Puesta en evidencia del virus diarrea viral bovina en bovinos clínicamente afectados (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras: se trabajó con un
total de 33 muestras, procedentes de animales que
cursaban con cuadros clínicos sospechosos de ser causada
por el VDVB. Cada muestra,
constituida por uno o más trozos de tejidos (bazo,
ganglios, hígado, pulmón, riñón,
etc.), fue procesada, en forma separada para cada órgano,
triturando y suspendiendo el tejido, al 2%, en medio de cultivo
celular esencial mínimo Eagle (MEM) adicionado de 400 UI
de penicilina, 400 mcg de estreptomicina y 4 mcg de micostatina
por ml. Luego de centrifugar, a 3.000 x g por 10 minutos a
4°C, el sobrenadante se conservó a -70° C hasta el
momento de ser inoculado en cultivos celulares. Del animal vivo
se empleó como inóculo el suero
sanguíneo.

Aislamiento viral: para realizar el aislamiento
del VDVB se emplearon cultivos celulares primarios de
pulmón fetal bovino (PFB), con no más de cuatro
pasajes, y comprobados de estar libres de contaminación por el VDVB -prueba de
inmunoperoxidasa indirecta (IPI) (Kit IPEX-BVD, Central
Veterinary Laboratory. Weybridge. Catálogo Nº
0258108). Las células se
dispusieron en microplacas de fondo plano de 96 pocillos (NUNC),
y una vez establecida la monocapa se sembraron 6 pocillos, por
cada inóculo, con volúmenes de 50 ul.
Después de un período de absorción de 90
minutos a 25° C, se adicionaron 50 ul de medio de cultivo
MEM con antibióticos y un 2% de suero fetal bovino (SFB),
certificado como libre de contaminación microbiana y viral
y desprovisto de anticuerpos para el VDVB. Los cultivos se
incubaron a 37º C por un período de 5 días con
observaciones microscópicas diarias. Al 5º día
se cosechó el medio de cultivo y las células se
fijaron con acetona, al 10% en PBS (0.01 M pH 7.6) para
detectar la presencia de antígenos del VDVB mediante la prueba de
IPI. Paralelamente, en cada microplaca, se controló
la ausencia de antígeno viral en las células
empleadas libres de inóculo y la presencia de
antígeno viral en células inoculadas con un aislado
de laboratorio
NCP. La detección de antígeno viral en al menos uno
de los órganos procesados de un mismo animal fue
suficiente para considerar al animal como positivo al
VDVB.

Identificación del biotipo de los
aislados: para conocer el biotipo de los aislados, todos los
medios de
cultivos cosechados desde los cultivos celulares en que se
detectó la presencia de antígenos del VDVB fueron
reinoculados por segunda y tercera vez en las células de
PFB, procediéndose de forma semejante a la señalada
anteriormente. Después del tercer pasaje se repitió
la prueba de IPI e independientemente de este resultado se
aplicó la prueba de inmunofluorescencia directa, para lo
cual se sembraron los inóculos cosechados del tercer
pasaje, por cuarta vez en células de PFB dispuestas en
tubos Leighton. Después de un período de
incubación de 48 horas, las laminillas se tiñeron
con un conjugado fluorescente policlonal anti-VDVB, cepa Singer,
elaborado en conejos, y se observaron en un microscopio de
fluorescencia Leitz SM-LUX, iluminado por una lámpara de
mercurio de 50 W.

Para detectar la presencia de otros virus en las
muestras, como parainfluenza 3 (PI3) y virus herpes bovino
1 (VHB 1), agentes causales de para-influenza 3 y de la
rinotraqueítis infecciosa bovina (RIB), las muestras se
inocularon, de forma semejante a la descrita para el VDVB, en la
línea celular MDBK. Después de un período de
incubación de 5 días a 37° C, con observación diaria, las células se
lisaron y la suspensión fue reinoculada en células
MDBK. Este proceso se
repitió por tres veces. Frente a la aparición de
efecto citopático, para identificar el aislado, se
recurrió a la prueba de seroneutralización
(índice neutralizante) empleando antisueros de referencia
para PI3 y RIB.

RESULTADOS

De los 33 animales en estudio, en 23 de ellos se
detectó la presencia del VDVB en el primer pasaje del
inóculo en cultivos celulares de PFB, lo que corresponde a
un 69.7%. De éstos, 14 correspondían a fetos
abortados; uno a un nonato; uno a un mortinato; tres a vacas: una
madre de un mortinato, una con síndrome de aborto y una
muerta; dos a novillos muertos; dos a terneros: uno con
síntomas neurológicos, sacrificado, y uno muerto
con síndrome respiratorio (cuadro 1).

Todos los aislados de VDVB fueron de biotipo NCP al
menos hasta el tercer pasaje en células de PFB.

Se constató que de los 23 animales positivos al
VDVB, en el primer pasaje, sólo 17 mantuvieron su
positividad a prueba de IPI, en el tercer pasaje, resultando
negativas las muestras 10, 11, 12, 13, 14 y 19; y 19 fueron
positivos a prueba de IFD en el cuarto pasaje, resultando como
negativas las muestras 13, 14, 17 y 22 (cuadro 1).

En 13 muestras en que se contó con más de
un órgano para preparar el inóculo viral los
resultados demuestran que en 10 se aisló y detectó
la presencia de antígenos virales en el primer pasaje,
desde todos los órganos procesados. En la muestra 8 se
detectó el virus en pulmón y no en hígado,
resultado que se mantuvo para el tercer y cuarto pasaje; en la
muestra 9 se detectó el virus en hígado y no en
pulmón, pero en el cuarto pasaje el inóculo de
pulmón dio fluorescencia positiva; y la muestra 19 fue, en
su primer pasaje, positiva en bazo y negativa en
riñón por IPI, pero en el cuarto pasaje los
inóculos de ambos órganos mostraron positividad a
IFD (cuadro 1).

En el tercer pasaje, 10 órganos que fueron
positivos en el primer pasaje a IPI se tornaron negativos a la
misma prueba: pulmones de las muestras 5 y 12, hígados de
las muestras 7, 10, 12, 13 y 14; "pool" de órganos de la
muestra 11; y bazos de las muestras 19 y 23 (cuadro
1).

Cuando se aplicó la prueba de IFD, en el cuarto
pasaje, de los 43 positivos por IPI al primer pasaje, 32
mantuvieron la condición de positividad a IFD. La
diferencia estuvo dada por los órganos: hígados de
las muestras 6, 7, 9, 13, 14, 15; cornete nasal de la muestra 16;
suero de la muestra 17; cerebro y pool de
órganos de la muestra 22 y bazo de la muestra 23, que
resultaron negativos a la prueba de IFD (cuadro 1).

El aislamiento viral en la línea celular MDBK,
procedente de seis fetos abortados, demostró la presencia
de células globosas y refringentes en el primer pasaje,
efecto que se incrementó hasta el tercer pasaje afectando
el 100% de la monocapa celular en todas las muestras inoculadas
(hígado, pulmón y riñón). El efecto
citopático fue neutralizado por un suero de referencia
anti-VHB-1, considerándose a los aislados como virus
causantes de la RIB. En ninguno de estos fetos se detectó
la presencia del VDVB.

Los 4 animales que resultaron negativos al aislamiento
viral correspondieron a un mortinato y a tres fetos
abortados.

DISCUSIÓN

La presencia del VDVB en 23 de 33 animales sospechosos
de estar siendo afectados por algunas de las manifestaciones
patológicas provocadas por el VDVB, en ausencia de otros
agentes virales citopatogénicos, hace suponer que el VDVB
podría estar participando en la presentación de
estas patologías, como agente causal o predisponente, pero
dados los múltiples factores que pueden estar incidiendo,
este supuesto es discutible ya que estudios señalan que es
muy difícil asociar la presencia del virus, especialmente
con aborto (Duffell y Harkness, 1985; Jerrett y col., 1984;
Thorsen y Kahrs, 1984) y en otros casos ha sido imposible
demostrar virus o anticuerpos para el VDVB, estando éste
fuertemente implicado por evidencias
circunstanciales (Harkness y col., 1988).

Todos los aislados fueron de biotipo NCP, al menos hasta
el tercer pasaje del inóculo en cultivos celulares de PFB,
situación que era esperada ya que las cepas CP se
aíslan mayoritariamente desde animales que cursan el
cuadro de EM (Brownlie y col., 1984; Radostits y Littlejohns,
1988; Reinhardt y col., 1986; Baker, 1987; Clarke y col., 1987;
Shimizu y col., 1989), no obstante señalarse que aislados
CP y NCP pueden encontrarse en el diagnóstico de rutina de DVB (Barber y
col., 1985) y haberse aislado cepas CP desde fetos abortados,
muerte
perinatal y DVB aguda (Bezek, 1995; Rweyemamu y col., 1990;
Woodard, 1994).

Cuadro 1.
Aislados de campo del virus diarrea viral
bovina identificados por pruebas de
inmunoperoxidasa indirecta (IPI) e inmunofluorescencia directa
(IFD) según patología y órgano
procesado.
Identification of bovine viral diarrhoea virus from isolates by
indirect immunoperoxidase and
direct immunofluorescence staining.

*N° de pasaje de
los aislados en células de pulmón bovino.
**Intensidad de la
reacción en porcentaje de células reaccionantes:
+ < 25%; ++ = 25 a 50%; +++ = 50 a 75%; ++++ 75%.

La diferencia de resultados en el diagnóstico,
entre el primer y tercer pasaje, se presentó en seis
muestras y éstas correspondían, mayoritariamente, a
muestras en que se disponía de un solo órgano para
hacer el aislamiento viral. Este antecedente sugiere la necesidad
de procesar más de un tejido en procedimientos de
aislamiento viral para obtener resultados consistentes. La falta
de positividad, en el tercer pasaje, podría atribuirse a
una pérdida de la infecciosidad de los aislados durante el
período de conservación de las muestras, o a una
menor capacidad de adaptación de los aislados a los
cultivos celulares. Sin embargo, 2 órganos que aparecieron
negativos a la IPI en el primer y tercer pasajes (pulmón
de muestra 9 y riñón de muestra 19), se detectaron
como positivas en un cuarto pasaje con la prueba de IFD y en este
caso se pensaría que los niveles de antígenos en
los primeros pasajes de los tejidos no eran suficientes para
demostrar positividad, o bien en este caso la sensibilidad de la
IPI fue menor a la IFD, no obstante, Meyling (1983) señala
que la sensibilidad de ambas pruebas es equivalente cuando se
trata de diagnosticar VDVB. De todas formas este hecho denota la
necesidad de hacer a lo menos tres pasajes de los inóculos
antes de considerar una muestra como negativa.

En base a estos resultados y considerando que de los 10
muestras que se consideraron como negativas en este estudio, en
cinco se procesó un órgano; en cuatro, dos
órganos y sólo en una cuatro órganos y, por
otro lado, el hecho de que no se intentaron pasajes de los
aislados negativos, pone en duda la franca negatividad de dichas
muestras, situación que, de ser estos aislados positivos,
redundaría en una mayor significancia de la posible
participación del VDVB en problemas de
la salud del bovino
con particular atención en las pérdidas
reproductivas.

Si bien con estos resultados no se pueden valorar las
pruebas de IPI e IFD usadas en estos diagnósticos, es
preciso señalar que ambas se complementan. Al respecto es
necesario destacar que el "kit" de IPI contiene una mezcla de 4
anticuerpos monoclonales y el conjugado fluorescente está
preparado a partir de un suero policlonal elaborado contra la
cepa Singer del VDVB, situación que estaría dando
la posibilidad de pesquisar algunos antígenos diferentes
entre los aislados con las dos pruebas y algunas de las
diferencias encontradas podrían atribuirse a este hecho.
Al respecto, Deregt y col. (1994) recomiendan, para detectar
antígenos virales, el empleo de un
pool de anticuerpos monoclonales en lugar de suero
antipoliclonal.

En las muestras 8, 9 y 19, en que se pesquisó la
presencia de antígenos virales, sólo en uno de los
dos órganos procesados podría deberse a que no
existiría una distribución homogénea del virus en
el organismo animal, lo que se apoyaría también por
el hecho de que la intensidad de la IPI no fue pareja en los
aislamientos de diferentes órganos procedentes de un mismo
animal. Al respecto se señala que el virus se encuentra
mayoritariamente en tejidos asociados con el sistema
reticuloendotelial (Miller y Wilkie, 1979).

Se concluye que hubo una alta frecuencia de aislamiento
del VDVB de biotipo NCP desde animales sospechos de estar
afectados por el VDVB, a la vez que se sugiere procesar
más de un órgano y realizar al menos tres pasajes
en cultivos celulares para obtener resultados concluyentes, y se
recomienda estudiar la real asociación entre la presencia
del VDVB en los animales y su rol patógeno.

__________________________________
Financiamiento: Departamento Técnico de
Investigación. Universidad de
Chile, Proyecto
A-3141.

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