Comparación de dos vías de inoculación en la producción de anticuerpos contra fructosa 1,6-bisfosfatasa en huevos de gallina
Publicación original: |
(*) Este trabajo fue
financiado, en parte, por el proyecto FONDECYT
1010720 y por la Dirección de Investigación, Universidad
Austral de Chile, DID-UACH 200302.
Summary: The present study compares
the intramuscular (IM) and subcutaneous (SC) inoculation routes
for antibody production in hens. Six laying Leghorn hens were
separated in two identical inoculation groups and immunized with
purified Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) from pig kidney
extract. The hens were inoculated at two and four week intervals
with an emulsified mixture of purified FBPase and Freund’s
complete adjuvant (first inoculation) and Freund’s
incomplete adjuvant (second and third inoculations). The egg yolk
antibodies were purified and titrated with immune dot blot. High
amounts of antibody were produced by both hen groups and the
titers were comparable. However, in each inoculation group we
found some differences which we attributed to individual
variations. These results show that both routes of inoculation
(SC and IM) are equally effective in generating hen antibodies
against a cytosolic enzyme. Moreover, the immune-blot analysis
revealed that the antibodies anti-FBPase obtained from
intramuscular and subcutaneous inoculations recognized the enzyme
in rat liver extract containing much more than 50 different
proteins. These results demonstrated that the antibodies produced
by these two routes of inoculation are highly
specific.
Key words: antibodies, hen’s eggs,
FBPase.
Resumen: El presente estudio
comparó las vías de inoculación
intramuscular (IM) y subcutánea (SC) para la producción de anticuerpos en gallinas. Seis
gallinas Leghorn de postura fueron separadas en dos grupos de
inoculación idénticos e inmunizadas con
fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) purificada de
riñón de cerdo. Las gallinas fueron inoculadas con
un intervalo de 2 y 4 semanas, con una emulsión mezclada
con FBPasa purificada y adyuvante de Freund completo (primera
inoculación) y adyuvante de Freund incompleto (segunda y
tercera inoculación). Los anticuerpos obtenidos desde yema
de huevo fueron purificados y titulados por ensayo en
gota. Elevadas cantidades de anticuerpo fueron producidas por
ambos grupos de gallinas y los títulos fueron comparables.
Sin embargo, en cada grupo de
inoculación se encontraron algunas diferencias atribuibles
a variaciones individuales. Los resultados muestran que ambas
vías de inmunización (SC e IM) son igualmente
efectivas en la generación de anticuerpos desde gallinas
contra enzimas
citosólicas. Además, el análisis mediante inmunodetección
reveló que los anticuerpos anti- FBPasa obtenidos por
inoculación intramuscular y subcutánea,
reconocieron a la enzima en extractos de hígado de rata,
los cuales contenían más de 50 diferentes proteínas.
Estos resultados demostraron que los anticuerpos producidos por
estas dos vías de inoculación son altamente
específicos.
Palabras claves: anticuerpos, huevos de gallina,
FBPasa.
INTRODUCCIÓN
En gallinas, se ha demostrado la existencia de tres
clases de inmunoglobulinas análogas a la de mamíferos: IgA, IgM e IgG (Carlander,
2002). Sin embargo, al comparar la estructura de
la inmunoglobulina G aviar y mamífera se observan
diferencias en la masa molecular, siendo de 200 kDa en las
aves y de 160
kDa en los mamíferos (Tizard, 1982). Por otra parte, la
inmunoglobulina G aviar posee gran similitud en su secuencia de
ADN con la IgE
humana (Shimizu y col., 1992). Estas características
permiten que ambas IgG no presenten reacción cruzada
(Frendscho, 1994). Producto de
estas diferencias la inmunoglobulina IgG aviar fue denominada IgY
(Camenish y col., 1999).
Debido a la distancia filogenética entre aves y
mamíferos, las gallinas producen anticuerpos más
específicos contra antígenos mamíferos que los mismos
mamíferos (Li y col., 1998). Además, los
anticuerpos IgY resultan adecuados para ensayos
inmunológicos pues disminuyen los falsos positivos, al no
interactuar con las IgG de mamíferos, con el factor
reumatoide o con los receptores de fijación del
complemento de los mamíferos (Montes y col., 1994). La IgY
es transportada desde el suero del ave a la yema del huevo, lo
cual permite transferir los anticuerpos maternos a la
descendencia y posibilita, de esta manera, la adquisición
de inmunidad pasiva en los polluelos. La concentración de
IgY en el suero de la gallina es de aproximadamente 5-7 mg/ml
(Carlander, 2002), en tanto la concentración de IgY en la
yema del huevo es de 15 mg/ml, con variaciones entre 8 y 25 mg/ml
(Sunwoo y col., 2002; Rose y col., 1974). Por lo tanto, una yema
de huevo de un volumen
aproximado de 15 ml contiene más de 100 mg de IgY
(Carlander y col., 2002; Larsson y col., 1993). Luego, desde una
gallina en postura que produce aproximadamente 20 huevos por mes,
se podrían aislar desde la yema más de 2 gramos de
IgY (Carlander, 2002), cantidad comparable con la
producción de grandes mamíferos, como equinos y
bovinos (Tizard, 1982). Además, la obtención de
anticuerpos a partir de la yema de huevo no representa un
procedimiento
invasivo, como el sangrado en conejos, evitando de esta manera el
estrés y
el sufrimiento animal (Broderson, 1989).
Los anticuerpos obtenidos de yema de huevo de gallina,
tienen diversas aplicaciones, entre ellas se destaca su empleo en
inmunoterapia oral. Larsson y col. (1993) demostraron los efectos
positivos de incluir IgY contra Staphylococcus
aureus y Streptococcus agilata en el
alimento de vacas de lechería. Este tratamiento produjo
una importante reducción en las células
somáticas, disminuyendo los costos en el
tratamiento de la mastitis
(Coleman, 1996). Además, otros investigadores han
demostrado que anticuerpos obtenidos de gallinas inmunizadas con
E. coli enterotoxigénica pueden detener, en 24 horas, la
diarrea en
lechones (Marquardt y col., 1999). Otra característica
importante de la inmunoglobulina IgY, que permite su administración vía oral, es su alto
grado de estabilidad ante variaciones de temperatura y
pH. La IgY es
particularmente resistente al proceso de
pasteurización a un pH mayor de 4 (Shimizu y col., 1988).
Por esta razón, se ha propuesto su uso en terapia oral en
pacientes con fibrosis quística, cáncer (Yang y
col., 1997; Carlander y col., 1999), inmunodeprimidos (Coleman,
1999), y como antisuero en casos de mordeduras de arañas o
serpientes (Thalley y Carroll, 1990).
En la literatura se ha informado
de diferentes métodos
para la obtención de anticuerpos desde huevos de gallina
(Carlander, 2002). Para evaluar la respuesta humoral en gallinas
se han utilizados las vías de inoculación
subcutánea (Chung-seog y col., 1985; Frendscho, 1994),
intramuscular (Camenisch y col., 1999; Orsini y col., 2001;
Sunwoo y col., 2002; Akita y Nakai, 1992) y endovenosa (Patterson
y col., 1962; Gutiérrez y col., 2001). Utilizando el mismo
antígeno se comparó la producción de
anticuerpos a través de las vías de administración intramuscular y endovenosa,
encontrándose diferencias significativas (Gutiérrez
y col., 2001). Sin embargo, no hay estudios comparativos de la
producción de anticuerpos inmunizando a través de
las vías intramuscular y subcutánea. Por lo tanto,
en el presente trabajo se compararon dos vías de
inoculación (intramuscular y subcutánea), para la
obtención de anticuerpos policlonales en gallina. El
antígeno utilizado fue la Fructosa-1,6- bisfosfatasa de
riñón de cerdo, enzima tetramérica encargada
de catalizar uno de los pasos irreversibles de la
gluconeogenesis, la conversión de fructosa-1,6-bisfosfato
a fructosa- 6-fosfato (Van Schaftingen, 1987).
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