5%/1 vía ora, siendo posteriormente
eutanasiados con sobre dosis de pentobarbital
sódico/2 vía intracardíaca. En
los Grupos IV y V se descartaron dos cerditos, uno de
cada grupo, por
presentar marcada debilidad al momento de la
inoculación.
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