Comparación de dos vías de inoculación en la producción de anticuerpos contra fructosa 1,6-bisfosfatasa en huevos de gallina (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Materiales. En el estudio se utilizaron 6
gallinas de raza Leghorn de un año de edad en producción. Como antígeno se utilizó Fructosa-
1,6-bisfosfatasa de riñón de cerdo (FBPasa). Los
reactivos utilizados para ensayo en
gota, inmunodetección y electroforesis en geles de
poliacrilamida fueron adquiridos en BIORAD®.

Purificación de
FBPasa. A partir de riñones de cerdo
recién sacrificados, siguiendo el procedimiento
descrito por Colombo y col. (1972), modificado por Reyes y col.
(1987), se purificó FBPasa a homogeneidad. Este proceso se
basó en tres etapas consecutivas de precipitación
con pH, calor y
sulfato de amonio, luego de las cuales se realizó una
cromatografía de afinidad en Cibacron blue
® (sefarosa azul). El sedimento obtenido en la
precipitación con sulfato de amonio se resuspendió
y dializó contra una solución de Tris-HCl 20 mM, pH
7.5, EDTA 0.1 mM. La solución de proteínas
se aplicó en una columna de vidrio de 4 x 15
cm con aproximadamente 150 ml de la resina sefarosa azul
equilibrada en el mismo tampón. Una vez aplicada la
muestra, se
lavó la columna con la solución de equilibrio y
la FBPasa se eluyó específicamente con 300 ml de
una solución de adenosina monofosfato (AMP) 0.2 mM en
Tris- HCl 20mM, pH 7.5, EDTA 0,1 mM, colectándose
fracciones de 8 ml, a un flujo de 2 ml/min. Las fracciones con
enzima se detectaron midiendo la absorbancia a 280 nm y la
actividad bifosfatásica (Saéz y col., 1996).
Aquellas fracciones con actividad mayor a 20 unidades/ml fueron
reunidas y concentradas por precipitación con sulfato de
amonio al 90% de saturación. Después de centrifugar
a 10.000 x g, el sedimento se resuspendió y se
dializó por 24 horas con tres cambios de 1 litro de una
solución de Tris-HCl 20mM, pH 7.5, EDTA 0.1 mM. La enzima
purificada presentó una actividad específica de 40
unidades por miligramo de proteína. Para determinar el
grado de pureza de la FBPasa, 1 µg de la proteína
purificada se separó en un gel de poliacrilamida al 12% en
condiciones desnaturantes (Laemmli, 1970). Su movilidad
electroforética fue comparada con una mezcla de marcadores
de peso molecular (Winkler®), que contenía las
siguientes proteínas: ß-galactosidasa, 116.000;
albúmina, 66.000; ovoalbúmina, 45.000; lactato
deshidrogenasa, 35.000; endonucleasa de restricción
Bsp981, 25.000; ß-lactoglobulina, 18.400 y
lisozima, 14.400 g/ mol.

Inmunización. Utilizando 0.2 mg de
FBPasa resuspendida en 0.5 ml de PBS (NaCl 150 mM,
Na2HPO4 10 mM, pH 7.5), se preparó
una emulsión con un volumen de 0.5 ml
de adyuvante completo de Freund para la primera
inmunización y de 0.5 ml de adyuvante incompleto de Freund
en la segunda y tercera inmunizaciones, las cuales se realizaron
con un intervalo de 2 semanas (entre la 1ª y 2ª
inmunización) y de 4 semanas (entre la 2ª y 3ª
inmunización) (esquema 1). Con un volumen final de 1 ml,
tres gallinas fueron inmunizadas por vía intramuscular
(gallinas Nº 1, 2 y 3) y tres por vía
subcutánea (gallinas Nº 4, 5 y 6). La
recolección de huevos y purificación de anticuerpos
se realizó periódicamente antes y después de
cada inmunización. El daño
ocasionado por la inmunización en las gallinas se
determinó mediante necropsias.

ESQUEMA I: Diagrama de
las inoculaciones con FBPasa. AFC: Adyuvante de Freund Completo.
AFI: Adyuvante de Freund Incompleto.
Diagram of FBPase
inoculation. AFC: Complete Freund’s Adjuvant. AFI:
Incomplete Freund’s Adjuvant.

Purificación de los
anticuerpos. Se utilizaron huevos desde el día 12
post-inmunización hasta los colectados un día antes
del sacrificio de las aves. La
purificación se realizaba con 2 yemas y el volumen final
variaba dependiendo del tamaño del huevo. Las
proteínas hidrosolubles de la yema fueron precipitadas con
sulfato de amonio en un 65% de saturación. Luego de
centrifugar las muestras a 20.000 g por 15 minutos, el
precipitado fue resuspendido en 10 ml de Tris- HCl 20 mM, pH 7.5,
EDTA 0.1 mM, posteriormente dializado y guardado a -20 ºC
(Akita y Nakai, 1993).

Titulación de
anticuerpos. Se realizó mediante el método de
ensayo en gota (dot blot) descrito por Gershoni y Palade (1983).
Para estimar el título, varias tiras de nitrocelulosa
fueron sembradas con 20 ng de FBPasa y luego incubadas con
distintas diluciones (1:1.000, 1:10.000, 1:20.000, 1:40.000,
1:50.000, 1:60.000) del anticuerpo IgY purificado, el cual fue
inmunodetectado con anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de
gallina acoplado a peroxidasa (Aves Labs, Inc). Para revelar la
actividad del conjugado, el papel de nitrocelulosa se
incubó por 5 minutos en una solución de
diaminobencidina (DAB) 0.5 mg/ml, H2O2
0,15% (v/v), Tween-20 0.3% (v/v) en PBS. Para, determinar de
forma más precisa el título de los anticuerpos
inducidos, la marca debida a la
precipitación de DAB en los dot blots, fue digitalizada y
analizada. Para ello, se utilizó el programa
computacional "UNSCANIT" (Silk Scientific Corporation), con el
cual se determinó él número de pixeles
presentes en cada marca de la nitrocelulosa. Se utilizó
como única dilución, 1:10.000, de los anticuerpos
obtenidos días anteriores y posteriores a cada
inmunización. El análisis final se obtuvo de forma similar,
utilizando dos diluciones (1:10.000 y 1:20.000) de los
anticuerpos obtenidos una semana después de la 3ª
inmunización. Como control de la
reacción para cada anticuerpo se realizó un
experimento donde no se adicionó el anticuerpo
primario.

Determinación de
especificidad de los
anticuerpos mediante ensayo
en gota (Dot blot). En una
tira rectangular de nitrocelulosa se sembraron 100 ng de tres
proteínas diferentes (FBPasa, aldolasa A y aldolasa B).
Posteriormente, la tira de nitrocelulosa se incubó en una
dilución 1:1.000 del anticuerpo IgY purificado y este fue
inmunodetectado con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de
gallina acoplado a peroxidasa. Para revelar la actividad del
conjugado, el papel de nitrocelulosa se mantuvo 5 minutos en una
solución de diaminobencidina 0,5 mg/ml, H2O2 0.15% (v/v),
Tween-20 0.3% (v/v) en PBS. La presencia de reacción fue
estimada de acuerdo a la intensidad de la marca ocasionada por la
precipitación de DAB.

Determinación de
especificidad de los
anticuerpos mediante
Inmunodetección (Western blot).
Un extracto de proteínas totales de hígado de rata
fue sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS en
condiciones desnaturantes, de acuerdo al método descrito
por Laemmli (1970). Posteriormente, las proteínas
presentes en el gel de poliacrilamida fueron electrotransferidas
a una membrana de nitrocelulosa, la cual fue sometida a
inmunodetección de acuerdo al método descrito por
Tsang y col. (1983). La membrana fue bloqueada con
solución de PBS-tween-leche
(Na2HPO4 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5,
Tween-20 0.3% (v/v) y leche descremada 5% (p/v)) a 30 °C por
30 minutos. Posteriormente fue incubada con una dilución
1:1.000 del anticuerpo IgY purificado, el cual fue
inmunodetectado con anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de
gallina acoplado a peroxidasa. El revelado se llevó a cabo
de la misma manera que en el ensayo en
gota. La presencia de reacción fue estimada de acuerdo a
la intensidad de la marca debida a la precipitación de
DAB.

Análisis estadístico. El
análisis estadístico se realizó utilizando
la prueba de "t de Student" para muestras pareadas mediante el
programa computacional "graph Pad Instat" (Graph Pad Software), considerando un
nivel de significancia de p<0.05. Los datos analizados
correspondieron a la cantidad de pixeles obtenidos por dot blot
en títulos de 1:10.000 y 1:20.000 de los anticuerpos
purificados.

RESULTADOS

Purificación de
FBPasa. El análisis mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes mostró
que la enzima se encontraba en un alto grado de pureza. Se
determinó la existencia de una banda única de
proteína correspondiente a la FBPasa. Al comparar los
píxeles de esta banda con los píxeles del fondo del
carril se determinó que aproximadamente la FBPasa se
encontraba en un 99% pura. Utilizando un marcador de
proteínas de rango amplio y tinción con azul de
Coomasie, se determinó que la proteína purificada
poseía una masa de 36 kDa correspondiente al
monómero de FBPasa (figura 1 A). 

FIGURA 1. Determinación de la especificidad de
los anticuerpos obtenidos por inoculación intramuscular y
subcutánea mediante western blot (B) y dot blot (C). A:
Análisis mediante gel de poliacrilamida 12%: FBPasa
purificada (1) y extracto de proteína total de
hígado de rata (2) teñido con azul de Coomasie. St:
Marcador de proteínas rango amplio (15-116 KDa). B:
inmunodetección de FBPasa con anticuerpos de gallina en
muestra con FBPasa pura (1) y en extracto de proteína
total de hígado de rata con anticuerpo obtenido por
inoculación intramuscular (2) y por inoculación
subcutánea (3). C: análisis mediante ensayo en gota
con anti-FBPasa, en dilución de 1:1.000, obtenida por
inoculación intramuscular (1) y subcutánea (2). F:
FBPasa; A: aldolasa A; B: aldolasa B.

Specificity of antibodies obtained by intramuscular and
subcutaneous inoculation determined by western blot and dot blot
A: analysis by PAGE shows: purified FBPase (1) and total protein
extract of rat liver (2). St: Molecular weight standard (15-116
KDa). B: immunodetection of FBPase with hen antibodies in a
sample of pure FBPase (1) and a rat liver total protein extract
with antibodies obtained by intramuscular (2) and subcutaneous
(3) inoculations. C: dot blot analysis with anti-FBPase, in
diluted 1:1000, obtained by intramuscular (1) and subcutaneous
inoculations (2). F: FBPase; A: aldolase A; B: aldolase
B.

Inmunización. Luego de la segunda
inoculación, los grupos de aves
inoculados por vía intramuscular y subcutánea
presentaron un período de muda de plumas y la consecuente
disminución en la producción de huevos. Por otra
parte, al finalizar el ensayo se realizaron necropsias en todas
las gallinas, encontrándose lesiones inflamatorias, con
contenido caseoso en el tejido circundante al punto de
inoculación. La magnitud de las lesiones fue similar en
ambos grupos de gallinas, encontrándose pequeñas
diferencias individuales dentro de un mismo grupo.

Título de los
anticuerpos. Luego de la tercera inmunización se
determinó el título de los anticuerpos producidos
por ambas vías de inoculación (cuadro 1). El
análisis de imagen digital
indicó que el nivel de anticuerpos contra FBPasa presente
en la yema de los huevos, previo a las inmunizaciones, fue
mínimo o no existente, determinándose un
número de pixeles cercanos a la respuesta basal (20
pixeles). Elevados títulos de anticuerpos fueron
detectados ya a doce días después de la primera
inyección, alcanzando su máximo 1-2 semana
después de la tercera inoculación (figura 2).
Resultados similares se obtuvieron con las otras gallinas
inmunizadas (datos no mostrados). Además, al comparar la
cantidad de pixeles, durante los distintos tiempos del
experimento, se encontró que ambas vías de
inoculación no presentaron diferencias (figura 2). Por
otro lado, al comparar los resultados obtenidos dentro de cada
grupo de inoculación, se observó que existen
diferencias individuales en la producción de anticuerpos
(figura 3). Utilizando un título bajo (1/1000) no se
observa esta diferencia, la que comienza a ser evidente al
realizar el análisis con un título de 1:10.000. De
esta forma, se determinaron diferencias entre un 50 % y un 100 %
entre gallinas del mismo grupo, encontrándose las mayores
variaciones en las aves inoculadas por vía
subcutánea (figura 3). Sin embargo, se determinó
que no existen diferencias significativas entre las vías
utilizadas para la producción de anticuerpos
anti-FBPasa. 

FIGURA 2. Análisis digital de la tinción
de DAB, obtenidas mediante ensayo en gota con los anticuerpos
anti-FBPasa. Se muestra el análisis de una gallina de cada
grupo de inoculación usando una dilución de
1:10.000, a diferentes tiempos de inmunización. A:
preinmune; B: 12 días después de la 1ª
inmunización; C: 1 semana después de la 2ª
inmunización; D: 1 semana antes de la 3ª
inmunización; E: 1 semana después de la 3ª
inmunización; F: 4 semanas después de la 3ª
inmunización. No se observaron diferencias significativas
entre ambos grupos, lo cual fue determinado por la prueba de t de
Student.
Digital analysis of DAB signals obtained by
dot blot with anti-FBPase antibodies. Analysis of one chicken
from each inoculation group at different immunization stages was
diluted 1:10.000. A: preimmune; B: twelve days after the first
immunization; C: one week after the second immunization; D: one
week before the third immunization; E: one week after the third
immunization; F: four week after the third immunization. No
significant difference was observed between both groups as
determined by Student’s t test. 

FIGURA 3: Análisis digital de la intensidad de
las marcas de DAB obtenidas mediante ensayo en gota, usando dos
diluciones (1:10.000 y 1:20.000) de los anticuerpos anti-FBPasa
(1 semana después de la 3ª inmunización) de
ambos grupos de inoculación. No se observaron diferencias
significativas entre ambos grupos, lo cual fue determinado por la
prueba de t de Student.
Digital analysis of the DAB
signals obtained by dot blot, using two dilution (1:10.000 and
1:20.000) of anti-FBPase antibodies (1 week after the third
immunization) of both inoculation groups. No significant
difference was observed between both groups as determined by
Student’s t test.

Determinación de
especificidad de los anticuerpos
anti–FBPasa. Mediante ensayo en gota, se
determinó la posible reacción cruzada que pudieran
presentar los anticuerpos purificados, con dos enzimas que
copurifican en condiciones similares a las de FBPasa (aldolasa A
y aldolasa B). Los anticuerpos obtenidos por inmunización
intramuscular y subcutánea mostraron ser
específicos para FBPasa, no detectándose
reacción con las otras dos proteínas (figura 1C).
Posteriormente, mediante análisis de Western blot de un
extracto de proteína total de hígado de rata, se
determinó que los anticuerpos producidos a través
de ambas vías de inoculación reconocían una
banda de masa ligeramente superior a 36 kDa (figura 1B),
correspondiente a la masa molecular de la FBPasa de hígado
de rata, dentro de una población con más de 50
proteínas diferentes.

DISCUSIÓN

El proceso de inmunización produjo zonas con
daño tisular, lo cual puede ser atribuido a la
utilización del adyuvante. En ambos grupos experimentales
se encontraron lesiones macroscópicas similares con
contenido caseoso circundantes al punto de inoculación.
Estas observaciones difieren de las descritas por Gassmann y col.
(1990), quienes informan que el adyuvante completo es bien
tolerado y no produce reacciones inflamatorias. Como las lesiones
macroscópicas son comparables en ambos grupos de
inoculación no es posible recomendar en forma preferencial
el uso de una de estas vías. Sin embargo, se estima que
estas lesiones cumplieron un rol importante en la
estimulación anticipada del inicio del período de
muda de plumas en las gallinas, lo que condujo a una fuerte
disminución en la producción de huevos. A pesar de
esta interrupción en la producción, ambos grupos de
inoculación mantuvieron elevados títulos de
anticuerpos (cuadro 1). Al respecto, Carlander y col. (2001)
indican que el transporte de
IgY desde el suero a la yema del huevo no decrece al producirse
una interrupción en la postura de los huevos. No obstante,
se estima importante seleccionar gallinas jóvenes, previo
o al inició de su período de postura, para comenzar
la etapa de inmunización. Evitando de este modo que el
estrés
ocasionado por la manipulación durante las inoculaciones y
la acción
irritante del adyuvante, disminuyan la producción de
huevos y con ello la producción de anticuerpos. La
inoculación con aldolasa B y adyuvante completo de Freund
en otro grupo de aves, antes del período de postura de
huevos, evitó la disminución de la
producción de huevos y con ello la disminución de
los anticuerpos obtenidos (datos no mostrados). Otros autores han
propuesto que es factible sustituir el adyuvante completo por el
incompleto en la inmunización primaria, lo que no
alteraría una efectiva respuesta inmunológica,
evitando las lesiones y disminuyendo la mortalidad de las aves
(Schade y col., 1996).

De acuerdo a Patterson y col. (1962) los anticuerpos
aparecen en la yema 8 días después de la
inoculación primaria, obteniéndose el máximo
nivel a partir del día 12. Teniendo en cuenta esta
información, la determinación de
anticuerpos se inició doce días después de
la primera inmunización. Las gallinas utilizadas en este
ensayo proporcionaron huevos con una alta tasa de anticuerpos por
un período de a lo menos dos meses (figura 2). En este
sentido, la persistencia de elevados títulos de
anticuerpos en yema es mayor que la observada en el suero de las
aves (Patterson y col., 1962). La primera medición del nivel de anticuerpos, en la
yema del huevo post-inoculación, mediante análisis
digital, arrojó un numero de 350 pixeles, indicando una
elevada cantidad de anticuerpos a pocos días de iniciarse
el ensayo.

El nivel de anticuerpos luego de la segunda
inmunización es mayor al obtenido luego de la primera,
este incremento se debe a la acción de las células B
de memoria que
permiten una más fácil y rápida respuesta
ante el antígeno (Kuby, 1997). Posteriormente, el nivel de
los anticuerpos se mantuvo relativamente alto sin mayores
declinaciones durante el período experimental (11 semanas)
observándose la mayor intensidad en la marca de la
nitrocelulosa luego de la tercera inmunización (8
semanas). La persistencia de altos títulos de anticuerpos
y la alta cantidad de inmunoglobulinas presente en la yema de un
huevo, equivalentes a las obtenidas por el sangramiento de un
conejo (Frendscho, 1994), determina que la producción de
anticuerpos desde huevos de gallina es una alternativa mucho
más conveniente y barata, sólo comparable en
cantidad con lo producido por grandes mamíferos, como bovinos o equinos (Larsson
y col., 1993).

Las diferencias obtenidas dentro de cada grupo de
inoculación, de un 50 % a un 100% en el número de
pixeles (figura 3), pueden ser atribuidas a factores
individuales. Sin embargo, al comparar el numero de pixeles
promedio entre ambos grupos de inoculación, no se
encontraron diferencias importantes, lo cual estaría
indicando que la utilización de cualquiera de estas dos
vías de inoculación para promover la
producción de anticuerpos de proteínas
citosólicas (como la FBPasa) en gallinas, es igualmente
efectiva.

Un aspecto importante de la investigación fue determinar la
especificidad de los anticuerpos purificados desde yema de huevo.
Se ha descrito que FBPase interacciona con otras enzimas del
metabolismo y
que en ciertas condiciones de purificación puede estar
contaminada con otras enzimas. Entre ellas, la más
descritas son su interacción con la aldolasa A y B. Los
ensayos en
gota muestran que no existe reacción cruzada entre el
anticuerpo anti-FBPasa con aldolasa A y aldolasa B, y que el
anticuerpo producido detecta exclusivamente a la FBPasa (figura
1C). Estos resultados indican fuertemente que el anticuerpo
obtenido es altamente específico. Este análisis fue
corroborado realizando un inmunoblot de un extracto de
proteínas totales de hígado de rata. Los resultados
de inmunodetección muestran inequívocamente que el
anticuerpo purificado desde huevos contra FBPasa presenta una
alta especificidad, detectándose específicamente a
la enzima en un extracto de proteínas totales de
hígado de rata (figura 1B). Además, como se muestra
en la carril 1 de la figura 1B se confirmó que el
anticuerpo producido reconoce a la FBPasa purificada. Esta alta
especificidad demostrada por el anticuerpo anti-FBPasa
permitirá su utilización en ensayos de
inmunohistoquímica. Este análisis podría
posteriormente dilucidar la localización de la
fructosa-1,6-bisfosfatasa a nivel celular en diferentes
condiciones fisiológicas. Asimismo, debido a las
características inmunológicas de IgY de disminuir
los falsos positivos y no interactuar con las IgG de
mamíferos posibilitaría la realización de
estudios de co-localizacion, utilizando a la vez anticuerpos
mamíferos de otras enzimas relacionadas en sus procesos
metabólicos.

En conclusión, en este trabajo se
compararon dos vías de inmunización para la
obtención de anticuerpos desde la yema del huevo de
gallinas mediante la estimación del título y la
caracterización de los anticuerpos a través de
diversos ensayos inmunológicos. Estos son los primeros
estudios donde se muestra que no existen diferencias entre estas
dos vías de inmunización (intramuscular y
subcutánea) para la producción de anticuerpos de
proteínas citosólicas como la FBPasa. Las
diferencias detectadas dentro de cada grupo pueden atribuirse a
factores individuales. Por otra parte, la elevada
concentración de anticuerpos en cada huevo (15mg/ml), el
largo período de postura de las gallinas (1 año) y
la gran cantidad de IgY (100-300 mg/huevo) hace a este
método una alternativa mucho más económica
que las utilizadas convencionalmente.

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 R. Gatica1, M. V.; J. C.
Slebe1, BQ. Ph.D.; J. Ulloa2, M. V. Dr.
med. vet.; A.J. Yáñez1 *, BQ.
Ph.D.
1 Instituto de Bioquímica, Facultad de Ciencias.

2 Instituto de Patología Animal, Facultad de
Ciencias Veterinarias, Universidad
Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.