Estudio comparativo de un PCR anidado, ELISA y AGID en la detección del virus de la leucosis bovina en muestras de suero, sangre y leche
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SUMMARY: Different methods available
for the detection of bovine leukaemia virus (BLV)
infection were evaluated. The methods evaluated were AGID in
serum, ELISA in serum and milk, and PCR in blood lymphocytes. The
AGID test identified a
smaller number of positive animals (75/126) compared to PCR and
ELISA tests (100/126). Three positive animals by AGID were
negative by PCR and 28 of the 51 negative samples by AGID were
positive by PCR. The sensitivity of PCR with respect to AGID was
96%, whereas the specificity was 45% (kappa 0.45). All
positive animals by AGID were also positive by ELISA in serum and
milk samples, whereas 25 negative animals by AGID were considered
positive by the ELISA test, in both biological samples. Thus,
sensitivity of the ELISA with respect to AGID was 100%, whereas
specificity was 51% (kappa 0.55). The smaller
sensitivity of AGID is not due to false positive reactions of
ELISA and PCR tests, but rather to a greater sensitivity of
these, which suggests a revision of AGID in those countries in
which it is still used as the official method in the erradication
programs of leukaemia.
Key words: cattle, leukaemia, ELISA,
PCR.
RESUMEN: Se evaluaron distintos métodos
actualmente disponibles para el diagnóstico de la infección por el
virus de la leucosis bovina (VLB). Los métodos empleados
fueron AGID en suero, ELISA en muestras de suero y leche y PCR en
linfocitos sanguíneos. De un total de 126 animales
analizados, AGID identificó un menor número de
animales positivos (75) comparado con las pruebas PCR y
ELISA aplicadas en muestras de suero y leche (100). Tres animales
positivos a AGID fueron negativos a PCR y 28 de las 51 muestras
negativas a AGID fueron positivas mediante PCR. La sensibilidad
diagnóstica de PCR con respecto a AGID fue de 96%,
mientras que la especificidad fue de 45% (kappa 0,45).
Todos los animales positivos a AGID fueron también
positivos a ELISA aplicado tanto en suero como en leche, mientras
que 25 animales negativos a AGID fueron consignados como
positivos a ELISA, en ambas muestras biológicas. De esta
forma, la sensibilidad diagnóstica de ELISA respecto a
AGID fue de un 100%, mientras que la especificidad fue de 51%
(kappa 0,55). La menor sensibilidad observada de AGID no
es debido a reacciones falso positivas de ELISA y PCR, sino
más bien a una mayor sensibilidad de estas últimas,
lo que sugiere reconsiderar la utilización del método
AGID en aquellos países en que aún se utiliza como
método oficial en los programas de
erradicación de leucosis.
Palabras clave: ganado, leucosis, ELISA,
PCR.
INTRODUCCIÓN
La leucosis enzoótica bovina es una enfermedad
infecciosa del ganado, causada por el virus de la leucosis bovina
(VLB), un retrovirus de la familia
Retroviridae (Van Regenmortel y col 2000). El VLB
infecta principalmente a los linfocitos B (Ballagi-Pordani y col
1992), pero también posee la capacidad de infectar otras
células, tales como linfocitos T (Stott y
col 1991, Schwartz y col 1994) y monocitos (Domenech y col 2000).
Una de las características de esta enfermedad es una
respuesta humoral que dura toda la vida del animal (Burny y col
1988). La enfermedad se manifiesta con curso clínico
lento, desarrollando un período de incubación de 1
a 5 años, por lo que afecta fundamentalmente a los
animales mayores de 2 años de edad (Johnson y col 1985).
El ganado infectado puede permanecer clínicamente
asintomático durante toda su vida. Sin embargo, solo un
30-70% desarrolla linfocitosis persistente (LP), la que se
caracteriza por una expansión policlonal de linfocitos B
infectados. A su vez, un porcentaje incluso menor de animales
(0,1-10%) eventualmente desarrolla tumores linfoides, que es la
forma clínica fatal de esta enfermedad (Burny y col
1985).
La infección por VLB estimula una fuerte
reacción inmune humoral en contra de las principales
proteínas virales gp51 y p24 que
constituyen la base para la detección mediante pruebas
serológicas (Portetelle y col 1989). Dentro de
éstas, la inmunodifusión en gel de agar (AGID) ha
sido la prueba oficial en muchos países para la
detección de anticuerpos contra VLB. Recientemente, se ha
desarrollado y evaluado una serie de métodos
enzimoinmunoensayos (ELISA), algunos de los cuales son
actualmente reconocidos como métodos oficiales en EE.UU.,
Canadá y otros países (Simard y col 2000). Sin
embargo, independiente del método serológico
empleado, la principal desventaja de estas pruebas es su
incapacidad para discriminar anticuerpos maternales pasivos de
una infección activa, los que pueden persistir durante los
primeros 6 meses de vida del animal (Burridge y col 1982).
Además, estos métodos no proporcionan evidencia de
la infección en su etapa temprana, esto es, antes de la
seroconversión, que para esta enfermedad en particular
puede tardar hasta 14 semanas en presentarse (Dinter 1989). En
cambio, las
pruebas de detección directa, como la reacción de
la polimerasa en cadena (PCR), permiten un diagnóstico
confiable en las etapas iniciales de la enfermedad y se pueden
aplicar a la detección del virus en animales menores de 6
meses, evitando así reacciones falso positivas, causadas
por la transferencia pasiva de inmunoglobulinas a través
del calostro. Otra ventaja radica en la capacidad para detectar
el virus en animales inmunotolerantes, los que no desarrollan una
respuesta inmune normal (Fechner y col 1996).
Aunque con algunas discrepancias, diversos autores han
demostrado una menor sensibilidad de AGID respecto de las pruebas
diagnósticas ELISA y PCR (Eaves y col 1994, Fechner y col
1996, Trono y col 2001). Dado que diversos factores pueden
afectar la concordancia entre estas pruebas, como la secuencia
elegida como blanco para la amplificación y el
método para purificar ADN en la PCR, el
antígeno utilizado en los métodos
serológicos o las características de la población animal en estudio, entre otros;
el objetivo de
este estudio fue comparar el método AGID que se utiliza en
Chile frente a un ELISA indirecto comercial en muestras de suero
y leche, y una prueba PCR anidado en linfocitos sanguíneos
para la detección de la infección por el
VLB.
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