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Estudio comparativo de un PCR anidado, ELISA y AGID en la detección del virus de la leucosis bovina en muestras de suero, sangre y leche


Partes: 1, 2

    Publicación original:
    Arch. med. vet., 2006, vol.38, no.2, p.137-141.
    ISSN 0301-732X.
    Reproducción autorizada por:
    Revista Archivos de Medicina Veterinaria

    SUMMARY: Different methods available
    for the detection of bovine leukaemia virus (BLV)
    infection were evaluated. The methods evaluated were AGID in
    serum, ELISA in serum and milk, and PCR in blood lymphocytes. The
    AGID test identified a
    smaller number of positive animals (75/126) compared to PCR and
    ELISA tests (100/126). Three positive animals by AGID were
    negative by PCR and 28 of the 51 negative samples by AGID were
    positive by PCR. The sensitivity of PCR with respect to AGID was
    96%, whereas the specificity was 45% (kappa 0.45). All
    positive animals by AGID were also positive by ELISA in serum and
    milk samples, whereas 25 negative animals by AGID were considered
    positive by the ELISA test, in both biological samples. Thus,
    sensitivity of the ELISA with respect to AGID was 100%, whereas
    specificity was 51% (kappa 0.55). The smaller
    sensitivity of AGID is not due to false positive reactions of
    ELISA and PCR tests, but rather to a greater sensitivity of
    these, which suggests a revision of AGID in those countries in
    which it is still used as the official method in the erradication
    programs of leukaemia.

    Key words: cattle, leukaemia, ELISA,
    PCR.

    RESUMEN: Se evaluaron distintos métodos
    actualmente disponibles para el diagnóstico de la infección por el
    virus de la leucosis bovina (VLB). Los métodos empleados
    fueron AGID en suero, ELISA en muestras de suero y leche y PCR en
    linfocitos sanguíneos. De un total de 126 animales
    analizados, AGID identificó un menor número de
    animales positivos (75) comparado con las pruebas PCR y
    ELISA aplicadas en muestras de suero y leche (100). Tres animales
    positivos a AGID fueron negativos a PCR y 28 de las 51 muestras
    negativas a AGID fueron positivas mediante PCR. La sensibilidad
    diagnóstica de PCR con respecto a AGID fue de 96%,
    mientras que la especificidad fue de 45% (kappa 0,45).
    Todos los animales positivos a AGID fueron también
    positivos a ELISA aplicado tanto en suero como en leche, mientras
    que 25 animales negativos a AGID fueron consignados como
    positivos a ELISA, en ambas muestras biológicas. De esta
    forma, la sensibilidad diagnóstica de ELISA respecto a
    AGID fue de un 100%, mientras que la especificidad fue de 51%
    (kappa 0,55). La menor sensibilidad observada de AGID no
    es debido a reacciones falso positivas de ELISA y PCR, sino
    más bien a una mayor sensibilidad de estas últimas,
    lo que sugiere reconsiderar la utilización del método
    AGID en aquellos países en que aún se utiliza como
    método oficial en los programas de
    erradicación de leucosis.

    Palabras clave: ganado, leucosis, ELISA,
    PCR.

    INTRODUCCIÓN

    La leucosis enzoótica bovina es una enfermedad
    infecciosa del ganado, causada por el virus de la leucosis bovina
    (VLB), un retrovirus de la familia
    Retroviridae (Van Regenmortel y col 2000). El VLB
    infecta principalmente a los linfocitos B (Ballagi-Pordani y col
    1992), pero también posee la capacidad de infectar otras
    células, tales como linfocitos T (Stott y
    col 1991, Schwartz y col 1994) y monocitos (Domenech y col 2000).
    Una de las características de esta enfermedad es una
    respuesta humoral que dura toda la vida del animal (Burny y col
    1988). La enfermedad se manifiesta con curso clínico
    lento, desarrollando un período de incubación de 1
    a 5 años, por lo que afecta fundamentalmente a los
    animales mayores de 2 años de edad (Johnson y col 1985).
    El ganado infectado puede permanecer clínicamente
    asintomático durante toda su vida. Sin embargo, solo un
    30-70% desarrolla linfocitosis persistente (LP), la que se
    caracteriza por una expansión policlonal de linfocitos B
    infectados. A su vez, un porcentaje incluso menor de animales
    (0,1-10%) eventualmente desarrolla tumores linfoides, que es la
    forma clínica fatal de esta enfermedad (Burny y col
    1985).

    La infección por VLB estimula una fuerte
    reacción inmune humoral en contra de las principales
    proteínas virales gp51 y p24 que
    constituyen la base para la detección mediante pruebas
    serológicas (Portetelle y col 1989). Dentro de
    éstas, la inmunodifusión en gel de agar (AGID) ha
    sido la prueba oficial en muchos países para la
    detección de anticuerpos contra VLB. Recientemente, se ha
    desarrollado y evaluado una serie de métodos
    enzimoinmunoensayos (ELISA), algunos de los cuales son
    actualmente reconocidos como métodos oficiales en EE.UU.,
    Canadá y otros países (Simard y col 2000). Sin
    embargo, independiente del método serológico
    empleado, la principal desventaja de estas pruebas es su
    incapacidad para discriminar anticuerpos maternales pasivos de
    una infección activa, los que pueden persistir durante los
    primeros 6 meses de vida del animal (Burridge y col 1982).
    Además, estos métodos no proporcionan evidencia de
    la infección en su etapa temprana, esto es, antes de la
    seroconversión, que para esta enfermedad en particular
    puede tardar hasta 14 semanas en presentarse (Dinter 1989). En
    cambio, las
    pruebas de detección directa, como la reacción de
    la polimerasa en cadena (PCR), permiten un diagnóstico
    confiable en las etapas iniciales de la enfermedad y se pueden
    aplicar a la detección del virus en animales menores de 6
    meses, evitando así reacciones falso positivas, causadas
    por la transferencia pasiva de inmunoglobulinas a través
    del calostro. Otra ventaja radica en la capacidad para detectar
    el virus en animales inmunotolerantes, los que no desarrollan una
    respuesta inmune normal (Fechner y col 1996).

    Aunque con algunas discrepancias, diversos autores han
    demostrado una menor sensibilidad de AGID respecto de las pruebas
    diagnósticas ELISA y PCR (Eaves y col 1994, Fechner y col
    1996, Trono y col 2001). Dado que diversos factores pueden
    afectar la concordancia entre estas pruebas, como la secuencia
    elegida como blanco para la amplificación y el
    método para purificar ADN en la PCR, el
    antígeno utilizado en los métodos
    serológicos o las características de la población animal en estudio, entre otros;
    el objetivo de
    este estudio fue comparar el método AGID que se utiliza en
    Chile frente a un ELISA indirecto comercial en muestras de suero
    y leche, y una prueba PCR anidado en linfocitos sanguíneos
    para la detección de la infección por el
    VLB.

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